煤矿或各种有色金属矿在开采与选冶过程中，常使与矿层伴生的硫铁矿暴露于空气与地下(表)水中，经系列化学与生物氧化过程，使得近中性的地下水转变为低pH、高Fe、高SO^2-₄的富铁富硫酸盐体系-酸性矿山废水(Acid mine drainage，AMD)(杨艳等，2010；Cui et al., 2012；Torres et al., 2013).AMD若未经有效处理而进入环境，将严重污染地表水及土地资源，进而对农产品安全、水生生物与人体健康产生一定的威胁(赵晋宁等，2013；Truter et al., 2014).目前，AMD治理的主要方法为石灰中和法(Herrera et al., 2007；杨树亮，2013).然而，由于AMD体系中Fe以Fe²⁺与Fe³⁺的形式存在，同时，Fe(OH)₂的离子浓度积(1.6×10^-14，18 ℃)远大于Fe(OH)₃的离子浓度积(1.1×10^-36，18 ℃).因此，在采用中和法处理AMD之前，将体系中的Fe²⁺全部转化为Fe³⁺可以有效地节省工程运行成本.研究表明，利用氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans)生物氧化Fe²⁺进而合成施氏矿物或黄铁矾类等次生铁矿物(刘奋武等，2013；Samborska et al., 2013；Zhu et al., 2013)，不仅可以有效地将AMD体系中的Fe²⁺完全转化为Fe³⁺，同时对去除体系中Fe与SO^2-₄有重要意义，具体反应方程式如下：

A. ferrooxidans生物氧化Fe²⁺至Fe³⁺，Fe³⁺进而水解产生次生铁矿物与化学中和相结合在AMD治理领域表现出一定的应用潜力(王敏等，2013)，而如何提高体系的Fe²⁺氧化率与总Fe沉淀率亦成为此工艺中AMD高效治理的关键环节.研究表明，K⁺、Na⁺及NH₄⁺作为反应离子均可参与次生铁矿物黄铁矾的合成，且K⁺的成矾能力相对最强(Gramp et al., 2008).当体系铁离子浓度为160 mmol · L^-1，K⁺浓度为1.6 mmol · L^-1时，体系中就有黄铁矾物质产生(Bai et al., 2012).然而，有关K⁺对体系中Fe²⁺氧化率的影响研究却鲜见报道.同时，次生铁矿物合成是一个产生H⁺的过程，如果在体系中引入一定量的OH^-，是否可以使得矿物合成反应向正反应方向移动，进而提高体系总Fe沉淀率？OH^-对体系Fe²⁺氧化率又将产生何种影响？此外，KOH加入对富铁富硫酸盐体系生物成因次生铁矿物矿相及组成的影响亦不得而知.鉴于此，本研究在富铁富硫酸盐体系-改进型9K液体培养基(铁离子浓度为160 mmol · L^-1)中，分析KOH对氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans)催化合成次生铁矿物过程中体系pH、Fe²⁺氧化率、总Fe沉淀率及次生铁矿物矿相与组成的作用效果，以期从K⁺与OH^-两个层面探究KOH对次生铁矿物合成的影响.

将本实验室保藏的A. ferrooxidans LX5(CGMCC No.0727)(Liu et al., 2012)菌株接种于150 mL改进型9K液态培养基(FeSO₄ · 7H₂O 44.24 g、(NH₄)₂SO₄ 3.0 g、KCl 0.10 g、K₂HPO₄ 0.50 g、Ca(NO₃)₂ · 4H₂O 0.01 g、MgSO₄ · 7H₂O 0.50 g，去离子水1 L)中，用H₂SO₄调节pH至2.5，然后将混合液置于180 r · min^-1往复式振荡器(ZD-85A恒温振荡器)中于28 ℃培养2~3 d至体系Fe²⁺氧化完全.培养液经定性滤纸过滤后，将15 mL滤液接种于135 mL改进型9K液态培养基中，重复培养.待体系Fe²⁺再次氧化完全后，培养液经定性滤纸过滤，滤液即为本研究后续次生铁矿物合成的接种菌液.用双层平板法(王世梅等，2005)对体系A. ferrooxidans LX5进行计数，得知接种菌液中A. ferrooxidans LX5浓度约为10⁷ cells · mL^-1.

