多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls，PCBs)作为一类具有209种单体的有毒氯代芳香化合物，是《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中首批被控制的12种持久性有机污染物之一.由于PCBs具有高的辛醇-水分配系数，使得其能够在环境中随大气干湿沉降迁移并大量沉积到沉积物和土壤中(Aken et al., 2010).据Meiger等(2003)保守估算，全球表层土壤中PCBs含量高达21000 t.其中，PCB28和PCB30等三氯代PCBs单标在环境中被广泛检出，具有一定的代表性(Manodori et al., 2006；Jaward et al., 2004；魏中青等，2007).研究表明，PCBs具有“三致”效应(Aken et al., 2010)，且对人体的生殖系统、内分泌系统、免疫系统等都能够造成损害(Yu et al., 2000；Emmett et al., 1988).因此，PCBs污染的修复已成为当前环境污染修复的热点问题.

微生物修复技术是目前常用的PCBs污染修复技术之一.1973年，Ahmed和Focht(1973)首次报道两株无色杆菌能够降解PCBs，随后有研究相继报道了其他PCBs降解微生物种.目前，已分离得到的PCBs降级菌株包括：革兰氏阴性菌，如Burkholderia xenovorans LB400(Goris et al., 2004)、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707(Triscari-Barberi et al., 2012)和Paenibacillus sp. KBC101(Sakai et al., 2005)；革兰氏阳性菌，如Rhodococcus sp. strain RHA1(Seto et al., 1995)、Janibacter sp. MS3-02(Sierra et al., 2003)；真菌(Čvanč et al.， 2012；Mouhamadou et al., 2013).微生物代谢PCBs过程中主要由bphA、bphB、bphC和bphD四个基因编码的BphA、BphB、BphC和BphD蛋白共同完成(Pieper，2005)，其中，BphA和BphC均为双加氧酶(Barriault et al., 2002；Ohtsubo et al., 2004).联苯双加氧酶是PCBs降解过程中的关键酶(Furukawa et al., 2004；Kumamaru et al., 1998；Brühlmann et al., 1999a)，编码联苯双加氧酶基因主要分离自Burkholderia cepacia LB400(Brühlmann et al., 1999b)、Pseudomonas sp. KKS102(Ohtsubo et al., 2000)和Rhodococcus sp. strain RHA1(Furusawa et al., 2004)等细菌.此外，目前较多研究报道了念珠藻Nostoc PCC 7120中的胡萝卜素开环双加氧酶(Cui et al., 2012；Ilg et al., 2009)，而关于固氮蓝藻中其他双加氧酶的报道为数不多.已有研究报道了某些固氮蓝藻能够降解典型持久性氯代有机污染物，如有机氯农药林丹和DDT(Zhang et al., 2012；Kuritz et al., 1997；Kuritz et al.，1995).然而，关于此类脱氯功能藻种降解PCBs及降解关键酶还有待进一步研究.

课题组前期研究发现，脱氯功能藻种Nostoc PD-2具有PCBs降解能力，并采用双向电泳技术分离了降解过程中上调表达的3-氯甲苯-3，4-双加氧酶和细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白.在此基础上，本研究以土壤中典型的三氯代PCBs单标PCB28和PCB30为目标污染物，通过调节环境因子，对脱氯功能蓝藻降解PCBs过程中调控双加氧酶和细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白的基因表达进行研究，并探究双加氧酶基因和铁硫蛋白基因表达量与脱氯效果之间的相关性，以期为筛选脱氯功能藻种降解PCBs的最佳环境条件和阐明脱氯功能藻种降解PCBs的分子机理提供理论依据.

脱氯功能藻种Nostoc PD-2分离筛选自浙南PCBs污染水稻田，根据Li等(2001)的方法进行分离，具体操作如下：将蓝藻混合物置于显微镜下，用灭菌处理的玻璃毛细管(孔径0.3 mm)挑选丝状藻体，至无菌水中洗涤，重复洗涤蓝藻3~4次，培养于BG11液体培养基中(Rippka et al., 1979)；蓝藻繁殖到一定数量后，进行镜检，确定其为单一藻种后，采用无氯的BG11培养基培养.培养条件为：培养温度(25±2)℃，光照强度998 lx，光暗比12 h ∶ 12 h.

