原生动物常作为污水生物处理系统中的指示生物而受到人们的关注(Salvado et al., 1995；李朝霞等，2012；沈韫芬，1999).钟虫、累枝虫是原生动物门纤毛纲缘毛目的微小动物，其中，钟虫呈倒钟形且单体生活，柄螺旋而收缩；累枝虫形态与钟虫相似且群体生活，有分枝，柄无肌丝不收缩(Amos，1972；Wui et al., 2006).研究发现，污水处理曝气池中钟虫和累枝虫大量出现往往指示污泥性状良好，出水水质好(Holubar et al., 2000).

好氧颗粒污泥是通过微生物自凝聚作用形成的颗粒状污泥，与普通活性污泥相比，其具有良好的沉降性能、密实的结构、较高浓度的生物量、较强的冲击负荷和抵抗有毒有害物质的能力(王建龙等，2009； Liu et al., 2004； Lee et al., 2010).目前，由于SBR培养好氧颗粒污泥的试验大部分采用人工配制污水，很难提供适合原生动物生长繁殖的生存环境，使得研究人员很少在颗粒污泥表层发现大量原生动物附着的现象，因此，忽视了对好氧颗粒污泥中原生动物的研究.Weber等(2007)首先研究了在好氧颗粒污泥表层出现的纤毛类原生动物，推测其分泌的粘性物质能吸附悬浮颗粒和细菌，以及其死亡后的残骸可作为颗粒污泥形成的骨架.Li 等(2013)在SBR系统中培养出富有原生和后生动物的好氧颗粒污泥，并对其中钟虫和轮虫的形成与特征进行了研究，发现钟虫与轮虫有利于颗粒的稳定和提高出水澄清度.

通过长期研究发现，接种城市污水处理厂的活性污泥，采用实际生活污水可成功培养出表层附着大量累枝虫(纤毛纲缘毛目累枝虫属)等原生动物的好氧颗粒污泥，且能长期稳定运行.基于此，本研究旨在通过探明表层附着累枝虫的特殊好氧颗粒污泥的形成过程及其性能，为污水生物处理研究提供参考.

试验采用的序批式反应器(SBR)为高500 mm、内径200 mm、有效容积为11 L的有机玻璃圆柱.试验原水来自一个生活区排放的实际生活污水，COD_Cr为350~450 mg · L^-1，NH₄⁺-N为20~30 mg · L^-1，TP为4~8 mg · L^-1.反应器运行方式为：进水5 min，曝气180 min，沉淀3 min，出水15 min，闲置37 min. 采用时间程序控制器(PLC)自动控制反应器各阶段，每天运行6个周期，每个周期进水量与排水量均控制在7 L，排水比为7 /11.试验期间，气速基本稳定在1.2 cm · s^-1左右，室内温度保持在15~30 ℃.

混合液污泥浓度(MLSS)、污泥容积指数(SVI)、悬浮固体浓度(SS)、TP、 COD_Cr与NH₄⁺-N均依照国家环保局《水和废水监测分析方法》(第4版)进行测定.

从接种污泥到好氧颗粒污泥形成的整个过程观察采用Olympus公司的CX31型光学显微镜，每隔一定时间取反应器中的混合液进行观察并拍摄污泥照片.采用XL-30ESEM扫描电镜(Scanning Electron Microscopy，SEM)观察颗粒的微观形态，样品预处理前需经过2.5%的戊二醛在4 ℃下固定近12 h，将固定液倒掉之后用0.1 mol · L^-1、pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min.然后使用1%的锇酸溶液固定样品1~2 h，倒掉固定液后继续使用磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min.紧接着，使用浓度梯度(50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min.然后使用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(V/V=1/1)处理样品约30 min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1~2 h.经过临界点干燥和镀膜后即可进行样品的观察(Araujo et al., 2003).

原生动物的计数采用人工计数法(Al-Shahwani et al., 1991).从反应器中取部分混合液，在1 L广口瓶中充分搅匀；然后使用1 mL 的刻度吸管吸取1 mL混合液，徐徐注入一滴混合液于载玻片上并盖上盖玻片，用低倍显微镜对原生动物进行计数；重复计数3滴混合液，取其平均值，即得1滴混合液中原生动物的数量.用1滴混合液中原生动物的记录数乘以刻度吸管中1 mL混合液的滴数，即为微型生物的密度数据(即每mL活性污泥混合液的原生动物数)，密度单位为ind · mL^-1.

