1 引言(Introduction)

美国环保署提出的一份关于首要污染物的报告中列举了10种有毒重金属离子, 其中就包括铜和锌(Shipley et al., 2013).铜、锌矿产资源的广泛开发及其大量使用产生了一系列严重的环境问题, 同时, 碱性锌锰电池也逐步取代了汞电池从而用量越来越大, 这些电池如不被及时处理也将会导致环境污染.有关铜的危害性早已被证明(Kazemipour et al., 2008), 由于其非生物降解性和持续性, 可通过食物链在环境中积累, 最终会给人类健康带来很严重的危害(Hadi et al., 2013), 因此, 它们在环境中的浓度被严格地控制在一定的范围内以符合相关的环境法规(Abdolali et al., 2015).

传统去除金属离子的方法大多数具有成本高、易产生二次污染等不足.研究发现, 当金属离子浓度在1~100 mg·L^-1时物理法对对金属离子的去除效率很低(Gupta et al., 2008; Lodeiro et al., 2006).一些废弃生物材料如海藻、花生壳、木屑和甘蔗等在吸附方面的用途都已被研究(De Luna et al., 2015; Gwenzi et al., 2014), 尽管这些吸附材料具有很好的吸附效果, 但都需要经高温处理后才能发挥作用, 从而导致高能耗.而生物吸附由于具有高效性和低能耗的优势从而引起广大研究人员的极大兴趣(Feng et al., 2013).

研究表明, 胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)对废水中的金属离子具有很好的吸附性能(Moon et al., 2006; Zhang et al., 2008; 胡学伟等, 2014).Liu等(2001)提取了4种不同细菌的胞外聚合物吸附重金属, 结果表明, 其对同一种金属离子的最大吸附量分别比树脂高83.8%、92.5%、96.3%和64.8%.因此, 有关胞外聚合物的研究已迅速成为一个热点(Guo, 2015).EPS上含有丰富的官能团(如羧基、氨基、羟基和羰基等), 可以和水中的金属元素(如铜、铅、锌等)进行络合、鳌合, 能够捕捉和吸附水中的重金属(杨敏等, 2011).本实验室前期针对在微生物降解中应用非常广泛的浮选药剂(如苯胺黑药)进行了大量研究, 但关注点仅限于铅、锌、铜矿选矿废水中的有机药剂, 而实际上, 选矿废水中的金属离子特别是Cu²⁺、Zn²⁺和Pb²⁺也不能忽略.虽然人们对EPS吸附重金属进行了广泛的研究, 但在综合考虑选矿废水中的有机药剂和重金属方面, 特别是本实验室分离出的苯胺黑药降解菌(Bacillus vallismortis)吸附重金属方面的研究还远不够充分.因此, 本文以提取自Bacillus vallismortis的EPS作为一种生物吸附剂, 去除单一体系的Cu²⁺、Zn²⁺, 研究吸附过程中的影响因子, 探讨吸附等温线和动力学模型, 并采用FTIR进行分析.以期为选矿废水中有机药剂和重金属的同时去除提供理论基础, 并为制备一种同时去除选矿废水中有机药剂和重金属的生物制剂提供参考.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试菌株

苯胺黑药高效降解菌从广州市沥滘污水处理厂沉淀池回流污泥中选育, 于2014年由实验室分离纯化获得, 将这种细菌驯化后制成20 g·L^-1的菌悬液保存在4 ℃冰箱中备用.由图 1可知, 固定脱水处理较好地保持了苯胺黑药降解菌的形态, 呈短棒状结构, 平均粒径约为649.7 nm, 长度约为1.67 μm.经16S rRNA测序, 确定该降解菌为死亡谷枯草芽孢杆菌Bacillus vallismortis(宋卫锋等, 2012), 对苯胺黑药有优异的降解性能.

2.2 培养基

无机盐培养基：1.6 g磷酸二氢钾, 0.4 g磷酸氢二钾, 0.06 g硫酸镁, 0.001 g氯化钙, 1.0 g氯化铵溶, 1 L蒸馏水.

富集培养基：1.25 g牛肉膏, 2.5 g蛋白胨, 1.25 g氯化钠, 250 mL蒸馏水.

2.3 胞外聚合物的提取与测定

胞外聚合物采用高速离心法(12000 r·min^-1冷冻离心15 min, 2次离心后再用0.45 μm滤膜过滤)(D′Abzac et al., 2010; Adav et al., 2008)、热提法(80 ℃水浴加热2 h, 16800 r·min^-1离心15 min, 上清液用滤膜过滤)(Comte et al., 2006)、超声波法(40 kHz、50 W进行超声处理)(D′Abzac et al., 2010)3种方法提取, 提取的EPS于-18 ℃下保存, 备用.

