近年来，随着我国畜禽养殖业规模化和集约化的快速发展，畜禽污染废水已经成为我国水环境污染的重要源头之一(Xian et al., 2010).尽管通过厌氧与好氧等生物净化技术的处理，排水可以达到我国《畜禽养殖业污染物排放标准》(GB 18596—2001)的要求，但废水中仍具有较高浓度的氮磷等营养盐残留，如何有效地对此类废水进行深度净化处理日益被社会所关注.目前，在国内外热带或亚热带地区，生态处理技术在畜禽污水深度处理方面展现了良好的发展潜力，其中，水生植物滤床(Aquatic plant filter bed，APFB)已在此领域展现其可行性(Xian et al., 2010; 廖德润等，2013b；董健等，2012).水生植物作为水生植物滤床的主要组成单元，通常选用水生蔬菜(如空心菜、水芹、西洋菜等)，在深度净化废水的同时，实现资源的回收利用.

相比养殖废水中氮磷等营养盐对环境的污染情况，由于对环境微生物的抗性影响作用，废水中残留的抗生素及抗生素抗性基因等微污染物也逐渐被重视关切.近年来研究调查报告指出，我国每年生产的抗生素约有46.1%被用于畜禽养殖过程中治疗和预防等方面(Hvistendahl，2012; Zhu et al., 2013).但由于畜禽对抗生素的低吸收性，大量的抗生素成分通过畜禽废水排放进入环境.同时，兽用抗生素的大量应用也增加了抗生素抗性基因在畜禽肠道内水平转移和抗性固定的频率，从而增加抗生素抗性基因在环境中传播扩散的机率(Wu et al., 2010).因此，研究人员在关注畜禽养殖废水中氮磷去除的同时，也开始研究废水中残留抗生素和抗性基因与生态处理工艺的相互作用关系(Liu et al., 2013a).然而，目前关于畜禽养殖废水深度处理过程中，抗生素和抗生素抗性基因在水生植物滤床中响应情况的研究报道还很罕见，并且工艺设计参数和外界因素对其的作用影响还有待深入研究.基于此，本文研究了典型抗生素和抗生素抗性基因在种植不同水生蔬菜的水生植物滤床中去除和累积情况，并考察季节变化对此过程的作用影响.以期为更好地利用水生植物滤床深度处理畜禽养殖废水提供科学依据.

本实验采用3组水生植物滤床系统，分别为空白对照组、空心菜种植系统和水芹种植系统，滤床系统有效容积为5 L.研究在试验前期采用Hoagl and 营养液将空心菜和水芹在沙盘上进行育种至10 cm，之后选取性状表征相似的水生蔬菜分别移栽到2个系统中，每个滤床中栽种植物20株.实验进程分为两个阶段，即夏季(8—9月)和冬季(12月—1月)，每个阶段独立进行，分别栽种水生植物，每阶段运行时间为60 d.为模拟实际养殖废水的抗生素水平，实验设计在实际养殖废水投加3大类抗生素成分(四环素类抗生素3种、磺胺类抗生素3种及喹诺酮类抗生素3种，共9种)以作实验水体，在保证植物体的正常生长前提下，3大类抗生素含量保持相似水平，各类总量分别为30 μg · L^-1(Wei et al., 2011；Zhang et al., 2011；Chen et al., 2012；廖德润等，2013a).其中，实际养殖废水取自厦门市集美区某养猪场的厌氧好氧串联生物处理装置后集水池，并置于冰箱(4 ℃)中保存备用.

设定水生植物滤床的水力负荷为5 cm · d^-1.废水样品在夏季和冬季每阶段，3组系统分别取样7次，进行抗生素分析测定，并结合不同系统的水力损失进行综合评价.每个阶段结束时期，即第55 d对3组系统内抗生素和抗生素抗性基因在系统内累积情况进行测定，并对出水中抗生素抗性基因含量进行分析.实验选取常见的几种典型抗生素抗性基因作为目的基因进行检测:2 种磺胺类抗生素抗性基因 sul I、sul II和5 种四环素类抗生素抗性基因 tetA、tetM、tetO、tetW和tetX.在我国养殖废水和周边土壤的调研中，四环素类和磺胺类抗性基因丰度与动物养殖场和污水处理厂的分布显著相关，具代表性(Ji et al., 2012；Chen et al., 2012；Zhu et al., 2013).