使用直接免疫荧光法(Mutasim et al., 2001)，通过荧光染色剂对悬浮絮体进行染色.本试验采用的荧光染色剂为异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate，FITC).首先，将FITC完全溶于二甲基亚砜溶液(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)，然后用胶头滴管将取自混合液上清液的分散絮体滴入已经溶解的FITC中，在潮湿密闭的恒温培养箱中反应5 h，染色剂完成染色，用磷酸缓冲液冲洗3次后即可用于试验.用胶头滴管吸取少量已染色的悬浮絮体滴于载玻片上，然后将活的累枝虫放置于絮体中间，通过Leica的DMI3000B荧光显微镜拍摄该种微型生物吞食前后的照片，以证明它们具有吞食能力.

颗粒污泥沉速是通过测量颗粒污泥的沉降时间来确定的(董春娟等，2006).取一容积大于 1 L 的量筒，测量其高度(h)并加满水，分别取一定量(10~20个)的各粒径范围的颗粒污泥加入量筒，测量每个颗粒污泥从量筒顶部沉降到底部所用的时间(t)，利用公式v=h/t计算沉速，多次测量取其平均值作为此粒径范围内颗粒污泥的沉降速度v(m · h^-1).颗粒污泥的粒径分布采用筛分法确定：从反应器内取一定量污泥，用水冲洗后使之依次通过孔径为2.5、2.0、1.6、1.43和1.25 mm的分样筛，然后将各个分样筛截留的颗粒污泥收集.

颗粒污泥强度的测定采用Ghangrekar等(1996)的测定方法.具体步骤为：从反应器中取出部分颗粒污泥用自来水稀释10倍，取25 mL稀释后的颗粒污泥倒入高50 cm、直径5 cm的圆形容器中沉降，收集在第1 min内沉降于容器底部的污泥颗粒，将其稀释到150 mL并放在摇床上以200 r · min^-1的速度摇5 min；然后将污泥倒入150 mL的量筒中，沉降1 min后倒出上清液；称量上清液中污泥的质量和沉降颗粒污泥的质量.将沉降颗粒污泥的质量占总污泥质量的比例定义为完整系数，污泥的完整性系数可在一定程度上表示颗粒污泥的强度，污泥完整性系数越大，则污泥颗粒强度越大.

原水来自附近生活小区化粪池出水.以当地某城市污水处理厂活性污泥作为反应器接种污泥，该活性污泥结构松散，且形态不规则.如图 1所示，初始阶段，由于反应器采用较大的选择压(沉淀时间短)，导致一些轻质絮体排出反应器，MLSS由接种时的1968 mg · L^-1降至1543 mg · L^-1.可能由于接种污泥对选择压等外部条件需要一定的适应过程及新生污泥结构较为松散且沉降性能较差的特点，污泥的SVI从接种时的106.7 mL · g^-1升至155.5 mL · g^-1.随着污泥的逐渐颗粒化，SVI不断降低.运行30 d后，污泥颗粒结构较为密实，污泥形态趋于聚集态，污泥平均粒径较小，为210 μm，污泥的SVI保持在50 mL · g^-1左右，MLSS保持在4000 mg · L^-1左右.55 d后，污泥颗粒粒径增大，累枝虫开始大量繁殖，并附着于颗粒表层.枝状累枝虫的大量存在增加了颗粒污泥的浮力，导致颗粒的沉降性能下降(Li et al., 2013)，导致部分颗粒被洗出，污泥SVI上升至70 mL · g^-1左右，MLSS降至3500 mg · L^-1左右.运行70 d后，附着大量累枝虫的颗粒污泥成为活性污泥的主要形态(图 2)，污泥颗粒化效果明显，平均粒径在1 mm左右，颗粒的沉降性能逐步改善.运行120 d后，取部分混合液通过光学显微镜观察，附着大量累枝虫的颗粒污泥平均粒径可达2 mm左右，约占颗粒总数量的90%左右，附着少量累枝虫的颗粒污泥约占10%.后期运行阶段，由于污泥颗粒粒径增大，累枝虫的影响变小，污泥SVI逐步下降至45 mL · g^-1左右，污泥浓度上升并稳定在4900 mg · L^-1左右.

