2014, Vol. 34
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2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049
多溴联苯醚(PBDEs)是一种重要的阻燃剂，在产品的制造过程中添加到复合材料中去，例如，纺织品、家具、汽车、电脑和其他一些电子产品(Eens et al., 2013)，已有研究说明了多溴联苯醚的毒性效应，包括肝脏毒性、致癌性、神经毒性、免疫毒性、细胞毒性和内分泌干扰效应等(Ji et al., 2013a，2013b;de Wit，2002; Usenko et al., 2011; Dingemans et al., 2007; Birnbaum and Hubal， 2006; Branchi et al., 2003; Barber et al., 2006; Jin et al., 2010; Jiang et al., 2009).BDE-47是多溴联苯醚最重要的同系物之一，并且存在于很多环境介质中，如水、大气、土壤、牛奶、鱼和人体等(Christensen et al., 2002；Jaward et al., 2004；Bi et al., 2006；Inoue et al., 2006；Duan et al., 2010).有关BDE-47的毒理效应已有文献报道，但大都集中在藻类、大型蚤、斑马鱼和小鼠等研究对象上(Usenko et al., 2011；Chen et al., 2012；熊勤犁等，2013；张鑫鑫等，2013)，而对土壤动物的研究鲜有报道.
蚯蚓处于土壤生态系统食物链的顶端，与土壤中的各种污染物密切接触，可以作为土壤动物区系的代表类群而被用于指示、监测土壤污染(高岩和骆永明，2005).在土壤中，蚯蚓对PBDEs具有明显的富集作用(Gaylor et al., 2013; Shang et al., 2013).由于赤子爱胜蚓生命周期短以及容易被培养的特点，成为毒理试验中应用最为广泛的指示物种(OECD，1984).目前，国内外学者以蚯蚓为试验物种，研究了2，2′，3，4，4′-五溴联苯醚(BDE-71)、十溴联苯醚(BDE-209)等多溴联苯醚同系物的生态生理毒性(朱淑贞等，2010；Xie et al., 2011).目前，关于BDE-47对蚯蚓的毒性研究只有零星的文献报道，以水生寡毛类单孔蚓为受试生物，研究发现水生寡毛类单孔蚓8周的半数致死浓度为2.311 g · kg-1(Chiu et al., 2012).以溶液为培养基质研究了BDE-47对赤子爱胜蚓在渗透压调节、能量代谢、细胞凋亡、氧化胁迫以及干扰蛋白质合成等方面的毒性效应(Ji et al., 2013a).
过氧化氢酶(CAT)作为生物体内重要物质，与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)共同组成了生物体内活性氧防御系统，其主要功能是参与活性氧代谢过程.在环境胁迫等逆境情况下，减少或者阻止生物体内自由基增多，防止细胞膜产生过氧化和细胞膜的破坏和损伤(Blokhina et al., 2003；张坤生和田荟琳，2007；Gao et al., 2008).谷胱甘肽转移酶(GST)是生物体内重要的解毒酶，它可催化谷胱甘肽(GSH))巯基与一些亲电子化合物结合，保护DNA及一些蛋白质免受损伤(姚艳霞等，2008；Xue et al., 2009).过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽转移酶(GST)易于被氧化应激反应诱导，并且这些酶的活性水平可以量化细胞内的氧化应激反应(Van der Oost et al., 2003).mRNA表达水平代表特定时刻细胞的活性水平，基因表达水平的研究是蛋白检测的有效补充说明(Olsvik et al., 2005).有很多实例表明单个基因表达水平是指示动物受到胁迫的有效指标(Bustin，2000).同时测定污染物对生物mRNA表达水平和相应蛋白水平或者酶活性的研究设想在2005年就已提出(Olsvik et al., 2005).
本文在已有BDE-47预试验研究的基础上，确定了BDE-47非致死浓度，通过BDE-47亚急性试验，以人工土壤为培养基质，研究了BDE-47对赤子爱胜蚓抗氧化酶(过氧化氢酶CAT)、代谢酶(谷胱甘肽转移酶GST)以及二者基因表达水平的影响，以期为BDE-47的生态生理毒性及土壤生态风险评价提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 供试动物赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)购自北京润丰蚯蚓养殖场.选用2~3月龄，体重0.35~0.45 g，生殖带明显且无损伤的成熟个体.
