甲藻孢囊是甲藻通过有性生殖方式产生的非活动性繁殖细胞，一方面它能使甲藻躲避不良生长环境完成繁殖过程，另一方面还是甲藻基因重组和扩散的有效方式(Mertens et al., 2012).孢囊可在赤潮后期大量形成，并沉降至底层沉积物，经过一段时间的强制性休眠期后，孢囊又可萌发为营养细胞并迁移至上层水体，导致赤潮的发生(张琪等，2012).因此，孢囊被认为是赤潮发生的“种源”(Anderson et al., 2005)，亦被认为是赤潮消亡的重要原因(Wang et al., 2007).

已有的研究认为，有两种萌发机制控制着甲藻孢囊的萌发：时间-温度机制和周年性节律机制，前者是指孢囊在度过休眠期并且具备适宜的环境条件就能顺利萌发，后者是指孢囊的萌发还受到自身生物钟调节机制的影响(Kim et al., 2002; Anderson et al., 1980).甲藻孢囊一般要经过休眠期，即强制性内部成熟时期，在这个时期孢囊不能萌发.强制性休眠期的长短与种类及保存的环境状况有关，一般为2周至半年不等，经过休眠期之后，若外部条件不适时，孢囊将进入一个静止时期，亦不会萌发(Pfiester et al., 1987).温度是水环境中一个极其重要的环境因子，有人认为温度是控制甲藻孢囊萌发的主要因子(Kim et al., 2002，刘俏等，2013)，孢囊只有在一定的温度范围内才能萌发；Kim等(2002)的研究表明，溶解氧是塔玛亚历山大藻(Alex and rium tamarense)休眠孢囊萌发的必要条件，而营养盐对萌发的影响有限；Blanco等(2009)的研究结果表明，微小亚历山大藻(Alex and rium minutum)孢囊在不同温度下的萌发率相似，而主要影响因素是光照；Genovesi等(2009)对塔玛亚历山大藻(Alex and rium tamarense)孢囊的萌发研究表明，贫氮或者贫磷的环境不会影响孢囊萌发率，环境中无机氮磷浓度对该种甲藻的萌发影响较小；王朝晖等(2010)研究表明，中国南海大鹏湾中的锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)孢囊萌发率也不受环境无机氮磷浓度影响，且受温度影响较小，但低温会显著减缓孢囊的萌发速度，而缺氧和黑暗的环境则可以完全抑制孢囊的萌发.目前的研究主要集中在海洋沉积物甲藻孢囊的萌发，对淡水沉积物甲藻孢囊的萌发研究较少(王朝晖等，2014).

氮和磷是藻类生长和代谢所必需的两种元素，氮元素参与藻细胞内DNA和蛋白质的合成，磷元素参与细胞内三磷酸腺苷(ATP)的合成和转化及细胞新陈代谢过程中的酶促反应(严杨蔚等，2013).营养盐的可用性限制浮游植物的生长，在自然状态下，湖水中的磷主要以可溶性有机磷(DOP)和颗粒态磷为主，生物可直接利用的可溶性无机磷的含量很低(金相灿等，2006).目前不少学者对有机磷营养盐与藻类生长的关系进行了研究，结果表明，在无机磷缺失的条件下，有些藻类能够利用有机磷来维持自身的生长(Yamamoto et al., 2002).如曹秀云等发现，富营养化湖泊藻类可以通过分泌胞外碱性磷酸酶有效地利用有机磷(Cao et al., 2005)；Yamaguchi 等(2008)分别以15 种不同的有机态磷作为卵圆褐胞藻的营养物质，发现卵圆褐胞藻只能利用二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)维持生长；Cucchiari 等(2008)研究证明，针胞藻能够利用甘油磷酸进行生长，但生长速率低于有无机态磷存在的情况.但也有研究者发现，浮游植物和细菌可以利用溶解性有机磷，有的甚至比无机磷的利用效率更高(Huang et al., 2005).日本的Oh等(2002)和Yamamoto等(2004)发现，相对于无机营养物链状裸甲藻能更好地利用有机营养物质，即有机营养条件下更容易促进甲藻的生长.由上可见，藻类对不同磷营养盐形态的利用存在着种间差异.