预处理 ：水样以 0.45 μm 滤膜过滤，去除悬浮物；植物组织与底泥分别冻干后研磨，称取一定质量，每 1 g固体样中 加入 0.1 g Na₂EDTA，并加入适量乙腈磷酸盐混合液浸提，经振荡超声萃取抗生素，离心收集上清液，重复两次，加入定量超纯水制为样品浸提液.经过预处理的样品浸提液 以 1 滴 · s^-1的速度通过预先经6 mL 丙酮、6mL甲醇和6mL甲酸/水溶液(体积比0.5 ∶ 99.5)活化的HLB 固相萃取柱，待上清液完全流出后，依次用 6 mL 水和6 mL 甲酸/水溶液(体积比5 ∶ 95)淋洗，弃去全部流出液.减压抽干30 min，最后用3 mL 甲醇溶液洗脱.将洗脱液在 37 ℃吹氮、浓缩至干，用 1 mL 甲酸/水标准溶解液(体积比20 ∶ 80)溶解残 渣，过 0.45 μm 滤膜，供液相质谱仪测定(Xian et al., 2010; Liu et al., 2013b).

样品测定：取经过预处理的样品提取液经 LC-MS(ABI 3200Q TRAP)测定.色谱条件(Xian Q et al., 2010)：色谱柱为Inertsil ODS-SP，柱温 40 ℃；流速 0.8 mL · min^-1；进样量 20 μL；流动相为甲醇和0.5%(体积分数)甲酸；流速1.0 mL · min^-1.质谱条件：离子化方式为电喷雾电离源正源模式(ESI⁺)，离子源I(GS1)和II(GS2)的气流量分别为50和60 mL · min^-1，电离电压 5500 V；辅助加热气温 550 ℃.

本试验选取常见的几种典型抗生素抗性基因作为目的基因：2 种磺胺类抗生素抗性基因 sul I、sul II和5 种四环素类抗生素抗性基因 tetA、tet M、tetO、tetW和tetX，对采集水样中所提取的 DNA 进行定量检测，引物设计参考已发表的文献(Liu et al., 2013a).

DNA 提取：采用E.Z.M.A土壤DNA提取试剂盒(美国Omega生物技术公司)，按照生产商提供的说明提取土壤中的微生物基因组DNA.其中，水样中DNA提取如下：取0.5 L水样，用0.45 μm滤膜过滤，然后用超纯水冲洗滤膜，收集冲洗液，采用UItraclean Water DNA Kit试剂盒，按照生产商说明的方法提取水样中DNA.提取的 DNA 用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计(UV-8000PC)检测含量及纯度(A₂₆₀/A₂₈₀ 值在 1.8~2.0 之间)，结果表明，用试剂盒提取的 DNA为纯度较高的生物基因组DNA.

RT-PCR ：用Takara Bio Inc公司的 RT-PCR 试剂盒 进行 7 个目的基因的 SYBR Premix Ex Taq II实时定量 PCR 反应.PCR 反应体系(体积为 20 μL)包括目的基因上、下游引物及ROXII 各0.4 μL，SYBRmix10 μL，待测DNA模板 2 μL，ddH₂O 6.8 μL.PCR 反应程序为：95 ℃预变性5 min后循环扩增40次，其中，sulI 94 ℃变性10 s，65 ℃退火45 s；su II 94 ℃变性10 s，57 ℃退火45 s；tetA 94 ℃变性10 s，52 ℃退火45 s，80 ℃延伸10 s；tetM 94 ℃变性10 s，45 ℃退火45 s，80 ℃延伸10 s；tet O 94 ℃变性10 s，45 ℃退火45 s，81 ℃延伸10 s；tet W 94 ℃变性10 s，60 ℃退火45 s，83 ℃延伸10 s；tetX 94 ℃变性10 s，52 ℃退火45 s，80 ℃延伸10 s.16SrDNA的PCR 反应体系与目的基因相同，40次循环的扩增程序：95 ℃变性10 s，53 ℃退火35 s，81 ℃延伸10 s.

