2016, Vol. 36
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硫是植物必需的大量营养元素之一, 主要源于根从土壤中吸收的SO42-.二氧化硫(SO2)作为常见的大气污染物, 可通过叶面气孔进入植物体, 尤其在土壤硫含量不足时, 由气孔进入的SO2可作为植物硫营养的补充.SO2进入植物细胞内溶于水产生SO32-和HSO3-, SO32-可经氧化途径转化为SO42-后储存, SO42-或SO32-经硫还原途径产生半胱氨酸(Cys), Cys是细胞内其他含硫氨基酸、肽和蛋白质的前体.当植株暴露于高浓度SO2后, 组织细胞中活性氧(ROS)水平提高(Li et al., 2012a), 引起植株氧化胁迫.谷胱甘肽(GSH)是植物细胞中普遍存在的抗氧化小分子物质, 具有多种生物学功能, 如维持胞内氧化还原平衡, 清除胞内过多的ROS, 调节相关防御酶活性等(Zechmann, 2014).GSH能通过抗坏血酸(AsA)-GSH循环清除胞内过多的H2O2, 也能直接清除胞内过多的ROS, 保护植物免受氧化损伤(Hasanuzzaman et al., 2010).谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)是细胞中以GSH为底物的重要解毒酶, 参与细胞氧化还原和代谢解毒过程, 在维持胞内氧化还原平衡中具有不可替代的作用, 对植物逆境适应具有重要意义(Haluskova et al., 2009).
植物中一氧化氮(NO)合成有两条主要的酶促途径, 即依赖于精氨酸的一氧化氮合酶(NOS)途径和依赖于NADPH的硝酸还原酶(NR)途径, 其中, NR能够利用NADPH作为电子供体, 催化硝酸盐转变为亚硝酸盐, 产生NO(Lozano et al., 2010).NO作为植物体内重要的内源性分子, 在植物应对干旱、低温、盐等非生物胁迫时, 能清除细胞内O2·-, 激活抗氧化酶(Arasimowicz et al., 2007; Felicitas et al., 2013; Hasanuzzaman et al., 2010).同时, 有研究表明, 拟南芥GSTU24为NO调控的靶基因(Parani et al., 2004).课题组前期的研究发现：拟南芥暴露于SO2后, 细胞内的含硫抗氧化物Cys、GSH含量与GPX、GST活性提高(李利红等, 2010)；NR途径介导NO合成增加并参与SO2暴露期间气孔运动的调节(赵均等, 2014).但NR途径是否与SO2胁迫期间植物的含硫抗氧化物水平有关未见报道.拟南芥NR有两个编码基因NIA1和NIA2, nia1nia2突变体植株的NR活性仅为野生型的0.5%(Wilkinson et al., 1993).因此, 本文利用nia1nia2突变体NR途径缺失的特点, 研究SO2胁迫生理中NR途径对Cys和GSH含量、相关防御酶活性及基因转录的影响, 探讨NR途径在植物抗逆生理中的作用.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料准备取拟南芥(Arabidpsis thaliana L.) Columbia野生型及NR缺失突变体nia1nia2种子(中科院植物研究所张文浩老师惠赠), 播种于营养土中.4 ℃春化2 d后置于培养间, 光照度≥3000 lx, 光/暗周期为16 h/8 h, 培养温度22 ℃, 相对湿度约60%.
2.2 SO2熏气处理取4周龄拟南芥植株, 设SO2熏气组和对照组, 分别置于体积0.45 m3的密闭箱内, 适应1 d后采用静态熏气方式进行SO2暴露.根据K2S2O5+2HCl→2KCl+H2O+2SO2的原理, 定量产生SO2气体, 同时采用甲醛吸收副玫瑰苯胺分光光度法测定SO2浓度, 使箱内浓度保持在30 mg·m-3.每天熏气16 h, 熏气期间保持光照度(Li et al., 2012a).取同期熏气组和对照组拟南芥叶片用于生理指标检测和RT-PCR分析.
2.3 Cys、GSH含量与GPX、GST活性的测定Cys含量测定采用Gaitonde(1967)的方法, 还原型GSH含量测定参照Anderson(1985)的方法, GPX活性测定采用Wendel(1981)的方法, GST活性测定采用Habig等(1974)的CDNB比色法.计算3个重复实验组的平均值和标准误, F检验后, 采用Duncan方法进行多重比较, 分析不同处理组与对照组之间的差异显著性.图中用相同字母表示差异不显著, 不同字母表示差异显著(p < 0.05).