分别将15 mL的A. ferrooxidans LX5菌液接种于15个250 mL三角瓶中，加入浓缩10倍的改进型9K液体培养基15 mL，然后补充去离子水至溶液总体积为150 mL.用H₂SO₄将上述不同体系pH调至2.50，8层纱布封口.将混合液在28 ℃、180 r · min^-1条件下振荡培养，培养至12 h时：①从中任意选取3个摇瓶体系作为对照(CK)处理，②从中任意选取3个摇瓶体系，加入0.5 mol · L^-1 KOH 溶液1 mL，即KOH在总体系的浓度为3.3 mmol · L^-1，记为CK+3.3 mmol · L^-1处理；同理，在其它任意3个摇瓶中，分别加入1 mol · L^-1 KOH、2 mol · L^-1 KOH或0.5 mol · L^-1 K₂SO₄溶液各1 mL，分别记为CK+6.7 mmol · L^-1 KOH、CK+13.4 mmol · L^-1 KOH及CK+3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄处理.需要说明的是，由于对照体系9K液体培养基中Cl^-或NO^-₃浓度相对较低，分别仅为1.34或0.04 mmol · L^-1，为了不大幅增加体系Cl^-或NO^-₃浓度进而对微生物生长产生不可预见影响，本研究不采用KCl或KNO₃，而用K₂SO₄引入K⁺.此外，对照体系9K液体培养基中SO^2-₄浓度高达180 mmol · L^-1，因此，本研究中3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄的加入对体系SO^2-₄浓度的贡献几乎可以忽略.每个处理设置3个重复.补充KOH与K₂SO₄后，将混合液继续振荡培养，每12 h动态监测体系pH值，且从体系均匀取样1 mL，过0.45 μm滤膜，测定滤液Fe²⁺及总Fe浓度，进而计算Fe²⁺氧化率及总Fe沉淀率.体系培养液取样过程在无菌操作台内进行.培养72 h 后将体系产生的矿物沉淀用定性滤纸收集，先用酸化的去离子水(pH=2.0)洗3次，再用去离子水洗涤2次后，在50 ℃环境中烘干(李浙英等，2011)，测定次生铁矿物中总Fe的含量，观察次生铁矿物形貌并分析矿物的矿相.

溶液pH用PHS-3C型酸度计测定，Fe²⁺与总Fe浓度使用可见分光光度计(722-E型)利用邻菲罗啉比色法测定(Zhu et al., 2013).Fe²⁺氧化率为体系中Fe³⁺浓度占总Fe浓度的百分数，某时刻总Fe沉淀率D=(C₀-C_t)/C₀×100%，其中，C₀和C_t分别为初始体系总Fe浓度和某时刻体系总Fe浓度(刘奋武等，2013).矿物矿相用X射线衍射仪(XRD，MiniFles II，日本理学)测定，测试工作条件为：管电压30 kV，管电流15 mA，扫描区间10~70°(2θ)，步长0.02°，Cu靶(弯晶单色器)(柏双友等，2010).次生铁矿物形貌采用热场发射扫描电子显微镜(SEM，JSM-7001F)进行直接观察，加速电压5.0 kV，工作距离(样品表面到物镜的距离)9.7 mm(刘奋武等，2014).本研究在次生铁矿物SEM分析过程中，未经过磷酸盐缓冲液清洗、戊二醛固定、乙醇梯度洗脱、离子溅射仪镀膜等相关处理过程，因此，在SEM图像视野中观察不到附着于矿物表面的微生物形态.将0.05 g次生铁矿物用20 mL浓硫酸溶解，根据溶解液中总Fe浓度间接获得次生铁矿物中总Fe含量(Huang et al., 2012).

生物合成次生铁矿物过程中，A. ferrooxidans氧化Fe²⁺至Fe³⁺是导致体系pH上升的过程，而Fe³⁺水解产生次生铁矿物可降低体系pH值(Liu et al., 2012).本研究中，对照体系及加入KOH或K₂SO₄的处理体系pH变化情况如图 1所示.