2.1.2 主要试剂2，2′，4，4′-四溴联苯醚(2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether)(CAS NO. 5436-43-1，纯度99.5%)购自Chem Service公司(美国)；正己烷(分析等级)购自国药集团.
2.2 暴露方法本实验人工土壤采用OECD Guideline No.207标准(OECD，1984)，其成分比例是：石英砂70%，高岭土20%，草炭10%，去离子水调节人工土壤湿度为35%，pH为6.0 ± 0.5.将一定量的BDE-47溶解在25 mL正己烷中，然后将该溶液均匀拌入人工土壤中，使各处理BDE-47浓度(以干重计，下同)为：0、10、50、100、200 mg · kg-1，置于通风橱中使得正己烷完全挥发干净.暴露试验前，赤子爱胜蚓在人工土壤中驯养24 h，且用去离子水清洗干净后置于放有潮湿滤纸的培养皿中(黑暗环境、(20 ± 1)℃、24 h)，去除消化系统内容物.每个处理设置4个重复，每个重复挑选10条符合条件的蚯蚓放入装有750 g人工土的1000 mL烧杯中，放置于人工气候箱中(人工气候箱控制条件：温度(20±1)℃，湿度83%±3%，光照400~800 lx)，24 h连续光照培养.亚急性暴露实验时长为42 d，分别在14 d、28 d、42 d取样进行酶活性和基因表达水平的测定.在培养的过程中，分别每隔6 d补充1次水分，并且从14 d开始每隔6 d补充1次牛粪以供蚯蚓生长需要，每条蚯蚓添加0.5 g干牛粪.
2.3 酶活测定从每个重复中随机挑选一条蚯蚓，用去离子水清洗干净后置于放有潮湿滤纸的培养皿中(黑暗环境、(20 ± 1)℃、24 h)，去除消化系统内容物，立即放在液氮中研磨.加入4 mL Tris缓冲液(100 mmol · L-1，pH 7.5)，在4 ℃、12000 r · min-1下匀浆1 min(Ultra-Turrax T25匀浆机)，匀浆液用高速冷冻离心机在850 g、4 ℃下离心30 min(Allegra TM X-22R离心机)，取上清液用于测定CAT、GST活性.
酶液蛋白含量采用Bradford制定的考马斯亮蓝法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白(Bradford，1976).CAT酶活性的测定原理是测定在240 nm处过氧化氢分解导致的吸光度的变化(Claiborne，1985; Saint-Denis et al., 1998)，试验条件：67 mmol · L-1 Tris缓冲液，pH 7.4，15 mmol · L-1 H2O2和100 μg 蛋白样品，3 mL反应体系.GST酶活性的测定原理是测定在340 nm处还原型谷胱甘肽和1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)反应生成的联合体的浓度随反应时间的变化(Habig et al., 1974; Saint-Denis et al., 1998)，试验条件：100 mmol · L-1 Tris缓冲液，pH 7，2 mmol · L-1 GSH，1 mmol · L-1 CDNB和100 μg 蛋白样品，3 mL反应体系.
2.4 基因表达水平测定蚯蚓样品的准备与酶活测定中蚯蚓样品前处理相同.蚯蚓全RNA提取采用Trizol法，用琼脂糖凝胶电泳(2%)检测提取的RNA的纯度和完整度，蚯蚓总RNA的A260/A280值介于1.8~2.0.总RNA经RNase-Free DNase(Fermentas，加拿大)处理纯化后，取1 μg总RNA，采用逆转录酶合成cDNA.
选用实时定量PCR试剂盒(TaKaRa，日本)，反应体系总体积20 μL，成分如下：2.0 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL(10 mmol · L-1)，10 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)*2和6.8 μL ddH2O.仪器选用7300 Real-Time PCR system(ABI，美国)，PCR反应程序如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸采集荧光信号45 s，40个循环；溶解曲线反应程序依照软件自动设定.