图 1(Fig. 1)

图 1 好氧污泥颗粒化培养中SVI和MLSS的变化 Fig. 1 Variation of SVI and MLSS in aerobic granulation

图 2(Fig. 2)

图 2 表层附着累枝虫的好氧颗粒污泥形态图片(a.光学显微镜，×40，b.扫描电镜SEM，×60) Fig. 2 Images of the aerobic granular sludge with Epistylis adherent to the surface(a. Light microscopy，×40，b. SEM，×60)

接种的污泥来自以处理生活污水为主的城镇污水处理厂，活性污泥中存在大量累枝虫等原生动物.由于累枝虫等原生动物针对周围介质化学作用的体表保护性不完善，对环境具有很强的敏感性(关萍等，2013).因此，采用相似实际生活污水作为原水，其C、N、P的浓度环境与SBR的低负荷运行均有利于累枝虫等原生动物的生长与繁殖.原生动物分为游泳型和固着型两种，累枝虫属于常见的固着型原生动物，而反应器中较高的水力剪切力和较短的沉降时间形成较高的选择压迫使累枝虫依靠柄附着于颗粒污泥表层才不易被洗出反应器，从而成为反应器中的优势物种.这可能是形成表层附着大量累枝虫好氧颗粒污泥的主要原因.

研究表明，原生动物通过摄取污水中的悬浮物、游离细菌及分泌粘性物质促进絮凝，以减少出水SS和提高澄清度，改善出水水质(Curds et al., 1969；Kishida et al., 2010；Lee et al., 1996).

本文通过比较反应器中平均累枝虫密度和平均出水SS的变化趋势来证明累枝虫对降低出水悬浮物的作用.如图 3所示，在系统运行初始阶段，由于反应器内累枝虫的数量相对较少，且污泥颗粒化程度不高，反应器中有大量絮体污泥存在，导致出水SS居高不下，平均出水SS达到238 mg · L^-1；之后随着污泥颗粒化及累枝虫大量生长，累枝虫密度不断提高，出水SS逐步下降，第100 d左右时，累枝虫密度达到最高值33250 ind · mL^-1，出水SS降至最低值44 mg · L^-1.在前100 d运行中，反应器平均水温保持24 ℃左右.120 d后，反应器水温由于室内温度下降而下降至16 ℃，导致累枝虫世代周期延长.陈立婧等(2009)研究发现，温度是原生动物的重要生态限制因子，且大部分原生动物密度与水温呈显著正相关关系，低温会影响原生动物的增殖速率(沈韫芬等，1990).120 d后累枝虫密度逐渐下降并趋于稳定，出水SS出现小幅度上升.由图 3还可发现，出水SS与累枝虫密度变化整体呈相反的趋势，累枝虫密度增大，出水SS降低，累枝虫密度减小，出水SS上升.由此可初步推断：累枝虫通过捕食污水中细小絮体和游离细菌的方式减少出水SS，提高出水澄清度.

图 3(Fig. 3)

图 3 出水SS、水温与累枝虫密度的变化 Fig. 3 Variation of effluent SS，water temperature and Epistylis density

采用直接免疫荧光法，通过荧光染色剂对水中的游离细菌进行染色，在DMI3000B荧光显微镜下观察累枝虫对游离细菌的吞食.从图 4a可以看到被 染色发出荧光的游离细菌和未进食的累枝虫.经过8 h后，从图 4b可以看到累枝虫体内已有大量发出蓝色荧光的物质，说明累枝虫吞食了水体中悬浮的游离细菌.证明累枝虫能捕食水中游离细菌，可以减少出水SS，提高出水澄清度.

图 4(Fig. 4)

图 4 累枝虫摄食细菌(a.累枝虫与染色游离细菌，×400，b.摄食游离细菌的累枝虫，×400) Fig. 4 Images of Epistylis ingested FITC-labeled free bacteria(a. Epistylis and FITC-labeled free bacteria，×400，b. Epistylis ingested FITC-labeled free bacteria，×400)

通过比较COD_Cr与氨氮(NH₄⁺-N)的去除效果、污泥负荷率及累枝虫密度的变化趋势，可以分析累枝虫对水质造成的影响.如图 5所示，在整个反应器运行过程中NH₄⁺-N去除率变化幅度较小，且基本保持在85.0%以上，说明累枝虫对NH₄⁺-N去除效果的影响不明显.在反应器运行开始阶段，累枝虫数量很少，平均COD_Cr去除率为62.5%；随着累枝虫的大量繁殖，COD_Cr去除率开始上升，此阶段的平均COD_Cr去除率为88.1%，最高时达到95.4%，说明累枝虫在达到最高密度的同时，往往预示着良好的出水水质(Salvado et al., 1995);120 d后，累枝虫密度逐渐下降，同时COD_Cr去除率也略有下降.由此验证了Schwarzenbeck等(2004)的观点：表层生长高活性原生动物的颗粒污泥有很强的COD_Cr去除能力.分析其原因为：累枝虫可吞食悬浮游离细菌，降低出水SS进而降低出水COD_Cr(刘来胜等，2013).累枝虫能通过柄分泌粘液或者刺激性化合物，提高细菌活性(Weber et al., 2007).累枝虫等原生动物还可通过捕食作为选择压，使繁殖能力强、活性高的细菌存活下来，从而提高有机碳利用率(Zima-Kulisiewicz et al., 2009).