两种三氯代PCBs单标2，4′，4-Trichlorobiphenyl(PCB28)和2，4，6-Trichlorobiphenyl(PCB30)购自百灵威公司，均为色谱纯.TRIzol 试剂和Power SYBR Master Mix购自Invitrogen公司，RNase-Free DNase I和RNase-Free Water购自Qiagen公司.一步法cDNA合成试剂盒购自杭州浩基生物有限公司，氯仿、异丙醇、乙醇等均为分析纯.

配置PCBs-甲醇工作液，浓度为100 mg · L^-1，吸取工作液400 μL加至20 mL无氯的脱氯功能蓝藻培养体系中，调整PCB28和PCB30在无氯培养体系中的终浓度为2 mg · L^-1，设置不添加PCBs的空白对照组.采用氮吹仪向培养物中充入高纯氮，以Pafilm膜封口，以硝酸钠氮源组作为对照组，添加2 mg · L^-1的PCBs后置于人工气候箱中培养7 d，待测.向20 mL无氯的培养体系中加入Na₂CO₃，调节体系中的Na₂CO₃终浓度为1 mg · L^-1和10 mg · L^-1，添加2 mg · L^-1的PCBs后置于人工气候箱中培养7 d，待测.调节人工气候箱温度至30 ℃和35 ℃，将PCBs暴露后的脱氯功能藻种Nostoc PD-2置于人工气候箱中进行培养，7 d后取样检测.

采用硫氰酸汞高铁分光光度法(Zall et al., 1956)测定PCB28和PCB30暴露7 d后无氯培养基上清液中的氯离子含量.具体方法如下：取暴露后的蓝藻培养物至50 mL离心管中，4000 r · min^-1离心10 min，吸取5 mL上清液，加入2 mL(60 g · L^-1)的硫酸铁铵溶液和1 mL(4 g · L^-1)的硫氰酸汞溶液，显色20 min后于460 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算培养物上清液中氯离子的质量.脱氯百分比η的计算公式为：η=m_t/ m₀×100% ，其中，m₀为理论上脱下的最大氯离子质量(μg)，m_t为测定的培养物上清液中的氯离子总质量(μg).

根据GenBank登录序列，用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件设计定量PCR的引物，预期扩增长度和溶解温度见表 1.引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

表 1(Table 1)

表 1 RT-PCR引物序列和条件 Table 1 Real-Time PCR primers and conditions

表 1 RT-PCR引物序列和条件 Table 1 Real-Time PCR primers and conditions 基因名称 基因序列 引物序列(5′→3′) 扩增长度/bp 溶解温度/℃ 注：a.双加氧酶基因引物参照文献(Kaneko et al., 2001)进行设计. Dioxygenase genea GCCCCAAATCAGAAACTACCACCATCACCGGGAAATAACCAA 89 63 iron-sulfurS protein gene NC_007413 TTAAATGCCCTTGCCACGGTTCTCAGCGTGACTCAAAGCCAGAGACTT 89 62 16S rRNA(内参) EU599109 GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGACGTCCCTCAGTGTCAGTTGC 84 63

采用Wang等(2012)的方法提取PCBs暴露后的脱氯功能藻种PD-2的总RNA.用液氮充分研磨藻样，取50~80 mg粉末加入1 mL TRIzol，剧烈振荡，然后加入0.2 mL氯仿，盖上离心管盖子，剧烈振荡15 s，室温放置5 min；室温下，12000 r · min^-1离心10 min，转移不多于80%上层水相至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，冰上放置10 min，4 ℃、12000 r · min^-1下离心15 min，弃上清；加入1 mL预冷的75%乙醇，上下混匀，4 ℃、12000 r · min^-1下离心5 min，弃上清，空气干燥；加入30~50 μL RNase-Free Water，充分溶解后，加入DNase I进行消化，去除基因组DNA污染，分光光度计测定含量和纯度.

