2015, Vol. 35
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2. 沈阳农业大学土地与环境学院土肥资源高效利用国家工程实验室, 沈阳 110866
2. National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866
漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶类，是重要的木质素纤维降解酶之一，最初被发现于漆树漆液中，随后发现某些高等真菌也能分泌该酶(Bertr and et al., 2002).由于漆酶广泛的底物专一性，因此，其具备许多重要的生物学功能：在高等植物中具有降解木质部的功能；在大型真菌中与色素和子实体的形成及木质素的降解和分生孢子的致病性有关(王国栋等，2003).染料废水是含有染料的有色废水，具有组成复杂、色度高、生物难降解等特点，已经成为危害水环境的主要污染源(冯凯等，2009).漆酶可以对染料(如活性蓝19、RB亮蓝等)进行有效的脱色，因此，得到越来越多的关注和研究(Wesenberg et al., 2003；Couto et al., 2006；Mayer et al., 2002；Schliephake et al., 2000；Fu et al., 2001).根据染料结构可将染料分为蒽醌类染料、偶氮类染料、靛蓝类染料和三苯甲烷类染料等.蒽醌类染料可以作为漆酶的底物被直接氧化，但有时也需要介体系统才能进行有效脱色(Abadulla et al., 2000；Mechichi et al., 2006；康从宝等，2002；侯红漫等，2004).大多数偶氮类染料不能作为漆酶的直接底物，在漆酶/介体系统中，漆酶借助自由基反应形成酚类化合物，无需破坏偶氮键，因此，避免了形成有毒的芳香胺，更有利于控制环境污染，提高脱色效率(Bourbonnais et al., 1997；Srebotnik et al., 2000).靛蓝类染料是芳香族的还原性染料，因此，具有稳定的共轭结构，生物降解性较差，利用HBT、HOBT等介体系统也可以很好地完成脱色(Wong et al., 1999；Zhang et al., 2006；刘晓波等，2008).部分三苯甲烷类染料可以在漆酶单独作用下进行脱色，但脱色时间比较长，加入介体后可以明显提高脱色效率(Ferreira-Leitão et al., 2007；Camarero et al., 2005；Xu，1996；Nyanhongo et al., 2002).由于介体价格昂贵，因此，寻找无介体的漆酶催化染料脱色体系，或寻找新型廉价介体可以有效地降低染料废水的处理成本(姬广磊，2009).
本课题组前期研究发现，一株出芽短梗霉白化突变株Aureobasidium pullulans UVMU3-1胞外液具有常温(30 ℃，28.5 6 U · L-1)和高温漆酶活性(75 ℃，36.5 U · L-1)，产酶能力优于出发菌株A. pullulans NG(靳建忠等，2011；王慧娟等，2011).本研究对出芽短梗霉无色素突变株Aureobasidium pullulans UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质培养基进行优化，并研究其分子量大小、热稳定性及对三苯甲烷类染料孔雀石绿和结晶紫的脱色作用，为该具有漆酶活性的物质的工业化生产和应用奠定理论基础.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 供试菌株出芽短梗霉A.pullulans UVMU3-1为本课题组诱变获得的白化突变株.
2.1.2 主要试剂50 mmol · L-1 愈创木酚(2-甲氧基苯酚)溶液，pH=2.4 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH=8.0 Tris-HCl缓冲液，染料孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV)为实验室分析纯；其它试剂药品也均为实验室分析纯.
2.1.3 培养基固体培养基(PDA)：去皮土豆200 g · L-1、葡萄糖20.0 g · L-1、琼脂20.0 g · L-1，pH自然；基础产酶培养基(YND)：葡萄糖20.0 g · L-1、NaNO3 6.40 g · L-1、MgSO4 · 7H2O 0.50 g · L-1、酵母浸出粉0.20 g · L-1、KH2PO4 1 g · L-1，pH=6.0；优化产酶培养基：蔗糖 66.5 g · L-1、NaNO3 32 g · L-1、NaCl 1.08 g · L-1、酵母浸粉 0.2 g · L-1、KH2PO4 1 g · L-1，pH=6.0.
2.2 方法 2.2.1 摇瓶培养挑取活化后的单菌落接种至50 mL液体YND培养基上，置于28 ℃、180 r · min-1摇床上振荡培养2 d作种子液，将种子液(OD560=5.0)按1 ∶ 100接种量接种于装有50 mL YND液体培养基的250 mL摇瓶中，于28 ℃、180 r · min-1水浴振荡培养，7 d后收获发酵液.