图 1(Fig. 1)

图 1 KOH 对A. ferrooxidans催化合成次生铁矿物体系pH变化的影响 Fig. 1 Effect of KOH on pH changes during secondary iron minerals synthesis by A. ferrooxidans

从图 1可以看出，A. ferrooxidans在改进型9K液体培养基中培养12 h，体系pH 从原始的2.50 增加至2.64.此时，在任意4个体系分别加入3.3、6.7、13.4 mmol · L^-1 KOH与3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄，体系pH分别为2.73、2.78、2.90与2.64，剩余体系即为纯改进型9K液体培养基对照体系.在12~24 h的培养过程中，对照体系与加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系pH分别从12 h时的2.64逐渐增加至24 h时的2.71与2.73. 加入6.7与13.4 mmol · L^-1 KOH的处理体系，pH分别从12 h时的2.78与2.90降低至24 h时的2.66与2.60.加入3.3 mmol · L^-1 KOH，处理体系在24 h时的pH(2.72)与12 h时几乎一致.在24~72 h的培养过程中，各体系pH均呈现出逐渐下降的趋势，然而下降幅度却不尽相同.例如，对照体系在24~72 h培养过程中，pH从2.71降低至2.34，而加入3.3、6.7、13.4 mmol · L^-1 KOH与3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄的处理体系，pH分别从2.72、2.66、2.60与2.73下降至2.27、2.15、2.10与2.22.上述结果表明，体系中KOH的加入可以在一定程度上加速体系的酸化进程.笔者认为造成这一现象的主要因素有两个方面：首先，K⁺的引入促进了次生铁矿物黄铁矾的形成，进而加速体系的酸化速度，这一推论在本研究中加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄的处理体系得到较好的证实，柏双友等(2010)同样研究证实，K⁺浓度的增加可以明显促进体系黄铁矾等次生铁矿物的合成；其次，在12 h时虽然OH^-的加入可在瞬时提高体系pH，然而其在后期却可以中和矿物合成过程生成的产物H⁺，加速Fe³⁺水解成矿反应式向正反应进行，大量生成次生铁矿物及H⁺，进而加速体系酸化速度.同时，加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄与6.7 mmol · L^-1 KOH两处理体系的pH变化可以为这一推断提供有力的佐证，即虽然两体系K⁺离子浓度相同，然而OH^-的加入使得体系pH进一步降低.

次生铁矿物生物合成过程中Fe²⁺氧化速率的快慢可以间接反映体系A. ferrooxidans的活性(谢鑫源等，2013；宋永伟等，2013).本研究中，对照体系及加入KOH或K₂SO₄的处理体系Fe²⁺氧化率变化情况如图 2所示.

图 2(Fig. 2)

图 2 KOH 对A. ferrooxidans催化合成次生铁矿物体系Fe2+氧化率的影响 Fig. 2 Effect of KOH on Fe2+ oxidation rate in secondary iron minerals synthesis by A. ferrooxidans

本研究5个体系中，A. ferrooxidans在改进型9K液体培养基中培养12 h，体系Fe²⁺氧化率均分别增加至20%左右.此时，部分体系中加入的KOH与K₂SO₄对体系Fe²⁺浓度并无较大影响.然而在后期的培养过程中，不同体系Fe²⁺氧化率变化趋势却呈现出较大差异.例如，培养至24 h，对照处理Fe²⁺氧化率为55.2%，而加入3.3、6.7、13.4 mmol · L^-1 KOH与3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系的Fe²⁺氧化率分别为61.9%、66.4%、68.0%及58.4%，较对照体系分别提高了12.1%、20.3%、23.2%及5.8%.同理，培养至36 h，加入3.3、6.7、13.4 mmol · L^-1 KOH与3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系的Fe²⁺氧化率较对照体系分别提高了8.2%、11.2%、13.2%及8.0%.可见，任意时刻，加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系中Fe²⁺氧化率要高于对照体系，而加入6.7 mmol · L^-1 KOH体系中Fe²⁺氧化率却高于加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系.综合分析可以得出，虽然不同体系Fe²⁺均能在48 h氧化完全，然而，K⁺或OH^-的加入均能够在一定程度上加速Fe²⁺的氧化.笔者认为，这一现象可以从次生铁矿物合成反应方程式来分析.虽然次生铁矿物的合成过程包括Fe²⁺氧化与Fe³⁺水解成矿两步反应，然而从化学角度上，可将其合并为一个反应方程式(以黄钾铁矾生成为例)：