内参基因β-actin和目的基因CAT引物设计参照已发表文献(Chen et al., 2011)，β-actin(登录号GU177854)上游引物：5′-TCCATCGTCCACAGAAAG-3′，下游引物：5′-AAATGTCCTCCGCAAGCT-3′；CAT(登录号GU177857)上游引物：5′-CATTGCGG ATGG AAACTA-3′，下游引物：5′-CCAAGGACAACAACC TGCTC-3′.根据GenBank发表的蚯蚓GST序列(登录号HQ693699)设计扩增GST基因片段的引物，上游引物：5′-ATGCCATTCTGCGCTACGTTGC-3′，下游引物：5′-TCCGGCGCCTCCTTGATTTTC-3′.
通过标准曲线求得斜率，根据方程式E =(10-1/slope)-1求得实时定量PCR的扩增效率(E)分别为：β-actin，0.997，R2=0.999；CAT，0.988，R2=0.997；GST，0.994，R2=0.999.基因表达水平采用以下方程式进行计算：R=(ETg)CPTg/(Eact)CPact，其中，Tg表示目的基因，act表示内参基因(Pfaffl，2001;Brulle et al., 2006).
2.5 数据处理在满足正态分布(Shapiro-Wilk test)和方差齐次(Levene′s test)的前提下，采用单因素方差分析(ANOVA)，多重比较采用LSD，与对照比较时p<0.05为显著性差异.所有统计均采用SPSS18.0软件完成，绘图采用Origin8.6完成.
3 结果(Results) 3.1 BDE-47对蚯蚓体内CAT、GST活性的影响在各个暴露时间阶段，蚯蚓体内CAT、GST活性随BDE-47暴露浓度增加的变化情况如图 1所示，蚯蚓暴露于BDE-47污染的土壤中，与对照组相比，第14 d和28 d时，各处理组的CAT活性都出现了明显诱导效应，42 d中各处理组CAT活性变化不明显.第14 d时，10 mg · kg-1处理组与对照组相比CAT活性出现急剧增强的现象，达到最大值，随着BDE-47暴露浓度的增大，CAT活性呈现下降的趋势，100 mg · kg-1和200 mg · kg-1处理组与10 mg · kg-1处理组相比，CAT活性有极显著差异(p<0.01)，50 mg · kg-1处理组与100 mg · kg-1处理组相比，CAT活性差异显著(p<0.05).第28 d时，各BDE-47处理组与对照组相比，CAT活性明显增强，差异显著.至第42 d时，随着暴露时间的增加，CAT活性逐渐下降至对照组水平，各BDE-47处理组与对照组相比均无显著差异.与对照组相比，暴露第14 d时的10 mg · kg-1、50 mg · kg-1处理组和第28 d时的全部浓度处理(10、50、100、200 mg · kg-1)，其活性显著高于对照组，分别为对照组的1.92(p=0.0004)、1.5(p=0.028)、1.45(p=0.026)、1.63(p=0.004)、1.64(p=0.003)、1.56(p=0.008)倍.
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| 图 1 BDE-47暴露对蚯蚓CAT、GST活性的影响 Fig. 1 Effects of BDE-47 on CAT and GST activities of earthworms(Eisenia fetida) |
研究结果显示，在各个暴露阶段，处理组与对照组相比，GST活性随暴露时间的变化不存在显著性变化.第14 d时，各处理组的GST活性高于对照组，10 mg · kg-1处理组GST活性最大，BDE-47对蚯蚓GST活性呈现诱导效应.第28 d时，各处理组的GST活性低于对照组，随着BDE-47暴露浓度的增大，GST活性逐渐降低，呈现抑制效应.第42 d时，各处理组GST活性围绕对照组水平波动，没有明显的变化规律.