所有数据用 Excel 软件进行统计学处理，采用 t 检验进行显著性分析.由于不同的水生植物滤床存在的水量损失不同，且差异较大.因此，对不同系统中抗生素去除效率η根据公式(1)进行计算.

式中，C_i和C_e分别为出入水质中抗生素浓度(μg · L^-1)，Q_i和Q_e分别为出入水量(L)

本试验全程对系统出水同步进行常规检测，种植植物系统在两个阶段对COD、TN和TP平均去除率均达60%、30%和8%以上，处理效果良好.两个实验周期内，两种植物体生长状况均表现良好，未出现明显的抑制现象.由此表明添加抗生素并未影响到水生植物滤床对水体中常规污染物的处理效果，系统对抗生素去除和抗性基因表达差异与植物活性抑制与否无关，而是取决于系统内植物的种类.

本试验的固液样品中有3大类9种抗生素成分被分析测定，然而由于同类单体抗生素可在体系中发生同型转换(Migliore et al., 2003；Liu et al., 2013b)，从而可能会导致单体抗生素在系统内变化规律并非由体系配置和外界因素的影响所造成，因此，本研究将同类抗生素进行集加，对不同大类抗生素(四环素类 TCs、磺胺类 SMs和喹诺酮类 QNs)的试验结果进行分析.

不同季节情况下3组水生植物滤床的抗生素出水浓度和去除效率的平均值如图 1所示.研究结果表明，水生植物滤床可去除废水中残留抗生素成分，但不同类别抗生素在不同配置的系统中去除效果具有差异性，并且受季节变化影响明显.

图 1(Fig. 1)

图 1 不同季节情况下3组系统中抗生素的出水浓度(a)和去除效率(b) Fig. 1 The effluent concentration(a) and removal efficiency(b)of the antibiotics in three APFB systems in different seasons

在抗生素出水浓度方面，相比空白对照组，夏季运行下3大类抗生素在空心菜和水芹系统中出水浓度较高，而在冬季则表现出相反的运行情况，种植植物系统中的抗生素在夏季和冬季的出水浓度分别约为4.19~25.24 μg · L^-1和7.83~23.28 μg · L^-1；在夏季水芹系统抗生素出水浓度(TCs 4.19 μg · L^-1、SMs 13.18 μg · L^-1、QNs 22.26 μg · L^-1)要低于空心菜系统(TCs 6.87 μg · L^-1、SMs 16.29 μg · L^-1、QNs 25.24 μg · L^-1)，而在冬季水芹系统抗生素出水浓度要高于空心菜系统.在基于水力平衡的抗生素去除效率方面，研究结果指出，不同季节情况下抗生素去除效率与抗生素出水浓度结果相似，即相比空白对照组，水生植物种植系统中抗生素去除效率在夏季较低，而在冬季则表现出较高的去除能力，种植植物系统中3大类抗生素在夏季和冬季的去除效率分别约为6.84%~71.83%和19.25%~58.38%；通过比较不同植物种植系统中抗生素去除效率发现，在夏季水芹系统对抗生素的去除效率分别为71.83%(TCs)、46.80%(SMs)和21.53%(QNs)，这要明显高于空心菜系统(TCs 33.28%、SMs 19.73%、QNs 6.84%)，但在冬季运行情况下两组水生植物滤床对抗生素的去除效率差异不显著.

在夏季和冬季试验末期，水生植物滤床中底泥和植物茎叶中抗生素累积含量被分析测定，结果如图 2所示.研究表明，植物叶片和茎部中抗生素累积含量分别约为0.15~7.33 μg · g^-1(以干重计，下同)和1.72~103.7 μg · g^-1，相比植物叶片，3类抗生素在植物茎部都具有较高的累积含量.但在夏季运行情况下，3类抗生素在空心菜茎部具有明显较高的累积含量(22.89~103.7 μg · g^-1)，而在冬季3类抗生素在水芹叶片中具有明显较高的累积含量(3.52~7.33 μg · g^-1).通过含量集合可知在夏季空心菜中抗生素累积含量较高，而水芹则在冬季要比空心菜累积更多的抗生素成分.然而在底泥方面，四环素类和磺胺类抗生素的累积含量相似，并且受季节因素影响并不显著；但对于喹诺酮类抗生素，研究发现其在夏季系统底泥中累积含量约为11.17~12.26 μg · g^-1，这要明显高于其在冬季系统中累积含量.