因此，OH^-的加入可以降低生成物H⁺的浓度，而K⁺的加入却可以增加反应物K⁺的浓度，使得上述方程式向正反应方向移动，进而可以在一定程度上促进Fe²⁺的氧化.王雅琴等(2010)在9K液体培养基中培养A. ferrooxidans时发现，初始pH ~3.0体系矿物产生量约为pH ~2.5体系的8倍，部分微生物在矿物合成过程中充当晶种角色而被次生铁矿物包裹，使得pH ~3.0体系游离微生物数量仅为pH ~2.5体系的75%，进而使得pH ~3.0体系Fe²⁺氧化速率由于微生物数量减少而减弱.本研究结果中，随着3.3~13.4 mmol · L^-1的KOH加入，体系pH逐渐增加至2.73~2.90，与前人研究相类似，体系总Fe沉淀率随着pH升高而增加.然而Fe²⁺氧化率却并未随着矿物产生量增加而降解，相反，却有一定程度的提高.可见，在本研究中促进体系Fe²⁺氧化率提高的因素并不是由于体系游离微生物菌体数量的增加而加速Fe²⁺氧化，而可能是K⁺或OH^-推动次生铁矿物反应方程式向正反应进行的结果.综合分析前人相关研究结果及本实验相关结论，可进一步得知，当体系pH>2.5时，体系pH~3.0是体系Fe²⁺氧化率随pH升高而降低或升高的分界点.

次生铁矿物生物合成过程中总Fe沉淀率的快慢可以间接表征体系矿物的合成速率及合成量(Nurmi et al., 2010；刘奋武等，2013).本研究中，对照体系及加入KOH或K₂SO₄的处理体系总Fe沉淀率变化情况如图 3所示.

图 3(Fig. 3)

图 3 KOH 对A. ferrooxidans催化合成次生铁矿物体系总Fe沉淀率的影响 Fig. 3 Effect of KOH on total Fe precipitation rate in secondary iron minerals synthesis by A. ferrooxidans

从图 3可以得出，0~12 h的培养过程中，由于5个体系同处于改进型9K培养基中，故总Fe沉淀率几乎一致，约为5.2% ±1.0%.然而，后续培养过程中，KOH的加入可以显著增加体系总Fe的沉淀去除率.对照体系总铁沉淀率在0~72 h培养过程中几乎呈现线性增加趋势，从0逐渐增加至27.3%.与Fe²⁺氧化率变化趋势相类似，K⁺与OH^-的加入均能够提高体系总Fe沉淀率.例如，加入3.3、6.7、13.4 mmol · L^-1 KOH及3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系，总Fe沉淀率在72 h时分别达到34.4%、43.8%、46.9%与36.1%，较对照体系分别增加了26.0%、60.4%、71.8%与32.2%.与前述讨论结果相类似，笔者认为，造成这一现象的主要原因是K⁺与OH^-的加入可以有效促进次生铁矿物化学反应方程式向正反应方向移动，进而提高总Fe的沉淀效率.同时，通过比较加入6.7 mmol · L^-1 KOH或3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄处理体系各指标的变化情况，可以进一步得出，KOH的加入能够明显使得体系pH降低，Fe²⁺氧化率与总Fe沉淀率增加是K⁺与OH^-联合作用的结果.同时，需要说明的是，当体系中KOH加入量大于6.7 mmol · L^-1时，体系总Fe沉淀率随KOH加入而提高的幅度逐渐减弱.例如，KOH加入量从0 mmol · L^-1增加至6.7 mmol · L^-1时，体系总Fe沉淀率从27.3%增加至43.8%，而当KOH加入量从6.7 mmol · L^-1提高至13.4 mmol · L^-1时，体系总Fe沉淀率仅从43.8%增加至46.9%.

X射线衍射图谱(XRD)常被用来鉴别矿物矿相(柏双友等，2011).本研究中，对照体系及加入KOH或K₂SO₄的处理体系矿物X衍射图谱如图 4所示.

图 4(Fig. 4)

图 4 不同生物合成次生铁矿物体系矿物X射线衍射图谱 Fig. 4 XRD patterns of minerals in different biogenic secondary iron minerals systems

从图 4可以看出，各体系所得矿物XRD衍射图谱近似一致.经Jade5.0软件寻峰分析，根据JCPDS(2002)所提供卡片中晶型黄铁矾类物质(黄钾铁矾：No.22-0827；黄铵铁矾：No.26-1014)与非晶型施氏矿物(No.47-1775)的标准衍射图谱进行分析，可以得出，本研究5个次生铁矿物合成体系所得矿物衍射图谱中主要包含黄铁矾的特征尖锐衍射强峰(2θ=17.41°、29.55°、39.37°、45.86°及49.93°)(Wang et al., 2006；刘新锋等，2011)及相对微弱的施氏矿物特征衍射弱宽峰(2θ=35.16°)(Eskandarpour et al., 2008；柏双友等，2011).换言之，所有体系产生的次生铁矿物均为黄铁矾与施氏矿物共存的混合物.这一推断在不同体系所得矿物SEM照片中可得到较好的证实(图 5).从图 5可以观察到，本研究中无论在次生铁矿物生物合成体系是否加入KOH或者K₂SO₄，体系所得矿物均由一类晶型矿物与一类非晶型矿物混合组成.