3.2 BDE-47对蚯蚓体内CAT、GST基因表达水平的影响在各个暴露时间阶段，蚯蚓体内CAT、GST基因表达水平随BDE-47暴露浓度增加的变化情况如图 2所示，蚯蚓暴露于BDE-47污染的土壤中，在不同的暴露时间，CAT基因表达水平与BDE-47暴露浓度之间剂量-效应关系不明显(p>0.05).第14 d时，各处理组与对照组相比，CAT基因表达水平下调(除10 mg · kg-1外)，200 mg · kg-1处理组基因表达降到最低水平(对照组的0.15倍，p=0.006)，10 mg · kg-1处理组与其他处理组相比，都具有显著性差异(p<0.05).第28 d时，各处理组CAT基因表达水平围绕对照组上下波动，100 mg · kg-1处理组CAT基因表达水平上调至对照组的2.29倍(p=0.018)，同时与其他处理组也有显著性差异，分别为10 mg · kg-1(p=0.009)，50 mg · kg-1(p=0.04)，200 mg · kg-1(p=0.011).第42 d时，随BDE-47暴露浓度的增加，各处理组CAT基因表达水平呈现先下调后上调的趋势，但变化无显著性差异.
随BDE-47暴露时间的增加，在不同暴露时间阶段，对照组GST基因表达水平保持稳定.暴露初期第14 d，各处理组与对照组相比，GST基因表达水平明显上升：10 mg · kg-1(2.69倍，p=0.017)和100 mg · kg-1(2.55倍，p=0.049)处理组均明显高于对照组.第14 d时，10 mg · kg-1处理组与50 mg · kg-1(p=0.012)和200 mg · kg-1(p=0.04)处理组以及50 mg · kg-1处理组与100 mg · kg-1处理组(p=0.034)相比，差异显著.第28 d时，随BDE-47暴露浓度的增加，各处理组GST基因表达水平呈现先上调后下调的趋势，100 mg · kg-1(9.17倍，p=0.002)处理组达到最大值，与其他处理组相比也具有显著性差异：10 mg · kg-1(p=0.001)，50 mg · kg-1(p=0.047)，200 mg · kg-1(p=0.01).在BDE-47暴露的时间序列上，可以看到10 mg · kg-1处理组在第14 d时达到最大值，50 mg · kg-1和100 mg · kg-1处理组在第28 d时达到最大值，200 mg · kg-1处理组在第42 d时达到最大值.说明GST基因表达水平的变化对较低毒性的BDE-47处理组反应更为迅速，能在较短时间内响应较低浓度BDE-47处理组对机体的危害，在较高浓度的BDE-47的毒性下则需要较长的时间来响应.
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| 图 2 BDE-47暴露对蚯蚓CAT、GST基因表达水平的影响 Fig. 2 Effects of BDE-47 on CAT and GST gene expression levels of earthworms(Eisenia fetida) |
| 表 1 各处理组蚯蚓体内CAT和GST基因表达水平的倍数关系及显著性(与对照组相比) Table 1 Multiple relationship(in comparison with controls) and p values for gene expression levels of CAT and GST |
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PBDEs在生物体内的代谢过程中可诱发活性氧的产生，并且引起相关酶活性的诱导或者抑制，其中已有以赤子爱胜蚓为研究对象的文献报道.BDE-71对赤子爱胜蚓CAT活性的影响，在低毒时呈诱导效应，高毒时呈抑制效应(朱淑贞等，2010).BDE-209对赤子爱胜蚓的毒性效应，在0~10 mg · kg-1范围内，随着浓度的提高，羟自由基(·OH)的浓度显著增大，CAT活性显著增强，GST活性先上升后下降并且具有显著性差异(Xie et al., 2011).
研究表明CAT活性在第14 d时和第28 d时呈现出诱导效应，并且在相同的BDE-47浓度条件下，随着BDE-47暴露时间的延长，CAT的活性激活程度下降，直至第42 d时各处理组CAT活性围绕对照组水平上下波动.铜离子污染对蚯蚓CAT活性的毒性效应，从14 d开始观察至实验结束呈现先上升后下降，最后趋于与对照组水平相同的变化趋势(赵丽等，2011).土壤低剂量荧蒽对蚯蚓GST活性的毒性效应在14 d是呈现诱导效应(张薇等，2007).上述研究结果与本研究结果类似，虽然物质间性质有差异，可能蚯蚓面对氧化应激胁迫，有相同的CAT响应机制.GST活性没有显著性变化.亚致死剂量的铜对GST活性的毒性效应呈现出先激活后抑制的现象(杨晓霞等，2012)，也与本实验的研究结果相似.