2.2.2 漆酶活性测定将于28 ℃、180 r · min-1振荡培养后的发酵菌液于4 ℃、10000 r · min-1下离心15 min，弃去沉淀所得上清液即为粗酶液.将500 μL的粗酶液和3 mL pH=2.4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合，于75 ℃(30 ℃)保温10 min，然后加入500 μL 50 mmol · L-1愈创木酚启动反应.反应5 min后，用分光光度计测定在λ=465 nm处吸光值A465，每个处理做3个重复.用500 μL蒸馏水代替粗酶液作为空白对照.
酶活力的定义为：每分钟氧化1 μmol愈创木酚所需要的酶量即为1个活力单位(U).酶活性计算公式为：U= 106 /ε × V总 /V酶 × A465 /t ，其中，V总和V酶 分别代表漆酶酶活测定反应体系的总体积及反应添加的酶液体积(mL)；ε为摩尔吸光系数(L · mol-1 · cm-1).愈创木酚摩尔消光系数ε465=1.21×104 L · mol-1 · cm-1，则酶活U=132.23×A465.
2.2.3 单因素试验碳源：在YND基础产酶培养基中以浓度为20 g · L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘露醇和体积比2%的甘油作为碳源，28 ℃、180 r · min-1恒温培养6 d，取粗酶液测定酶活.
氮源：在YND基础产酶培养基中分别添加N元素终浓度为75.29 mmol · L-1的NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨为氮源，在28 ℃、180 r · min-1下恒温培养6 d，取粗酶液测定酶活.
无机盐：基础产酶培养基中分别添加NaCl、KCl、CaCl2、K2SO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4 · H2O、ZnCl2、MgSO4 · 7H2O、Fe2(SO4)3，28 ℃、180 r · min-1恒温培养6 d，取粗酶液测定酶活.
起始pH：调节基础产酶培养基的起始pH值，28 ℃、180 r · min-1下恒温培养6 d，取粗酶液测定酶活.
2.2.4 正交试验根据基础产酶培养基单因素试验结果，设计四因素、三水平、9组试验对YND基础产酶培养基进行优化(表 1).
| 表1 四因素三水平正交表 Table 1 Four factors and three levels orthogonal table |
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以酶活单位U · L-1代表酶浓度，分别加入酶液终浓度为4.5、6、7.5、9、10.5、12 U · L-1的酶液，对终浓度20 mg · L-1的孔雀石绿染料溶液进行脱色，75 ℃水浴条件下反应，以蒸馏水代替孔雀石绿溶液作为空白对照，每隔20 min取一次样，测定孔雀石绿溶液OD618变化，每个处理3个重复，取平均值.
2.2.6 孔雀石绿脱色作用可见分光光度计扫描测定孔雀石绿在618 nm处具有最大吸收峰值，根据OD618值变化计算漆酶对孔雀石绿染料的脱色率.反应体系体积为4 mL，其中包括500 μL 孔雀石绿溶液，然后加入到3 mL pH=2.4的柠檬酸缓冲液中，使染料初始浓度达到20 mg · L-1，再加入500 μL粗酶液，酶液终浓度为7.5 U · L-1，以蒸馏水代替孔雀石绿溶液作为空白对照.两组试验分别测定常温和高温条件下胞外漆酶活性物质对孔雀石绿染料的脱色，常温组在30 ℃条件下反应，高温组在75 ℃水浴条件下反应，每隔5 min取一次样品，测定OD618变化，按公式(1)换算脱色率(D)，每个处理3个重复，取平均值.
结晶紫初始浓度达到20 mg · L-1，测定OD557变化，反应体系和脱色率计算方法同2.2.6节.
2.2.8 UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质耐热性对28 ℃、180 r · min-1摇瓶培养7 d的UVMU3-1胞外粗酶液进行提取，将4 mL粗酶液置于10 mL离心管中，100 ℃沸水浴中分别煮沸15 min和30 min后吸取酶液测定酶活，以原粗酶液酶活作为100%，比较煮沸处理后样品的酶活，算出相对酶活，确定漆酶活性物质热稳定性，每个处理3个重复，取平均值.