EPS的化学成分比较复杂, 但其中的多糖和蛋白质含量达到70%~80%, 因此, 上述EPS的提取量以多糖和蛋白质之和来表征.其中, 多糖含量采用蒽酮比色法测定, 蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法测定(刘美等, 2007), 所有实验结果均为3次平行试验的平均值.

2.4 Cu²⁺、Zn²⁺吸附试验

取一定体积的金属离子浓度为10 mg·L^-1的硫酸盐(分析纯)溶液, 按照EPS质量与金属离子质量比为2:1的比例, 在Cu²⁺、Zn²⁺溶液中加入EPS；然后分别改变pH、温度、离子浓度和吸附时间, 于150 r·min^-1下振荡3 h后放入经过预处理的透析袋中, 在装有100 mL蒸馏水的烧杯中透析12 h, 用火焰原子吸收分光光度计测量烧杯水溶液的Cu²⁺、Zn²⁺浓度.用相同体积的水代替EPS, 其他条件不变, 作为空白实验.

废水中Cu²⁺、Zn²⁺浓度采用火焰原子吸收分光光度计测定(日立22000型, 检出限0.001 mg·L^-1, 日本日立仪器有限公司), pH用PHS-3C型pH计测定.去除率和吸附量计算公式如下：

(1)

(2)

式中, r为金属离子去除率；Q为单位EPS吸附量(mg·mg^-1)；C₀为金属离子初始浓度(mg·L^-1)；V₀为吸附前溶液体积(mL)；C_t为某时刻金属离子浓度(mg·L^-1)；V_t为某时刻溶液体积(mL)；m为EPS质量(mg).

2.5 吸附等温模型

EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附可以用吸附等温式表示, 在30 ℃、pH=6.5±0.1、EPS质量与金属离子质量比为2:1的条件下, 将EPS分别加入初始浓度为5、10、15、20、25、30、40 mg·L^-1的Cu²⁺、Zn²⁺溶液中, 吸附平衡后分析金属离子浓度.通常情况下, 吸附剂的吸附量取决于吸附金属离子的平衡浓度, 常用的吸附等温方程为Freundlich吸附等温方程(3)和Langmuir吸附等温方程(4).

(3)

(4)

式中, Q_e为吸附平衡时单位EPS的吸附量(mg·mg^-1)；Q_m为单位EPS的最大吸附量(mg·mg^-1)；k、n、b为常数(一般认为0.1 < 1/n < 0.5时易于吸附, 1/n > 2时则难以吸附)；其余符号含义同前.

2.6 吸附热力学研究

为了描述EPS吸附Cu²⁺、Zn²⁺的热力学行为, 选择20、30、40 ℃时测得的吸附量计算吸附热力学参数, Gibbs自由能变(ΔG)、焓变(ΔH)及熵变(ΔS)可通过方程(5)~(7)计算.

(5)

(6)

(7)

式中, K为平衡常数(L·g^-1)；R为摩尔气体常数(8.314 J·mol^-1·K^-1)；T为温度(K)；C_e为吸附平衡时金属离子浓度(mg·L^-1), 其余符合含义同前.焓变ΔH、熵变ΔS可由ΔG-T线性图的斜率和截距求得.

2.7 红外光谱分析

取一定量95%乙醇于-18 ℃下保存2 h, 将EPS原样或吸附了金属离子的EPS与冰乙醇按1:5的比例混合, 继续放置在-18 ℃的条件下约12 h直至出现沉淀, 取沉淀物进行冷冻干燥；然后将冻干的EPS原样或吸附了金属离子的EPS样品与KBr按照质量比为1:150混合, 在玛瑙研钵中研磨, 然后将适量的粉末放入压片机中, 进行压片, 制备样品, 采用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet380, 美国THERMO Fisher Scientific)在波数4000~400 cm^-1范围内对样品进行分析.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 三种提取方法的效果对比

按2.3节所述方法对Bacillus vallismortis进行EPS提取, 3种提取方法的效果对比见图 2.由图 2可知, 菌悬液浓度为20 g·L^-1时, 热提法的提取效率最高, 提取的EPS浓度为71.659 mg·L^-1, 其中, 多糖占86.4%, 蛋白质占13.6%；离心法和超声波法提取的EPS浓度相对较低, 分别为5.675 mg·L^-1和41.303 mg·L^-1, 说明该降解菌比较适合热提法提取.因此, 后续实验采用热提法提取EPS, 将其稀释1倍后使用, 浓度为35.83 mg·L^-1.