近几年，我国淡水环境中的甲藻水华事件频频发生，如2004—2005年，三峡水库香溪河库湾暴发倪氏拟多甲藻(杨正健等，2010)，2005年广东省黄龙带水库暴发二角多甲藻(孙育平等，2008)，2006年湖北姊归香溪河高阳镇河段暴发波兰多甲藻(胡圣等，2008)，2009年1月福建省九龙江流域发生佩式拟多甲藻属甲藻水华事件(边归国等，2010).目前的相关研究主要集中对甲藻水华发生的原因与机理探索，对于淡水甲藻孢囊萌发机制研究较少.因此，本文主要研究温度、有机磷营养盐对九龙江西陂库区表层沉积物中甲藻孢囊萌发的影响，以揭示甲藻水华的发生机理，并为九龙江流域甲藻水华预警和治理提供参考.

九龙江是福建省的第二大河流，仅次于闽江，位于福建省的西南部，干支流流经龙岩、漳平、南靖等13个县、市，最后由厦门港入海，其地理位置及研究区域位置如图 1所示.九龙江流域面积14741 km²，河流干线长度285 km，流域坐标为东经116°47′~118°02′，北纬24°13′~25°51′.九龙江分北、西、南三溪，北溪为主流.

图 1(Fig. 1)

图 1 九龙江流域地理位置图 Fig. 1 Location of Jiulong River

北溪流全长274 km，流域面积9640 km²，流经龙岩市、华安县、漳州市、厦门市等地，为所经流域近400万人提供生活必须的饮用水.由于九龙江北溪属于丰水带河流，水力资源比较丰富，是开发的重点.根据北溪流域综合规划，干流河段从上游到下游共规划11个梯级水电站，西陂电站是其中一个.西陂电站位于华安县湖林乡西陂村上游1.1 km的九龙江北溪干流河段上，距华安县城约19 km.呈狭长型，为径流式开发电站，正常蓄水位125.30 m，相应库容891.3万m³，总库容1640万m³，电站总装机容量44 MW，多年平均发电量17075万kW · h.本研究选取九龙江北溪西陂电站库区作为研究对象.

于2013年4月28日，使用蚌式采泥器及GPS定位采集九龙江西陂电站库区8个断面的表层沉积物样品，采样断面和经纬度位置如表 1所示.将表层沉积物置于聚乙烯盆中均匀混合，然后装入自封袋中，排尽袋中的空气后，密封避光保存.当天将沉积物样品运回实验室，于4 ℃避光冷藏备用.全过程应保持黑暗、低温.

表 1(Table 1)

表 1 九龙江西陂库区采样断面经纬位置 Table 1 The geological position of the main sampling points in Jiulong River Xipi reservoir

表 1 九龙江西陂库区采样断面经纬位置 Table 1 The geological position of the main sampling points in Jiulong River Xipi reservoir 编号 纬度 经度 位置 X1 25°07′12.04″ 117°31′44.76″ 坝前300 m X2 25°07′15.67″ 117°31′41.16″ 坝前600 m X3 25°07′19.99″ 117°31′37.60″ 坝前800 m X4 25°07′29.81″ 117°31′19.73″ 坝前1200 m X5 25°07′38.43″ 117°31′14.71″ 坝前1500 m X6 25°07′53.38″ 117°31′06.38″ 坝前2000 m X7 25°08′16.83″ 117°30′56.14″ 坝前2800 m X8 25°08′33.54″ 117°30′56.27″ 坝前3200 m

利用干湿重之差，测定各断面沉积物含水率.

采用SMT法分级提取各断面表层的沉积物(Ruban et al., 2001).