2.2.9 UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质分子量确定对28 ℃、180 r · min-1摇瓶培养7 d的UVMU3-1胞外粗酶液进行提取，取适量酶液放入截留量分别为10000、8000、6000~8000、3500、2000、1000、500~1000、100~500 D的透析袋中，再将透析袋放入10倍体积pH=8.0的Tris-HCl缓冲液中，常温放置6 h后吸取透析袋内液与外液测定酶活，以原粗酶液酶活作为100%，每个处理3个重复，取平均值.
3 结果(Results) 3.1 UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质培养基优化 3.1.1 碳源对UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质的影响在YND基础产酶培养基中以浓度为20 g · L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘露醇和体积比2%的甘油为碳源，28 ℃、180 r · min-1恒温培养6 d，取粗酶液测定酶活.如图 1a所示，蔗糖为碳源时产漆酶活力最高，达到21.95 U · L-1，因此，确定蔗糖为最佳碳源.蔗糖浓度为57.00 g · L-1时酶活最高，达到39.58 U · L-1(图 1b)，因此，设置47.50、57.00、66.50 g · L-1为正交试验蔗糖水平.
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| 图1 碳源对UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质的影响(a.不同碳源；b.蔗糖浓度) Fig.1 The impact of carbon sources on UVMU3-1 thermostable extracellular laccase activity substance(a. carbon sources; b. sucrose concentration) |
在基础产酶培养基中分别添加NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨，发现UVMU3-1利用NaNO3产漆酶活力最高(38.35 U · L-1)，因此，将最佳氮源确定为NaNO3(图 2a).NaNO3浓度为38.40 g · L-1时酶活最高，达到55.76 U · L-1(图 2b )，故设置正交试验NaNO3水平为32.00、38.40、44.80 g · L-1.
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| 图2 氮源对UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质的影响(a.不同氮源；b.NaNO3浓度) Fig.2 The impact of nitrogen sources on UVMU3-1 thermostable extracellular laccase activity substance(a.nitrogen sources; b.NaNO3 concentration) |
UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质酶活结果显示，CuSO4、FeSO4 · H2O、ZnCl2、MgSO4 · 7H2O、Fe2(SO4)3会抑制漆酶活性物质产生和分泌，K2SO4及MnSO4对漆酶活性无明显影响.NaCl、CaCl2、KCl对UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质均有明显的促进作用，其中以NaCl作为无机盐时UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质的酶活力最高(49.28 U · L-1)，为UVMU3-1产耐热性胞外 漆酶活性物质培养基最佳无机盐(图 3a).当NaCl浓度为1.20 g · L-1时，酶活最高可达到55.89 U · L-1(图 3b)，后续试验设置1.08、1.20、1.32 g · L-1为正交试验NaCl的3个水平.
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| 图3 无机盐对UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质的影响(a.不同无机盐；b. NaCl浓度) Fig.3 The impact of inorganic salts on UVMU3-1 thermostable extracellular laccase activity substance(a.inorganic salts; b.NaCl concentration) |
调节基础产酶培养基的初始pH值，28 ℃、180 r · min-1下恒温培养6 d，取粗酶液测定酶活，结果如图 4所示.初始pH为7.0时UVMU3-1产漆酶活力最高，达到51.48 U · L-1.因此，设置起始pH为6.0、7.0、8.0为正交试验起始pH值水平.
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| 图4 起始pH对UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质的影响 Fig.4 The impact of initial pH on the production of thermostable extracellular laccase activity substance by UVMU3-1 |
正交试验结果表明，UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质最优水平组合为A3B2C1D1，即蔗糖66.50 g · L-1，NaNO3 38.40 g · L-1，NaCl 1.08 g · L-1，起始pH=6.0.极差分析比较发现，RD>RA>RC>RB，影响UVMU3-1菌株产耐热性胞外漆酶活性物质能力的因素强弱依次为：起始pH>蔗糖>NaCl>NaNO3(表 2).
| 表2 正交试验结果 Table 2 Results of orthogonal experiment |
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以优化前后的培养基在相同条件下对UVMU3-1进行培养，测定酶活随时间变化曲线，结果见图 5.优化后UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质周期显著提前，第3 d酶活出现高峰值，达到57.92 U · L-1，同时，酶活随着培养时间的增加而增加，培养7 d时酶活达到94.81 U · L-1.
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| 图5 UVMU3-1高温酶活曲线 Fig.5 High-temperature laccase activity curves |
酶浓度与孔雀石绿脱色效果呈正向关系，酶浓度越高对其脱色效果越好，但当酶浓度达到7.5 U · L-1以上时，脱色效果差别不显著(图 6)，因此，选取酶浓度为7.5 U · L-1研究胞外耐热性漆酶活性物质对三苯甲烷类染料脱色作用.