3.2 pH对EPS去除Cu²⁺、Zn²⁺的影响

pH是影响胞外聚合物吸附重金属的重要因素, 对胞外聚合物表面的官能团(-COOH、-NH₂、NH、-SH、-OH)活性有显著影响(Guibaud et al., 2009).由图 3可知, 当pH=7时, EPS对Cu²⁺去除率达到最高值96%, 吸附量为0.643 mg·mg^-1；当pH=8时, EPS对Zn²⁺的去除率达到最高值79.1%, 吸附量为0.527mg·mg^-1；当pH=3时, Cu²⁺和Zn²⁺的去除率最低, 分别只有38%和20.9%, 吸附量也分别只有0.251和0.139 mg·mg^-1.这是因为在低pH条件下, 溶液中大量的H⁺与金属离子竞争EPS表面的吸附位点, EPS表面的排斥力增强, 使金属离子难以和EPS表面的带电基团接触, 不利于吸附的进行；当pH逐渐升高时, 去除率随之升高, 吸附量也随之增大.这是因为EPS表面去质子化且呈负电性, 提供了更多的结合位点, Cu²⁺和Zn²⁺与EPS迅速接触, Cu²⁺和Zn²⁺去除率上升, 吸附量也随之升高；当pH值过高时, 去除率迅速降低, 溶液呈碱性, OH^-和金属离子结合生成沉淀析出(Comte et al., 2006), 此时金属离子的去除就不仅仅是EPS的吸附作用了；当pH=9时, EPS对Cu²⁺和Zn²⁺去除率分别降至31%和61.8%, 吸附量也分别只有0.207和0.412 mg·mg^-1.上述结果说明, 溶液pH会严重影响EPS对重金属离子的吸附, pH过高或过低, 去除率都会明显下降, 这与其他研究者用细菌EPS吸附重金属试验结果吻合(Pérez et al., 2008; Bhaskar et al., 2006).在后续试验中为了排除pH过高产生沉淀的干扰, 选择最佳pH为6.5±0.1.

3.3 温度对EPS吸附Cu²⁺、Zn²⁺的影响

不同温度下EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的去除率和吸附量如图 4所示.由图 4可知, 随着温度的逐渐上升, 溶液中粒子布朗运动加快, Cu²⁺、Zn²⁺与EPS接触的几率也随之升高, 在试验范围内, EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的去除率和吸附量逐渐升高.Cu²⁺去除率由20 ℃时的89.7%升高到40 ℃时的91.9%, 吸附量也由0.5978 mg·mg^-1升高到0.6127 mg·mg^-1；Zn²⁺去除率由20 ℃时的45.8%升高到40 ℃时的51.8%, 吸附量也由0.3053 mg·mg^-1升高到0.3453 mg·mg^-1.当温度继续升高至50 ℃, EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的去除率和吸附量都开始下降, 可能是因为EPS受到温度影响, 其中的蛋白质组分由于温度升高活性下降.当温度升到60 ℃时, Cu²⁺的去除率和吸附量都略有升高, 而Zn²⁺的去除率和吸附量都降至最低的42.6%和0.284 mg·mg^-1.整体过程中温度对EPS吸附金属离子的影响表现得不是很明显.

3.4 吸附动力学研究 3.4.1 时间对吸附效率的影响

在pH=6.5±0.1、温度为常温的条件下, Cu²⁺、Zn²⁺浓度和去除率随吸附时间的变化关系见图 5.由图 5可知, 吸附时间也是影响EPS吸附Cu²⁺、Zn²⁺的重要因素, 吸附属于动态的过程, 前3 min内, Cu²⁺、Zn²⁺的去除率分别达到了70.1%、28.6%；随着时间的增加, 其去除率不断升高, 8 min时Cu²⁺、Zn²⁺的去除率分别达到最高的90.7%、52.3%；但随后去除率稍有下降, 30 min后, 去除率逐渐回升并呈现出轻微波动；80 min后, EPS对Cu²⁺、Zn²⁺吸附基本达到平衡状态, 表明EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附是一个快速表面吸附过程, 对Cu²⁺的吸附较Zn²⁺更为明显.整个吸附过程都大致可以分为3个阶段：快速吸附-慢速吸附-吸附平衡.在生物体吸附重金属的研究中这3个阶段的吸附已经被广泛报道(Saǧ et al., 1996; Sarı et al., 2009), 胞外聚合物同Cu²⁺和Zn²⁺吸附主要通过络合、鳌合、离子交换等作用进行, 官能团通过这种方式同重金属结合不需要耗费大量的能量, 因此, 反应进行的很快, 均能很快能达到吸附平衡.