图 2(Fig. 2)

图 2 不同季节情况下3组系统中抗生素在植物叶(a)、茎(b)和底泥(c)中的累积含量 Fig. 2 The cumulative content of antibiotics in plant leaf(a)，stem(b) and sediment(c)in three APFB systems of different seasons

在夏季和冬季试验末期，为了考察分析深度处理养殖废水过程中微生物在水生植物滤床中的变化趋势，3组系统的出水及底泥中抗生素抗性基因含量和16S rDNA水平被测定，并且为减少分析测定过程中所产生的误差，本研究后续论述将基于抗生素抗性基因的相对含量(目标基因拷贝数/16S rDNA拷贝数)进行分析探讨(Wu et al., 2010; Liu et al., 2013a; McKinney et al., 2010).

不同季节情况下3组水生植物滤床的出水中16S rDNA含量、抗生素抗性基因绝对浓度和抗生素抗性基因相对含量如图 3所示.对比不同季节情况下空白组出水中相对含量，tetO和tetA在夏季系统中具有较高含量，约为1.05×10^-1和1.11×10^-1，而其他5种抗生素抗性基因在冬季系统中要高于夏季系统.而对于不同植物而言，夏季运行时sulI、sulII、tetA、tetM、tetX和tetO在空心菜系统出水中具有较高含量，而冬季运行情况下sulI、sulII、 tetW、tetM、tetX和tetO在水芹菜系统出水中含量较高.而无论季节变化还是工艺配置差异，相比其他抗生素抗性基因，tetX在系统中都具较高的相对浓度，约为3.75×10^-2和8.62×10^-1.

图 3(Fig. 3)

图 3 不同季节情况下3组水生植物滤床的出水中16S rDNA含量、抗生素抗性基因绝对浓度和抗生素抗性基因相对含量 Fig. 3 The absolute gene copies of 16S rDNA gene，absolute ARGs copies and relative content of sul and tet in effluent of three APFB systems in different seasons

不同季节情况下3组水生植物滤床的底泥中16S rDNA含量、抗生素抗性基因绝对浓度和抗生素抗性基因相对含量如图 4所示.与抗生素抗性基因出水相对含量相似，对比不同季节情况下空白组底泥中相对含量，tetO和tetX在夏季和冬季系统中具有相似含量，分别约为1.29×10^-1和1.05×10^-1，而其他5种抗生素抗性基因在冬季系统中要高于夏季系统.在不同植物对比方面，研究结果指出，夏季运行时sulI、sulII、tetA、tetM和tetO在空心菜系统出水中具有较高含量，而冬季运行情况下除 sulII之外，其他6种抗生素抗性基因在水芹菜系统底泥中具有较高相对含量.总体而言，系统出水与底泥中抗生素抗性基因水平对植物种类和季节因素变化的响应趋势相似.

图 4(Fig. 4)

图 4 不同季节情况下3组水生植物滤床的底泥中16S rDNA含量、抗生素抗性基因绝对浓度和抗生素抗性基因相对含量 Fig. 4 The absolute gene copies of 16S rDNA gene，absolute ARGs copies and relative content of sul and tet in sediment samples of three APFB systems in different seasons

抗生素在生态工艺中的去除包含多种作用机制，包括生物降解、吸附固定、水解作用、光解作用和植物吸附(Xian et al., 2010;Liu et al., 2013;Kümmerer，2009).然而由于本实验装置由PVC板材制作，并且植物系统和空白组分别由植物和板材覆盖，从而光解作用在本系统内对抗生素的去除可忽略.此外，研究表明吸附作用是抗生素在生态工艺中去除的主要途径(Liu et al., 2014; Hijosa-Valsero et al., 2010)，然而由于本系统中没有填加填料，吸附固定主要通过底泥累积而实现，但系统底泥含量较低，并且抗生素在底泥中的累积情况也表明其在底泥中累积浓度也较低，因此，吸附作用对抗生素在系统中去除的贡献较小.通过对植物体内抗生素含量分析可知，水生植物滤床中植物吸收作用可有效去除抗生素，特别是在冬季阶段，有空心菜和水芹系统对抗生素的去除效率明显要高于空白对照组.因此，水生植物滤床中植物吸收作用、生物降解和水解作用是其去除废水中抗生素成分的主要途径.