2.4 RT-PCR分析RNA提取采用Trizol法.以总RNA为模板, 用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物技术有限公司)反转录合成cDNA, 采用特异性引物扩增目标基因序列.谷胱甘肽硫转移酶GSTU24基因的引物序列为5′-TGAGGACAA GAATTGCTCTGGC-3′和5′-TGACCTTCTCTGACTCA GGCAG-3′(Zhao et al., 2014).谷胱甘肽过氧化物酶GPX7基因的引物序列为5′-TTCGCTGCAAATC CGTCTCC-3′和5′-ACGTTAACGATCAACAAAGG-3′ (Li et al., 2012b).Actin2为内参基因, 引物序列为5′-TTCCTCATGCCATCCTCCGTCTT-3′和5′-CAGCG ATACCTGAGAACATAGTGG-3′.
RT-PCR体系20 μL包括：1~1.2 μL cDNA、2 μL dNTP混合物(2.5 mmol·L-1)、0.3 μL TransTaq HiFi DNA Polymerase、2.5 μL 10× BufferⅡ、正反向引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL.GSTU24基因PCR条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min(30个循环)；72 ℃延伸10 min.GPX7基因PCR条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min, 62 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min(30个循环)；72 ℃延伸10 min.PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.
3 结果(Results) 3.1 SO2熏气对拟南芥Cys和GSH含量的影响拟南芥野生型和突变体nia1nia2植株中Cys含量(以鲜重计)在非熏气组(对照组)间无明显差异, 在SO2暴露后均快速增加, 暴露6 h后显著高于非熏气组并在熏气期间维持较高水平(图 1), 其中, 野生型Cys含量增幅为340%~800%, 突变体Cys含量增幅为310%~430%, SO2暴露组野生型拟南芥Cys含量的增幅普遍略高于突变体.
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| 图 1 SO2熏气对拟南芥叶片Cys和GSH含量的影响 Fig. 1 Effect of SO2 fumigation on the contents of Cys and GSH in Arabidopsis leaves |
非熏气组拟南芥植株中GSH含量(以鲜重计)野生型略高于突变体, SO2暴露后GSH含量显著增加, 达到峰值后回落.SO2暴露组野生型GSH含量在熏气24 h时最高, 增幅为68%, 突变体GSH含量在熏气48 h时最高, 增幅为25%.熏气6~48 h期间野生型GSH含量增幅明显高于突变体(图 1).
上述结果说明, NR途径与植株GSH合成有关, NR途径参与了SO2暴露下Cys和GSH的合成增强过程.
3.2 SO2熏气对拟南芥GPX和GST活性的影响非熏气组拟南芥植株中GPX和GST的活性(均以protein计)野生型高于突变体, SO2暴露后野生型和突变体拟南芥中GPX和GST活性均迅速升高, 野生型GPX活性增幅为72%~200%, GST活性增幅为44%~94%；突变体GPX活性增幅为40%~120%, GST活性增幅为11%~48%, 野生型中酶活性增幅明显高于突变体(图 2).
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| 图 2 SO2熏气对拟南芥叶片GPX和GST活性的影响 Fig. 2 Effect of SO2 fumigation on GPX and GST activities in Arabidopsis leaves |
此外, SO2暴露组野生型拟南芥中GPX和GST活性提升速度快于突变体, 如GPX活性在SO2暴露24 h达到峰值, 而突变体GPX活性在48 h达到峰值.
上述结果说明, NR途径与植物细胞内的氧化还原酶GPX和重要解毒酶GST活性有直接关系, NR途径参与逆境生理中植物的氧化还原反应与细胞解毒过程.
3.3 SO2熏气对拟南芥GSTU24和GPX7基因转录水平的影响前期我们通过Affymetrix全基因组芯片检测野生型拟南芥SO2熏气72 h后基因表达谱特征, 发现拟南芥GST家族中最大的亚家族GSTU中GSTU1、GSTU3、GSUT4、GSTU24在SO2熏气组表达上调, R值分别为1.5、2.9、1.1和1.1(Li et al., 2012a)；GPX2、GPX7在SO2熏气组表达上调, GPX7上调表达较为明显(Li et al., 2012b).因此, 本文选择GSTU24和GPX7基因, 检测SO2熏气6 h后基因表达的变化, 同时分析NO对基因GSTU24和GPX7的调控作用.
RT-PCR检测熏气6 h拟南芥GST和GPX编码基因的表达水平发现, 对照组野生型和突变体中GSTU24基因的转录水平明显不同, SO2暴露组野生型拟南芥中GSTU24上调表达, 但突变体中熏气组与对照组间无明显差异(图 3)；对照组野生型和突变体间GPX7转录水平亦存在差异, SO2暴露组野生型和突变体中GPX7转录上调.研究结果表明, 拟南芥NR缺失突变体与野生型植株中GST和GPX编码基因的表达水平不同, 对SO2的响应过程亦不同.