图 5(Fig. 5)

图 5 不同生物合成次生铁矿物体系所得矿物颜色与扫描电镜照片 Fig. 5 Colour and SEM of minerals harvested from different biogenic secondary iron minerals systems

值得一提的是，虽然KOH或K₂SO₄的加入并没有改变体系次生铁矿物的矿相种类，不同体系次生铁矿物均为黄铁矾与施氏矿物的混合物，然而不同体系黄铁矾类物质与施氏矿物的相对含量却不尽相同.本研究中，对照(CK)、加入3.3、6.7、13.4 mmol · L^-1 KOH与3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系所得次生铁矿物中总Fe含量分别为42.3%、37.3%、34.7%、34.2%及36.5%.前人研究发现，次生铁矿物所呈现出的颜色与矿物含铁量有一定关系，即矿物铁含量较高时，矿物颜色呈现红棕色，当矿物中铁含量逐渐降低时，矿物逐渐呈现黄色(Gramp et al., 2008；王敏，2012).与前人研究结果相类似，本研究对照处理体系中，矿物含Fe量为42.3%，次生铁矿物颜色表现为红棕色；而加入KOH或K₂SO₄处理体系，矿物含Fe量存在不同程度的降低，矿物颜色逐渐向黄色转变(图 5).此外，本研究发现，K⁺加入量相同的情况下，与加入K₂SO₄体系相比较，加入KOH体系所得次生铁矿物含铁量进一步降低，矿物呈现出来的黄色更为明显.例如，加入6.7 mmol · L^-1 KOH体系合成的次生铁矿物含Fe量为34.7%，而加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄体系产生的次生铁矿物含Fe量却为36.5%.黄铁矾(K，Na，NH₄，H₃O)Fe₃(SO₄)₂(OH)₆中总Fe含量约为33%~35%，而施氏矿物总Fe含量却高于50%(刘奋武等，2013).相关研究表明，生物成矿体系会先形成亚稳态的前驱相，在受控条件下逐步转化为稳定的结晶相(颜杨等，2011).本研究中施氏矿物为亚稳态矿物，而黄铁矾却是典型的晶型矿物，结合上述结果可以得出，KOH引入的K⁺与OH^-均可有效促进体系初始合成的施氏矿物向后期黄铁矾类物质转化.前人研究结果对这一结论亦给予了较好的佐证.例如，朱长见等(2005)研究证实，矿物表面微区内Fe³⁺供应速率增加，可加速体系黄铁矾类物质的结晶过程.前已述及，本实验中KOH引入的K⁺与OH^-均可在一定程度上加速体系Fe²⁺氧化，可在一定程度上提高矿物表面微区Fe³⁺供应速率，故其可有效促进体系施氏矿物向黄铁矾类物质转化.从图 5亦可以观察到，加入3.3 mmol · L^-1 K₂SO₄处理体系所得次生铁矿物SEM照片视野中施氏矿物较对照处理大幅减少，而在6.7 mmol · L^-1 KOH处理体系得到的次生铁矿物SEM照片视野中几乎均为黄铁矾物质.

富铁富硫酸盐体系中加入KOH引入的K⁺与OH^-均可提高生物合成次生铁矿物过程中Fe²⁺氧化率及总Fe沉淀率.当KOH加入量大于6.7 mmol · L^-1时，随KOH继续加入，体系总Fe沉淀率的提高幅度逐渐减弱.当KOH加入量低于13.4 mmol · L^-1时，体系所得次生铁矿物均为黄铁矾与施氏矿物共存的混合物，然而，KOH引入的K⁺与OH^-均可有效促进体系初始合成的施氏矿物向后期黄铁矾类物质转化，进而有利于晶型黄铁矾矿物的合成.本研究结果可为次生铁矿物合成及其在酸性矿山废水治理领域的应用提供必要的参数支撑.