CAT活性的增加可能是因为BDE-47积聚于蚯蚓体内(Gaylor et al., 2013; Shang et al., 2013)，引发了超氧阴离子的产生，需要CAT活性增强来清除体内的活性氧，而在暴露后期，由于体内活性氧自由基的积累超过抗氧化酶系统的清理自由基能力，从而活性逐渐下降.GST活性的变化可能是因为在BDE-47的毒性胁迫初期，由于体内GSH活性升高进而导致GST活性的升高，从而有效清除体内的类氧化物，第28 d时可能由于体内BDE-47的长时间积累代谢产生了5-羟基-四溴联苯醚(5-OH-BDE-47)和5-甲氧基-四溴联苯醚(5-MeO-BDE-47)抑制了GSH的活性(吴若函等，2012)，进而导致GST活性受到抑制，最后又通过适应性调节恢复到正常水平(Farombi et al., 2007).实验结果表明，采用CAT活性和GST活性评价BDE-47对蚯蚓的毒性效应时，需要研究其随暴露时间变化的规律，亚急性试验比急性试验更能反映其毒性效应.
本研究综合酶活性和基因两个层面对BDE-47毒性效应进行研究.研究表明，CAT和GST的基因表达水平变化范围大于其酶活性的变化，并具有显著性差异.CAT和GST基因表达水平的变化，同样是由蚯蚓体内氧化胁迫导致，随着BDE-47暴露时间的增加，基因表达水平的变化趋势延后于酶活性的变化趋势.在本研究中，在BDE-47对蚯蚓的亚急性试验中，酶活性和相应基因表达水平的变化趋势并不完全一致(p>0.05)或者出现相反的情况，相同的结果在已有文献中也有报道(Labrot et al., 1996；#321;aszczyca et al., 2004；Brulle et al., 2006).mRNA的表达水平只是反映编码蛋白的表达趋势，由于转录后修饰以及mRNA和蛋白质之间降解速率的不同都会影响到最终的蛋白质合成量(Wang et al., 2010)，在mRNA及其编码蛋白质含量的同时测定中得到了印证(Ji et al., 2013a，2013b).在不同蚯蚓个体体内的生理生化反应条件有差异，同时体内基因转录翻译过程存在修饰和反馈调节机制以及DNA损伤的影响，可能导致酶活性与基因表达水平之间不一定存在相关性，这需要以后进一步的研究探索.
同时，实验结果也表明，在BDE-47较低浓度情况下，CAT活性及基因表达水平和GST基因表达水平对BDE-47的响应灵敏度更高，可能是由于较低浓度BDE-47并没有对蚯蚓的基础代谢产生影响，能够迅速响应，已有相关文献得出相似结论(Ribera et al., 2001；Song et al., 2009；Chen et al., 2011).
5 结论(Conclusions)1)BDE-47亚急性试验中，随着暴露时间的增加，CAT活性的变化趋势是先上升后下降至趋于稳定，差异显著；GST活性先诱导后抑制，最后趋于稳定，但差异不显著.BDE-47对CAT和GST酶活性的影响随着暴露时间的增加逐渐下降至对照组水平.
2)CAT基因表达水平，在第14 d时，呈现抑制效应，在后续的第28 d和第42 d基因表达水平上调.GST基因表达水平整体呈现诱导效应，随着暴露时间的增加，低毒处理组(10、50 mg · kg-1)的基因表达水平下调至对照组水平，高毒处理组(100、200 mg · kg-1)的基因表达量被诱导高于对照组水平.与酶活性相关关系不显著，具体机制还需要进一步研究.
3)BDE-47的暴露试验中，在CAT和GST酶活性及其基因表达水平两项指标上，对BDE-47低毒处理组较高毒处理组更为敏感.
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