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| 图 3 SO2熏气6 h拟南芥基因的差异表达 Fig. 3 Different gene expression in Arabidopsis after SO2 fumigation 6 hours |
环境中高浓度的SO2能引起植物的多种响应, 如抗氧化能力增强、抗氧化和防御相关基因表达上调等(Zhao et al., 2014; 李利红等, 2010).NR途径作为植物体合成NO的一种主要途径, 在植物应对生物和非生物胁迫中有重要作用(Clarke et al., 2000; Zhao et al., 2009).本研究发现, 拟南芥植株体内NR途径与SO2暴露期间植株体内含硫抗氧化物水平和基因转录调节有关, 说明NR途径参与了植物适应大气高浓度SO2的过程.
拟南芥植株暴露于较高浓度SO2时, 细胞内硫同化作用的底物增加, 植株硫同化作用增强, 促使Cys合成加速, GSH水平升高(李利红等, 2010), 本文发现NR突变体与野生型拟南芥对SO2具有相似的反应.GSH作为植物胞内普遍存在的小分子抗氧化物质, 一方面, 能作为GST和GPX的底物, 提高酶的反应效率；另一方面, 可通过AsA-GSH循环, 将H2O2还原成H2O, 降低氧化损伤.本研究发现, GSH含量在SO2暴露组野生型和突变体中均升高, 但野生型增幅显著高于突变体；因SO2暴露期间氧化还原反应消耗还原型GSH产生氧化型谷胱甘肽(GSSG), 导致GSH含量下降；野生型植株中高活性的GPX和GST, 促使酶作用底物GSH的消耗增多, 使野生型植株中GSH含量降幅高于突变体, 野生型与突变体内GSH含量差异缩小.
GPX和GST是植物细胞内重要的防御和解毒酶, GST能催化GSH与胞内亲电子有毒物质结合从而脱毒, GPX利用GSH将脂质过氧化物和H2O2还原成相应的醇和H2O, 缓解逆境对植物造成的损伤(Marshall et al., 2012).文中非熏气组野生型拟南芥GPX和GST活性均高于突变体, SO2暴露组野生型植株中GPX和GST活性增幅显著高于突变体, 即NR功能的缺失影响了逆境应答过程中AsA-GSH循环与相关抗氧化代谢和GST解毒过程, 说明植物NR途径能影响拟南芥植株正常生理下含硫抗氧化酶的活性, 以及SO2胁迫下植株的氧化还原反应和细胞解毒过程.
NR途径是植物细胞内NO合成的重要途径, 为验证NO的调节作用, 我们用NO供体硝普钠(SNP)喷淋NR突变体植株后检测发现, SNP可以提高NR突变体中GSH含量和GST活性, 且SO2熏气组增幅大于非熏气对照组, 说明由NR途径产生的NO参与调节植物细胞中的含硫抗氧化物水平, NO可促进SO2暴露组植株GSH水平和GST活性的提高(另文发表).由此认为, NR途径介导的NO合成参与调节了拟南芥植株SO2暴露期间氧化还原过程和代谢解毒过程.本结果不仅证实了逆境生理中NO介导的抗氧化能力提升, 与前人的研究结果一致(Boogar et al., 2014; Gill et al., 2013; Shi et al., 2014), 还为NO参与调节胞内含硫抗氧化物水平提供了直接证据.
植物应答环境胁迫的一个重要途径是基因转录改变, 课题组前期研究发现, SO2熏气72 h后野生型拟南芥中TRXh8、GSTU3、GSTU24、GPX7基因上调表达(李利红等, 2010；李利红, 2012；Zhao et al., 2014).本文检测SO2熏气6 h后野生型和突变体拟南芥组织中GSTU24和GPX7基因的转录水平, 进一步证实了SO2胁迫期间含硫抗氧化酶编码基因的差异转录, 并发现了由于NR基因功能缺失, 突变体与野生型中基因表达模式的不同, 为NR参与拟南芥含硫抗氧化酶编码基因的转录调节提供了依据.虽然因拟南芥中GST和GPX编码基因众多, 所检测的基因转录水平与酶活性变化趋势难以一一对应, 但文中结果清晰地表明, 拟南芥NR途径直接参与调控拟南芥植株含硫抗氧化酶编码基因的转录, 进而增强植株的逆境适应性.
5 结论(Conclusions)野生型拟南芥植株体内含硫抗氧化酶GST和GPX活性高于突变体, 一定浓度的SO2暴露后, 野生型与突变体植株体内Cys和GSH水平及GST和GPX活性提高, 且野生型中增幅高于突变体, 拟南芥GST和GPX编码基因GSTU24和GPX7在野生型和突变体中差异表达并对SO2响应程度不同, 表明NR途径参与了逆境生理中植物基因转录的调节, 通过提高含硫抗氧化物水平增强组织抗氧化能力, 缓解胁迫对拟南芥植株造成的损伤, 从而增强拟南芥植株对SO2胁迫的适应性.
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