3.4.2 吸附动力学参数

为研究吸附过程的控速步骤和吸附机理, 分别采用拟一级动力学模型(8)和拟二级动力学模型(9)来拟合动力学数据.

(8)

(9)

式中, k₁为拟一级反应速率常数(min^-1)；t为吸附时间(min)；k₂为拟二级反应速率常数(g·mg^-1·min^-1)；其余符号含义同前；k₁和Q_e可以根据1/Q~1/t拟合曲线的斜率与截距得到；k₂和Q_e可以根据t/Q~t拟合曲线的斜率与截距得到.

由表 1可知, EPS吸附Cu²⁺、Zn²⁺的拟一级反应模型的R²分别为0.9374和0.7942, 而采用拟二级反应模型能较好地拟合动力学数据, 吸附Cu²⁺、Zn²⁺的R²分别为0.9897和0.9998.EPS对Cu²⁺、Zn²⁺吸附大致分为3个阶段, 第一阶段为0~8 min的拟二级动力学吸附阶段, 第二阶段为8~120 min的波动吸附阶段, 第三阶段为120 min后的吸附平衡阶段.

3.5 吸附热力学研究 3.5.1 金属离子初始浓度对吸附效率的影响

在pH=6.5±0.1、温度为常温条件下, 改变金属离子初始浓度后去除率和吸附量的变化情况见图 6.由图 6可知, 随着初始金属离子浓度的增加吸附量也随之增大, 且Cu²⁺比Zn²⁺表现得更明显.

在决定吸附效率方面, 平衡吸附是很重要的.关于单一系统中EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附数据常用Freundlich吸附等温方程和Langmuir吸附等温方程来拟合, 拟合曲线如图 7、8所示.

Langmuir模型主要用于研究最大单分子层吸附量, Freundlich模型通常能较好地描述水溶液中的吸附(熊芬等, 2009).表 2结果表明, EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附都能较好地用Freundlich和Langmuir等温吸附方程拟合.等温线的相关参数可通过回归方程计算, 其中, k和n值与吸附剂的吸附量和吸附强度密切相关, k值常用来表征吸附剂对金属离子的亲和力, 吸附Cu²⁺的k值为1.81, 说明EPS对Cu²⁺表现出较强的亲和力, n值都介于1~10之间, 说明Cu²⁺、Zn²⁺在EPS上的吸附是向着有利于吸附的方向进行(Mishra et al., 2009), 对Cu²⁺吸附的R²值分别为0.982和0.976, 对Zn²⁺吸附的R²值分别为0.964和0.992, 这表明在本实验条件下, 吸附Cu²⁺实验值用Freundlich方程拟合效果较好, 吸附Zn²⁺实验值用Langmuir方程拟合效果较好.方程中的最大吸附量Q_m也反映了吸附剂的吸附能力、吸附剂与金属离子结合的稳定性、吸附受溶液金属离子浓度影响程度(郑蕾等, 2008), 以EPS吸附金属离子为单分子层吸附时通过Langmuir方程计算得到Cu²⁺、Zn²⁺最大单分子层吸附量分别为2.155、0.508 mg·mg^-1.

3.5.2 吸附热力学参数

利用公式(6)作ΔG与T之间的曲线, 进行热力学参数求解, 结果见表 3.由表 3可知, 在不同温度(293.15、303.15、313.15K)条件下, 计算得到的ΔG < 0, 温度越高, ΔG越低, 表明温度升高有利于吸附的进行；在温度变化范围内ΔH>0, 表明吸附是吸热过程；ΔS为正值说明到达吸附平衡时体系自由度有所增加, 吸附质和吸附剂之间能量再分配, 吸附质和吸附剂的结构可能发生了改变(Feng et al., 2013; Guo et al., 2014).由热力学参数值推断, 苯胺黑药高效降解菌EPS吸附Cu²⁺、Zn²⁺的反应是一个自发过程, 且属于吸热反应.ΔG随温度变化的幅度非常一致, 变化趋势与其他研究结果类似(Guo, 2015).然而, 表中各参数的绝对值均比上述文献高, 文献中308 K下不同初始Cu²⁺浓度(80~120 mg·L^-1)吸附过程的ΔG为-8.46~-9.38 kJ·mol^-1, ΔH为13.86~46.2 kJ·mol^-1, ΔS为0.074~0.186 kJ·mol^-1·K^-1, 这可能是由于菌种和初始金属离子浓度不同所致.