采用一步法cDNA合成试剂盒合成cDNA，具体操作为：取2 μL总RNA，加入RNase-Free H₂O补充到5.0 μL，65 ℃水浴5 min，立即放到冰上；加入3 μL反转录缓冲液、1.35 μL随机引物、0.65 μL反转录酶，30 ℃ 孵育10 min，42 ℃孵育30 min，70 ℃水浴15 min灭火反转录酶，即可得到蓝藻的总cDNA.

以16S rRNA为内标，每个PCR反应体系(25 μL)：1.0 μL模板cDNA，12.5 μL PCR相关缓冲液，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物.循环条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，40个循环；62 ℃退火25 s.扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察.

采用OriginPro 8.0 分析软件进行统计分析.组间差异用One-way ANOVA分析，p<0.05被认为差异显著，p<0.01被认为差异极显著.采用SPSS19.0进行数据的相关性分析，分别以空白对照组脱氯比例和基因表达量为基数，计算不同环境因子作用下PCB28和PCB30暴露组的相对脱氯比例和相对基因表达量，然后进行回归分析.

图 1为添加不同类型氮源时，脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28和PCB30的7 d脱氯效果，以及双加氧酶基因和铁硫蛋白基因的表达情况.由图 1可以看出，氮气氮源组中PCB28和PCB30的脱氯百分比均低于硝酸钠氮源组中的脱氯百分比.此外，由图 1a可看出，氮气作为氮源时，PCB28暴露下双加氧酶基因表达量显著低于硝酸钠作为氮源时的表达量(p<0.01).PCB30暴露后，与硝酸钠氮源组相比，氮气氮源组中的双加氧酶基因表达量降低，差异极显著(p<0.01).从图 1b可知，硝酸钠作为氮源时，PCB30暴露后，Nostoc PD-2中的铁硫蛋白基因的表达量明显高于氮气为氮源时的表达量(p<0.01).PCB28暴露时，双加氧酶基因在硝酸钠氮源组中的表达量为氮气氮源组中表达量的1.9倍，PCB30暴露时，该基因在硝酸钠氮源组中的表达量则为氮气氮源组中表达量的5.7倍.

图 1(Fig. 1)

图 1 不同氮源对基因相对表达量和脱氯百分比的影响(*p<0.05，** p &lt;0.01) Fig. 1 Effects of different nitrogen source on the relative expression genes and percent dechlorination(*p<0.05，** p &lt;0.01)

图 2给出了不同浓度碳酸钠对脱氯功能藻种中基因表达和脱氯效果的影响.由图 2 可以看出，添加两种浓度的碳酸钠后，功能藻种PD-2对PCB28、PCB30的脱氯降解效果均有所提高.添加1 mg · L^-1的碳酸钠，PCB28、PCB30的脱氯百分比分别从未添加碳酸钠组中的64.7%、37.1%上升至71.6%、50.3%.碳酸钠浓度为10 mg · L^-1时，PCB28、PCB30的脱氯百分比则上升至78.3%、54.1%.此外，添加1 mg · L^-1和10 mg · L^-1的碳酸钠的实验组中，双加氧酶基因的表达量与对照组中该基因的表达量相比有明显升高(p<0.01).1 mg · L^-1碳酸钠处理后，PCB28降解组中的双加氧酶基因表达量较未添加碳酸钠组升高0.5倍，PCB30降解组中的双加氧酶基因表达量为未添加碳酸钠组的1.7倍.10 mg · L^-1碳酸钠处理下，PCB28降解组中的双加氧酶基因表达量则升高0.9倍，PCB30降解组中的该基因表达量为未添加碳酸钠组中的1.7倍.碳酸钠处理组中的铁硫蛋白基因表达量高于未添加碳酸钠组中的表达量，差异极显著(p<0.01).经1 mg · L^-1和10 mg · L^-1碳酸钠处理，PCB28暴露后的铁硫蛋白基因表达量为未添加碳酸钠组的2.5和3.4倍，PCB30降解组中的该基因表达量是未添加碳酸钠组的1.9和2.3倍.