本研究经历夏季和冬季两个阶段，水生植物滤床中抗生素去除情况在有无植物种植系统中出现了明显差异.结合水力平衡的去除效率的实验结果，抗生素可在系统内被大幅度去除，但由于夏季阶段植物栽种可导致水体蒸发量增加，从而造成水体中抗生素含量的明显升高.研究结果表明，相比水芹系统，空心菜系统中水体蒸发量更大，从而造成了空心菜系统的抗生素出水浓度明显高于其它两组系统.而在冬季运行阶段，植物对水体吸收能力减弱，从而降低了抗生素在植物种植系统中出水浓度.在前期研究人工湿地处理养殖废水过程中也得到相似结论(Liu et al., 2014).两种不同植物系统中抗生素的去除效率差异与植物的水力传导有关.研究指出，植物可以通过主动吸收和蒸腾作用吸收水体中的抗生素(Liu et al., 2013b; Grote et al., 2007; Dettenmaier et al., 2009).并且，研究表明植物对有机污染物的富集和抗生素的辛醇/水分配系数(logK_ow)对数之间存在着密切的相关性，植物对有机污染物的吸收和转化需要合适的分配系数，极性疏水(logK_ow>4)或者极性亲水(logK_ow<1)的有机物不易被植物吸收(Dettenmaier et al., 2009;Boonsaner and Hawker， 2010; Herklotz et al., 2010).结果表明，植物主要是以蒸腾作用为动力，通过吸收水分去除水体中抗生素成分，也说明空心菜系统和水芹系统中抗生素去除效率存在差异，即由于空心菜系统对水分吸收能力较强，从而提高了抗生素的去除效率.

相比夏季运行情况下，抗生素抗性基因相对含量在冬季系统内相对较高，说明抗生素抗性基因在水生植物滤床中传播扩散并不受季节变化所带来的温度变化影响.抗生素在废水中残留含量可能具有更高的相关性.研究已经证明，抗生素成分存在环境中可诱导产生具有忍耐性的抗性菌株(Hvistendahl，2012;Gilbert，2012).其中，Luo等(2010)对中国海河流域河水及沉积物中的抗生素抗性基因水平的检测结果发现，磺胺类抗性基因丰度与磺胺类抗生素成显著正相关，表明磺胺类抗生素的存在确实选择性地富集了相应的抗性基因，其丰度高达10¹¹ copies · g^-1沉积物，低于本试验sul在对照组的10¹² copies · g^-1底泥，高于植物组最高水平10¹⁰ copies · g^-1底泥.本试验四环素类抗性基因水平检测发现，植物组出水中tetW、tetM和tetO含量水平均低于处理养殖废水的人工湿地系统的1.07×10¹⁰、4.03×10¹⁰和4.92×10¹⁰ copis · L^-1(郑加玉等，2013).而在对比不同植物系统中抗生素抗性基因含量方面，研究也表明夏季运行时sulI、sulII、tetA、tetM、tetX和tetO在空心菜系统出水中具有较高含量，而冬季运行情况下sulI、sulII、tetW、tetM、tetX和tetO在水芹菜系统出水中含量较高，这与出水中抗生素浓度呈现相关性.因此，水生植物滤床中抗生素抗性基因水平与水体中残留抗生素具有重要的关系.

研究结果表明，水生植物滤床对于畜禽养殖废水具有一定的处理能力.结合生态工艺结构与运行机制，可推断水生植物滤床中植物吸收作用、生物降解和水解作用是其去除废水中抗生素的主要途径.不同植物因其蒸发量、水力传导不同，以及抗生素的辛醇/水分配系数对数(logK_ow)不同，植物对不同抗生素的富集效果不同.由于空心菜系统对水体吸收能力较大，从而提高了抗生素在其中的去除效率，相应的空心菜系统和水芹系统中抗生素去除效率具差异性.抗生素抗性基因在水生植物滤床中的传播扩散并不受温度变化的影响，而与抗生素在废水中的残留含量具有更高的相关性.