表层沉积物TC、TN含量并进行各形态磷分析.使用元素分析仪(德国Elementar Vario EL III)进行测定，每个样品做3个平行样，数据用平均值±标准偏差表示.

将采集的每个断面的沉积物样进行充分的人工混合，称取2.00 g沉积物样，溶于50 mL蒸馏水，超声波处理，20 μm筛绢过滤，取样品在10×10 倍显微镜(Olympus)下进行计数，直至样品镜检结束.另称取2.00 g沉积物样，60 ℃下烘烤，计算泥样湿重与干重的比率，初始孢囊数量以cells · g^-1(以沉积物干重计)表示.

甲藻孢囊萌发实验采用X₆断面的沉积物.实验室前期的温度和营养盐单因素萌发探索实验表明，不同的温度和营养盐对孢囊的萌发速率有显著影响，高温和有机磷可以促进孢囊的萌发.为了进一步验证，本文采用两种不同温度和营养盐双因素培养方式，通过对孢囊萌发与萌发后增殖藻类丰度与种类的研究，探索甲藻萌发受温度和营养盐的影响程度.

分段组萌发实验时间为2013年12月，称取2.00 g X₆点位的沉积物样于直径为5 cm的有盖培养皿中，添加20 mL的Carefoot′s medium，按表 2所示的实验条件设置进行培养，每组设置3批实验样，在第2、4、6 d分别取出1批，计算剩余的孢囊数量，同时取出上层培养液，加入适量Lugol′s碘液，镜检并计算其中的藻类种类和丰度.磷是藻类生长的一个必不可少的营养元素，甲藻的生长需要大量磷源的连续供应(章伟婕，2014).因此，本实验选择Carefoot′s medium本身所含有的NaH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O作为无机磷的来源，以AMP替代Carefoot′s medium中的无机磷作为有机磷的来源，因为单磷酸腺苷分子量低，是水体中常见的有机磷成分，而且容易被生物利用.

表 2(Table 2)

表 2 分段培养组萌发实验条件设置 Table 2 The setup of experimental conditions for staged cultivation of germination experiment

表 2 分段培养组萌发实验条件设置 Table 2 The setup of experimental conditions for staged cultivation of germination experiment 组别 温度/ ℃ 培养基 光照条件 取出时间 Ⅰ 15 Carefoot′s medium(无机磷) 光暗比为 第 2、4、6天 Ⅱ 15 Carefoot′s medium(有机磷) 12 h∶12h，光照强度为2500 lx Ⅲ 20 Carefoot′s medium(无机磷) Ⅳ 20 Carefoot′s medium(有机磷)

连续培养萌发实验时间为2013年12月，其实验条件和分段培养组条件一致.实验开始时计算孢囊的初始数量及沉积物中藻类的种类和丰度.将培养皿中的沉积物连续培养，在第2、4、6 d时分别倒出前1次添加的培养液，然后添加新的培养液继续培养，镜检上层培养液中藻类的种类和丰度，在实验结束时取出沉积物镜检剩余孢囊数量.

沉积物藻类分析方法采用悬浮法，具体操作如下：称取混合均匀的表层沉积物1.00 g，置于干燥洁净的小烧杯中，加入100 mL灭菌蒸馏水，充分混匀，静置1 min，吸取上层液体30 mL至事先做好标识的试剂瓶内，加入鲁哥氏碘液，用量为上层液体的1.5%，并加入40%甲醛溶液保存，其用量为上层液体的4%.按照章宗涉等(1991)的淡水浮游植物图谱对各种藻类进行判定.

上层培养液处理分析方法：取出上层培养液，加入300 ·L鲁格氏碘液(15 mL · L^-1)固定，离心(速率4000 r · min^-1，时间5 min)，移去上清液，底层沉淀定容至 5 mL.

取处理后的样品0.1 mL置于0.1 mL的计数框内，在10×10倍的倒置显微镜(Nikon TS100)下进行观察计数，而后采用视野法，按照公式(1)计算沉积物的藻类数量，最后将其换算成细胞丰度(cells · g^-1，以干重计).