图 2(Fig. 2)

图 2 添加碳源对基因相对表达量和脱氯效果的影响(*p<0.05，**p<0.01) Fig. 2 Effects of adding carbon source on the relative expression genes and percent dechlorination(*p<0.05，**p<0.01)

图 3给出了不同培养温度对脱氯功能藻种对PCB28和PCB30的脱氯降解效果及两个基因相对表达量的影响.从图中可以明显看出，升高温度能够促进脱氯功能藻种PD-2对PCB28和PCB30的脱氯降解.双加氧酶基因的相对表达量随着温度的升高而上调，差异极显著(p<0.01).30 ℃时，PCB28、PCB30暴露后的双加氧酶基因相对表达量上调至25 ℃条件下的1.7和1.3倍;35 ℃时，PCB28、PCB30暴露后的双加氧酶基因相对表达量上调至25 ℃条件下的2.3和1.5倍.升高温度也能够明显促进铁硫蛋白基因在脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2中的表达，30 ℃和35 ℃处理组中的相对表达量高于25 ℃条件下的表达量，差异极显著(p<0.01).30 ℃处理时，PCB28暴露下铁硫蛋白基因相对表达量较大，为25 ℃时的3.3倍.35 ℃处理时，PCB28暴露下铁硫蛋白基因相对表达量最大，为25 ℃时的3.5倍.

图 3(Fig. 3)

图 3 不同培养温度对基因相对表达量和脱氯百分比的影响(**p<0.01) Fig. 3 Effects of culture temperature on the relative expression genes and percent dechlorination(**p<0.01)

为进一步分析双加氧酶基因和细胞色素b₆f铁硫蛋白基因的表达与脱氯降解之间的相关性，利用SPSS软件分别分析两种基因表达与两种PCBs单标脱氯效果之间的Pearson相关系数，其相关性结果如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 双加氧酶基因和铁硫蛋白基因相对表达量与脱氯效果的相关性(n=24) Table 2 The correlation between the expression levels of dioxygenase and Fe-S protein genes and dechloriantion (n=24)

表 2 双加氧酶基因和铁硫蛋白基因相对表达量与脱氯效果的相关性(n=24) Table 2 The correlation between the expression levels of dioxygenase and Fe-S protein genes and dechloriantion (n=24) 双加氧酶基因相对表达量 铁硫蛋白基因相对表达量 PCB28脱氯百分比 0.872 0.801 PCB30脱氯百分比 0.832 0.813

环境因子对念珠藻PD-2脱氯降解PCB28和PCB30产生影响的根本原因在于其能够影响念珠藻细胞内降解相关蛋白和编码这些蛋白的基因的表达.固氮蓝藻能够将氮气分子的N≡N打开，将其还原为铵态氮，这一过程势必涉及能量的消耗.脱氯功能藻种Nostoc PD-2降解PCBs的过程亦是耗能的过程，因此，以氮气作为氮源时，功能藻种Nostoc PD-2中的固氮还原体系与PCBs的还原脱氯体系之间可能存在能量竞争，从而导致双加氧酶基因表达量下降.氮气氮源组中的细胞色素b₆f铁硫蛋白基因下调可能是由于PCBs对脱氯功能藻种Nostoc PD-2的毒性使得其光合系统受损，而硝酸钠氮源组中的功能藻种可直接利用培养基中的无机氮源，无需为固氮消耗更多能量，其光合系统受损程度低于氮气氮源组中的功能藻种.此外，Kuritz(1999)研究发现，蓝藻能够在固氮过程中通过其体内特殊的氮还原酶体系还原降解含氯有机物.氮气氮源组中的双加氧酶基因表达量显著低于硝酸钠氮源组，可能是由于功能藻种PD-2对PCBs的脱氯降解作用是由双加氧酶主导，故而在固氮还原体系中，具有氧化作用的双加氧酶基因的表达受到了抑制.

研究表明，不同种类和浓度的无机碳源对藻类的影响不同(李鑫等，2011；郑洪立等，2011；王立柱等，2010).本研究中，添加了不同浓度的碳酸钠后对脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2的双加氧酶基因的表达都有促进作用.这很可能是由于添加了碳酸钠后，促进了功能藻种的生长，更多的藻种表达了更多的双加氧酶基因，双加氧酶基因编码更多的双加氧酶脱氯降解PCBs.同样地，添加碳酸钠后，功能藻种的生物量增加，其光合活性增强，细胞色素b₆f铁硫蛋白基因上调表达，为光合作用的进行传递更多的电子.碳源在念珠藻PD-2脱氯降解PCBs的过程中起到了关键作用.