3.6 吸附金属离子前后EPS红外光谱分析

为明确胞外聚合物中对重金属离子起吸附作用的活性基团, 对吸附重金属离子前后的EPS进行红外光谱(400~4000 cm^-1)分析, 结果如表 4、图 9所示.图 9曲线a中存在着一些蛋白质和多聚糖基团对应的强频段, 它们的谱峰都特别明显.有一些强度较弱的基团表明存在着以酸性或碱性盐存在的羧酸, 而EPS中一些含量很低的组分, 如脂类和核酸, 在红外光谱分析中一般很难检测到, 在指纹区的一些频段表明核酸组成基团之一的磷酸盐的存在.

表 4列出了红外光谱分析中观察到的EPS主要基团, 从表 4和图 9可以看出, 吸附金属离子后, 一些官能团的峰发生了漂移或者消失, 3404 cm^-1处的-OH、氨基发生了漂移, 可以推断O-H键和N-H键参与了金属离子吸附；1552.17 cm^-1处的酰胺Ⅱ的CO伸缩振动谱消失, 说明参与了对金属离子的吸附；1222.44 cm^-1处的CO弯曲振动、-OH伸缩振动消失, 这是典型的羧基阴离子基团通过与金属阳离子共价键络合造成的.通常这种情况下, 大多数羧基阴离子已经结合、络合或鳌合了金属离子(吴谨光, 1994).1642.35 cm^-1处的酰胺I的CO和C-N伸缩振动漂移, 1383.36 cm^-1处的酰胺Ⅲ的C-N伸缩振动、C-N弯曲振动发生漂移, 说明酰胺中的O和N原子对EPS吸附重金属离子贡献很大；1064.80 cm^-1处表征多聚糖的C-O-C伸缩振动的谱峰也发生漂移, 所有的这些变化表明金属离子和EPS表面的带电基团发生了化学反应, 这与其他研究者的结果类似(Yahya et al., 2012).EPS吸附Cu²⁺、Zn²⁺起主要作用的官能团是羟基、氨基、酰胺基团、羧基和C-O-C基团.

图 9中EPS吸附Cu²⁺和吸附Zn²⁺后的谱图相似, 表明EPS对两者的吸附机理类似, EPS中参与吸附Cu²⁺的官能团也都参与了Zn²⁺的吸附.

4 结论(Conclusions)

1) 相对于离心法和超声波法, 苯胺黑药高效降解菌Bacillus vallismortis的胞外聚合物用热提法提取效果最佳, 当菌悬液浓度为20 g·L^-1时, 提取出的胞外聚合物浓度是71.659 mg·L^-1, 其中, 葡萄糖占86.4%, 蛋白质占13.6%.

2) EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附性能良好, 当pH < 7时, 随着pH变大去除率和吸附量都逐渐升高.

3) 本实验中温度对EPS吸附金属离子的影响不明显, 在40 ℃时Cu²⁺、Zn²⁺的去除率和吸附量都达到最大的91.9%、51.8%和0.6127、0.3453 mg·mg^-1.

4) EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附都属于表面快速吸附, 分为快速-慢速-平衡3个阶段, 最佳吸附时间都在8 min左右, 此时Cu²⁺、Zn²⁺的去除率已经达到了最高的90.7%、52.3%.

5) 吸附Cu²⁺的过程中Freundlich方程拟合效果较好, 吸附Zn²⁺的过程中Langmuir方程拟合效果较好, EPS对Cu²⁺的吸附能力、吸附稳定性和亲和力都要大于Zn²⁺, 由Langmuir方程计算的Cu²⁺的最大吸附量为2.155 mg·mg^-1, Zn²⁺最大吸附量为0.508 mg·mg^-1, 吸附Cu²⁺、Zn²⁺的反应属自发进行的反应, 且是吸热反应.

6) EPS对Cu²⁺、Zn²⁺的吸附机理类似, 主要起作用的官能团是羟基、氨基、酰胺基团、羧基和C-O-C基团.