式中，N为细胞丰度(cells · g^-1)，S为计数框面积(mm²)，S₀为计数视野面积(mm²)，V₀为浓缩后体积(mL)，V为计数体积(mL)，n为计数所得藻类数目(个).

根据淡水甲藻孢囊图谱进行显微镜镜检及结合孢囊萌发后营养细胞的PCR结果，对甲藻孢囊的种属进行判定.利用毛细吸管吸取萌发后的单个藻细胞于洁净的载玻片上，添加灭菌蒸馏水，用尖头镊子对细胞进行物理破碎，使孢囊内的遗传物质流出.用毛细管将破碎的细胞吸出并置于PCR管中，进行PCR扩增.PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，1%EB染色，紫外灯下检测是否有目的条带，对有目的条带的样品进行测序.将测得的序列导入网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中，点击BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列的比对，进行最大相似度(ML)分析及贝叶斯(Bayesian)分析.

文中萌发率为初始孢囊数和剩余孢囊数的差值与初始孢囊数的百分比，方差分析采用SPSS18.0进行，用Excel进行绘图.

九龙江西陂水库表层沉积物中TC含量在13770~18079 μg · g^-1之间，TN含量处于720~1422 μg · g^-1之间，TP含量在769~1697 μg · g^-1之间，沉积物平均C∶N∶P约为15∶1∶1.西陂水库各季节表层沉积物均以无机磷为主，占总磷含量的76.3%~86.1%，铁/铝结合态磷和有机磷的含量占总磷含量的53.9%~80.2%.西陂水库沉积物磷污染负荷比较重.

西陂水库表层沉积物中的微藻丰度为1.80×10⁴~5.60×10⁴ cells · g^-1(以底泥干重计)，表层沉积物中的微藻主要以硅藻门、绿藻门、甲藻门为主，硅藻门占81.8%~91.8%，种类较多，包括粗壮双菱藻(Surirella robusta)、羽纹藻(Pinnularia)、针杆藻(Symedra)、埃伦桥弯藻(Cymbella ehrenbergii )、尖头舟形藻(Navicula cuspidate)、颗粒直链藻(Melosira granulata)；绿藻占6.1%~13.2%，主要种属为四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)、链丝藻(Hormidium flaccidum)和小球藻(Chlorella vulgaris)；甲藻的丰度为6.26×10²~9.87×10² cells · g^-1(以底泥干重计)，以拟多甲藻属(Peridiniopsis)为主，其中，甲藻孢囊形态如图 2所示；蓝藻门只观察到针状蓝纤维藻(Dactylococcopsis acicularis)，其他门类的藻类较少.

甲藻门在沉积物中主要以孢囊的形式存在，甲藻孢囊萌发后，转移到上层培养液中以营养细胞的形式存在，具体如图 2所示.影响甲藻孢囊萌发的因素很多，包括温度、溶解氧、营养盐、光照强度等环境条件及生物体内在的节律等，在实验室设定的培养条件下，沉积物中某些甲藻孢囊或休眠体可能不能萌发.另外，由于沉积物休眠体经过萌发培养，萌发出的营养细胞经历了一段时间的生长繁殖，生长速度快的细胞能够在短时期内迅速增长，成为营养细胞的优势种类，而其它竞争力差的种类在生长后期则慢慢消失.经过萌发培养，上层培养液中硅藻种类多，主要有桥弯藻(Cymbella)、羽纹藻(Pinnularia)、直链藻(Melosira)、针杆藻(Symedra)、舟形藻(Navicula)等，沉积物中的硅藻种类比培养液中的多，因为有些硅藻是底栖生存，在上层培养液中很难被发现.绿藻门种类大致一样，有四尾珊藻(Scenedesmus quadricauda)、链丝藻(Hormidium flaccidum)和小球藻(Chlorella vulgaris)，但小球藻在沉积物中主要以团聚态为主，在上层培养液中主要以单个细胞为主.沉积物中有蓝藻门的针状蓝纤维藻(Dactylococcopsis acicularis)，在上层培养液中没有发现.