温度是影响蓝藻生长和生命活力的又一关键因子.有研究报道，在10~28 ℃的范围内，孟氏浮游蓝丝藻和微囊藻的生长速率随着温度的升高而增大，光合作用随着温度的升高而增强(金相灿，2008).本研究中，双加氧酶基因和铁硫蛋白基因在25~35 ℃范围内均随着温度的升高而上调.因此，我们推测升高温度有利于功能藻种Nostoc PD-2的生长，并使其在PCBs毒性胁迫下仍能表达较高水平的双加氧酶基因和细胞色素b₆f铁硫蛋白基因.这两种基因的高水平表达为大量编码双加氧酶和铁硫蛋白提供了必要条件，进而保证脱氯功能藻种Nostoc PD-2能够降解PCBs，并正常进行光合作用.对耐寒菌株Hydrogenophaga sp. IA3-A降解PCBs的研究发现，30 ℃时菌株IA3-A内的双加氧酶活性高于5 ℃时的双加氧酶活性(由1.97 nmol · min^-1 · mg^-1(以蛋白计)上升至5.22 nmol · min^-1 · mg^-1)，相应地，该菌株对2~4氯代PCBs同类物的降解效果在30 ℃时也好于5 ℃时，对PCB18和PCB31的脱氯百分比均从0增加至32%(Lambo et al., 2006)，这与本研究结果是相一致的.

研究表明，降解功能微生物对PCBs同类物的降解效果受PCBs单体结构影响(Bedard et al., 2005；Williams，1994).脱氯功能藻种Nostoc PD-2对典型三氯代PCBs同类物PCB28和PCB30均具有脱氯降解效果，但对PCB28的脱氯百分比高于PCB30的脱氯百分比(图 1).这可能与PCB28和PCB30之间结构存在差异有关：PCB28是只有一个邻位氯取代(2，4，4′-)的三氯联苯，而PCB30则是有两个邻位氯取代(2，4，6-)的三氯联苯.因此，PCB30联苯环上的碳氯键结合要比PCB28联苯环上的碳氯键结合更牢固.藻种PD-2对PCB30实现脱氯降解难于对PCB28的脱氯降解.此外，温度也可影响降解功能微生物作用于PCBs的脱氯活性位点.研究发现，Aroclor 1260发生脱氯反应的温度为8~34 ℃和50~60 ℃，而其最佳反应温度为18~30 ℃，侧面间位可以在8~34 ℃和50~60 ℃之间发生脱氯反应，而对位脱氯反应只在18~34 ℃之间发生(Morris et al., 1992).本研究中，升高温度能够促进脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28和PCB30的脱氯降解，对脱氯活性位点的影响并不明显.

1)脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2对PCB28和PCB30的脱氯降解和关键脱氯相关基因表达都受到环境因子影响.

2)硝酸钠作为氮源时，PCB28和PCB30降解组中的双加氧酶基因相对表达量分别为氮气氮源组的1.9倍和5.7倍，硝酸钠氮源组的脱氯效果好于氮气氮源组的脱氯效果.

3)添加10 mg · L^-1碳酸钠时，PCB28和PCB30降解组中双加氧酶基因的相对表达量分别为对照组的1.9和3.4倍，铁硫蛋白基因的相对表达量分别为对照组的1.7和2.3倍；升高温度亦能够明显促进PCBs降解组中两种基因的表达.添加碳酸钠和升高温度均能促进PD-2对PCB28和PCB30的脱氯降解.

4)双加氧酶基因的表达量与PCB28和PCB30的相对脱氯降解比例之间的相关系数分别为0.872和0.832，均高于铁硫蛋白基因与上述两种PCBs单标脱氯降解的相关系数，因此，双加氧酶基因可能是更为关键的脱氯降解基因.