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| 图6 不同酶浓度对孔雀石绿脱色效果 Fig.6 Decolorization of malachite green by different concentrations of enzyme |
粗酶液对孔雀石绿具有良好的脱色效果，7.5 U · L-1粗酶液与20 mg · L-1孔雀石绿在75 ℃反应5 min后，脱色率为76.3%，反应35 min后达到96.3%；而常温条件下，反应35 min后脱色率仅达到23.2%(图 7 a).7.5 U · L-1粗酶液与20 mg · L-1结晶紫75 ℃反应5 min后脱色率为77.5%；反应35 min后达到95.3%，是常温脱色率的8.9倍(图 7b ).
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| 图7 UVMU3-1胞外耐热性漆酶活性物质对三苯甲烷类染料脱色作用(a.孔雀石绿；b.结晶紫) Fig.7 Decolorization of triphenylmethane dyes by UVMU3-1 thermostable extracellular laccase activity substance(a.malachite green; b.crystal violet) |
如图 8所示，将粗酶液沸水浴中煮沸15 min后高温酶活残留92.33%，煮沸30 min后高温酶活残留72.50%，结果说明，该耐热性胞外漆酶活性物质具有良好的耐热性.
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| 图8 UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质热稳定性 Fig.8 Thermal stability of thermostable extracellular laccase activity substsnce from UVMU3-1 |
如图 9所示，使用截留量大于1000 D透析袋时，酶活90%存在于透析外液，透析内液几乎没有；当透析袋截留量为1000、500~1000、100~500 D时，透析内液出现酶活，但透析外液的酶活依然占到85%左右，结果说明该高温漆酶分子量小于1000 D，在0~1000 D之间.
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| 图9 UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质分子量 Fig.9 Molecular weight of thermostable extracellular laccase activity substance from UVMU3-1 |
Maalej-Kammoun等(2009)在研究中指出，使用栓菌漆酶对孔雀石绿脱色2 h后，脱色率为80%.Forootanfar等(2011)从子囊菌Paraconiothyrium variabile中提取漆酶PvL，并研究了该耐热性胞外漆酶活性物质对孔雀石绿染料溶液脱色效果，发现在酶浓度4 U · mL-1时，常温条件下反应15 min后，脱色率达到68%，1 h后脱色率达到85%.UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质对三苯甲烷类染料在高温条件下的脱色效果优于现有文献道过的真菌胞外漆酶.并且由于三苯甲烷类染料不是漆酶的直接反应底物，大多数情况下需要添加某种介体才能达到不错的脱色效果.同时，介体价格往往是比较昂贵的，这就大大提高了工业化脱色成本.但UVMU3-1产耐热性胞外漆酶活性物质对孔雀石绿和结晶紫进行脱色时没有添加任何一种介体，同时，在高温短时间内可以对孔雀石绿和结晶紫几乎完全脱色，这样就降低了脱色成本，使其更具有工业化生产价值.
真菌漆酶对孔雀石绿或结晶紫等三苯甲烷类染料的脱色机理及脱色产物，到目前为止还没有一个准确完整的定论.Cha等(2001)利用HPLC和HPLC-MS在丝状真菌Cunninghamella elegan ATCC36112漆酶降解孔雀绿的反应物中，只检测到孔雀绿和无色孔雀绿依次去甲基后的脱色反应产物(图 10).国外有研究表明(Papinutti et al., 2004)，当孔雀绿分子侧链上的甲基被破坏时，其在可见光的最大波长发生红移，孔雀石绿的溶液从绿色变成浅蓝色.其它研究报道表明(Banerjee et al., 2002)，环境中的自由基可介导结晶紫的聚合；而刘友勋等(2008)的研究指出，孔雀石绿和结晶紫结构类似，同属于三苯甲烷染料，可能漆酶介体系统对孔雀石绿的作用机制类似：漆酶氧化介体形成介体自由基，在自由基的介导作用下孔雀绿被聚合成黑色沉淀物，最后导致孔雀石绿溶液由绿色逐渐变成无色.
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| 图10 丝状真菌Cunninghamella elegan ATCC36112漆酶降解孔雀绿的代谢途径(Cha et al., 2001) Fig.10 The metabolic pathway of malachite green degradation by laccase in filametous fungi Cunninghamella elegan ATCC36112(Cha et al., 2001) |
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