图 2(Fig. 2)

图 2 表层沉积物的甲藻孢囊形态及萌发培养液中主要的甲藻形态(a~d为表层沉积物观察到的拟多甲藻孢囊(Peridiniopsis Lemmermann)；e~h为培养液中观察到的拟多甲藻营养细胞(Peridiniopsis Lemmermann)) Fig. 2 The morphology of Dinoflagellate cysts in surface sediment and Dinoflagellate in culture medium

分段培养组的孢囊萌发率结果如图 3所示，从图中可以看出，第2 d时，组2、3、4的孢囊萌发率达到60%左右，而组1的孢囊萌发率不到40%，组1和其他组存在极显著的差异(n=3，p<0.01).第4 d时，4组的孢囊萌发率都有上升的趋势，但组1的孢囊萌发率还是显著低于其他3组(n=3，p<0.05).第6 d时，4组的孢囊萌发率都达到70%左右.从组1和组3前4 d的萌发率对比可以看出，20 ℃下孢囊的萌发速率明显高于15 ℃(n=3，p<0.05)，说明高温有利于孢囊萌发.这一现象和Eva等(2008)对Alex and rium minutum的萌发特征研究实验结果相似.

图 3(Fig. 3)

图 3 分段培养萌发实验结果 Fig. 3 The results of staged cultivation of germination experiment

从组1和组2前4 d萌发率对比可以看出，同样温度条件下，有机磷(OP)条件的孢囊萌发率高于无机磷(IP)条件(n=3，p<0.05).这和Tamiji等(2004)通过有害链状裸甲藻对硝酸盐、铵盐和磷酸盐的生长和吸收动力学实验研究结果类似，即有机营养条件下更容易促进甲藻的生长.

分段培养组的上层培养液微藻丰度情况如图 4a所示，微藻丰度在1.18×10²~2.50×10² cells · mL^-1之间，主要以硅藻为主，种类多，主要有桥弯藻(Cymbella)、羽纹藻(Pinnularia)、直链藻(Melosira)、针杆藻(Symedra)、舟形藻(Navicula)等，占微藻的63.9%~84.4%;其次是绿藻，占8.8%~21.2%，甲藻占1.9%~22.2%，蓝藻和其他门类的藻很少.甲藻丰度情况如图 4b所示.从图 4a可以发现，第6 d时，组2和组4的总生物量都呈现下降趋势，可能原因是上层培养液中硅藻占了很大比例，相对于甲藻不善于利用有机磷，只能利用沉积物中释放出来的无机磷，随着培养天数的增加，可利用营养盐逐渐减少，导致生物量也减少.从图 4b可以看出，除组4外，其余3组的甲藻营养细胞丰度总体呈现上升的趋势，尤其是组2的第6 d，甲藻细胞丰度达到35 cells · mL^-1，占22.2%.从这组实验可以看出，15 ℃、有机磷的条件对甲藻的增殖较好，与其他组有显著差异(p<0.05).主要是因为有机磷能够促进孢囊的萌发，而且20 ℃的相对高温有利于蓝藻和绿藻的增长，藻细胞生长要消耗营养盐，趋于减少培养液中的营养盐浓度，甲藻相对于其他藻类竞争能力较差，因此，在组4中甲藻营养细胞数量较低.15 ℃的温度相对较低，从种间竞争的角度来说有利于甲藻的增殖和生长.

图 4(Fig. 4)

图 4 分段培养实验培养液中微藻(a)和甲藻(b)丰度分析 Fig. 4 Microscopy analysis of phytoplanktons(a) and dinoflagellates(b)in the staged cultivation medium

连续培养结束时，各组的甲藻孢囊变化情况如图 5所示.从图中可以看出，各组的甲藻孢囊剩余丰度没有很大差异.其原因是沉积物培养12 d后，沉积物中的大部分活体孢囊都萌发了，甲藻孢囊萌发不仅受到外界环境的影响，还受到内在规律的控制(Anderson et al., 1987)，不同的培养条件只提高孢囊的萌发速率，但不能提高孢囊的最终萌发率.