图 5(Fig. 5)

图 5 CODCr去除率、氨氮去除率和累枝虫密度的变化 Fig. 5 Variation of CODCr removal rate，NH4+-N removal rate and Epistylis density

通过扫描电子显微镜(SEM)观察表层附着累枝虫的颗粒污泥内、外部结构，结果如图 6a、b所示.在颗粒污泥外 表层，累枝虫的柄与丝状菌相互缠绕，并根植于颗粒内部(图 6c、d)，形成密实的“骨架”，有利于颗粒污泥的结构稳定.由于累枝虫柄分泌的粘性物质(Weber et al., 2007)可以吸附悬浮微粒和细菌(图 6b)，有利于菌胶团相互聚集，因而可促进好氧颗粒污泥形成.

图 6(Fig. 6)

图 6 颗粒污泥表层(a.×500，b.×2000)与内部断面(c.×500，d.×2000)的SEM(粒径Ø=2.00 mm) Fig. 6 Images of the surface(a. ×500，b. ×2000) and the section(c. ×500，d. ×2000)of aerobic granular sludge SEM(Ø=2.00 mm)

本文采用机理图直观表示表层附着累枝虫的好氧颗粒污泥形成过程和结构特点.由图 7可知，这种好氧颗粒污泥的形成主要经过以下3个阶段：第1阶段，累枝虫附着在污泥絮体上进行繁殖，同时累枝虫通过柄分泌对悬浮颗粒和细菌有吸附能力的粘液(Weber et al., 2007)，与EPS(Extracellular Polymeric Substances)、丝状菌等共同作用促进菌胶团的形成与聚集；第2阶段，菌胶团相互聚集，初步形成好氧颗粒污泥，且累枝虫附着在颗粒污泥表层，继续分泌粘液促进颗粒化，累枝虫柄和丝状菌成为颗粒污泥的“骨架”，有助于提高颗粒污泥结构的强度和稳定性；第3阶段，随着“骨架”的作用、菌胶团的聚集和累枝虫的繁殖，表层附着大量累枝虫的成熟好氧颗粒污泥最终形成.

图 7(Fig. 7)

图 7 表层附着累枝虫的好氧颗粒污泥形成过程 Fig. 7 Formation of granules with Epistylis adherent to the surface

通过分样筛筛选出粒径在2 mm左右的颗粒污泥若干，再通过光学显微镜区分出表层附着大量累枝虫的颗粒污泥与附着极少量累枝虫的两种颗粒污泥，分别进行颗粒强度测试和沉速试验.

污泥完整性系数可在一定程度上表示颗粒污泥的强度，污泥完整性系数越大，则说明污泥颗粒强度越大.按照强度测试分析方法处理和计算后，得出附着大量累枝虫颗粒污泥与附着极少量累枝虫颗粒污泥的完整系数分别为99.1%和97.6%，均大于97%，两种颗粒几乎无破损现象发生.相对于其他学者培养出的完整系数在90%以下的颗粒污泥(张捍民等，2010)，本研究颗粒污泥具有更好的颗粒强度.

沉速实验测得两种好氧颗粒污泥的平均沉降速度分别为55.4 m · h^-1和63.7 m · h^-1，在颗粒污泥粒径相同的情况下，附着极少量累枝虫的颗粒污泥沉速相比附着大量累枝虫的颗粒污泥可提高15.0%，说明附着颗粒表层生长的累枝虫会略微降低颗粒污泥的沉速.

1)采用实际生活污水及接种城市污水处理厂中富有累枝虫的活性污泥，通过SBR较高的水力剪切力和较短的沉降时间共同作用可培养出表层附着大量累枝虫、具有良好沉降性能和强度的好氧颗粒污泥.

2)颗粒表层的累枝虫有利于减少出水悬浮固体，提高出水澄清度，但会略微降低颗粒污泥的沉降性能.

3)根植于颗粒污泥的累枝虫柄可以成为颗粒污泥的“骨架”，有利于颗粒污泥的形成及结构强度和稳定性的提高.