图 5(Fig. 5)

图 5 连续培养萌发实验沉积物甲藻孢囊的丰度 Fig. 5 The abundance of cyst during continuous cultivation of germination experiment

将每次取出的培养液的微藻丰度与之前的进行叠加，结果为前2、4、6 d所萌发和增殖的所有微藻和甲藻的丰度情况如图 6所示.从图 6a可以看出，前2、4、6 d微藻丰度都呈现稳定上升的趋势.从图 6b可以看出，前2、4、6 d组4的甲藻丰度都最高，在前6 d时，甲藻丰度达到39 cells · mL^-1.从这组实验可以看出，20 ℃、有机磷条件下与其他组甲藻丰度有显著差异，较适宜甲藻孢囊的萌发(p<0.05)，与分段培养组中，组4在20 ℃、有机磷条件下的孢囊萌发率最高一致.

图 6(Fig. 6)

图 6 连续培养实验培养液中微藻(a)和甲藻(b)丰度分析 Fig. 6 Microscopy analysis of phytoplanktons(a) and dinoflagellates(b)in continuous cultivation medium

对比连续培养组和分段培养组实验可以看出，两组实验沉积物中的孢囊都有萌发，且上层培养液中的微藻种类相似，硅藻都占很大比例.在分段培养组的第6 d，藻类的丰度在1.18×10²~2.37×10²cells· mL^-1，连续培养组的前6 d的藻类丰度达到4.61×10²~5.13×10² cells · mL^-1，约是分段培养组的2倍.其原因是分段培养组的藻类丰度是萌发后经过种间竞争而增殖起来的数量，而连续分段培养组的藻类丰度是在取走前一次培养液添加新培养液后，重新从水体中萌发增殖累加起来的数量，使得分段培养组的藻类丰度较高.

两种方式培养，甲藻的丰度随时间均呈现上升的趋势.分段培养中甲藻丰度最高出现在第6 d的15 ℃+有机磷条件下，连续培养中甲藻丰度最高出现在20 ℃下有机磷条件下，一定程度上，低温不适宜硅藻和绿藻的增殖，因此，15 ℃更有利于甲藻在沉积物中萌发增殖并占据优势.两种培养方式均表明，有机磷有助于甲藻孢囊萌发增殖并占据优势.甲藻对磷代谢的相关基因表达和功能解析有待进一步探究.

目前的研究主要集中在对甲藻水华阶段的研究，对于淡水甲藻孢囊萌发机制的研究很少.同时，国内外大部分研究集中在无机营养盐对甲藻孢囊萌发的影响，对有机营养盐的研究较少.甲藻孢囊是甲藻生活史的一个重要阶段，本研究从对水体中甲藻浮游生长阶段的关注，延伸到对甲藻休眠阶段的研究，有望于从“源头”预警和防治甲藻水华.

西陂水库表层沉积物中的微藻丰度在1.80×10⁵~5.60×10⁵ cells · g^-1(以底泥干重计)，表层沉积物中的微藻主要以硅藻门、绿藻门为主，硅藻门占81.8%~91.8%，绿藻占6.1%~13.2%，甲藻的丰度为7.86×10²~9.76×10² cells · g^-1(以底泥干重计)，以拟多甲藻属(Peridiniopsis)为主，其他门类的藻类较少.两种不同方式的萌发增殖培养实验表明，较高的温度和有机磷条件下，能促进沉积物甲藻孢囊的萌发，提高甲藻孢囊的萌发速率，但不能提高孢囊的最终萌发率，15 ℃和以AMP作为有机磷存在时，有利于甲藻孢囊萌发增殖并占据优势.