2012
当今世界存在着3 大危机，即人口扩张、环 境破坏及资源枯竭，这些危机正在全球范围日益 蔓延[1,2,3]。环境、能源和持续性发展已经成为目前世 界性的问题。能源是人类社会经济生活中的重要物 质基础，然而随着现代工业、农业和国防科技事业 的迅猛发展，人类对能源的消耗量显著增加。乙醇 是一种重要的化工原料，广泛用于化工、轻工、药 品、食品添加剂、工业溶剂及防冻剂等。而乙醇作 为燃料具有以下优点：①生产成本相对较低；②对 环境的污染比汽油、柴油小得多；③20%的乙醇和 汽油混合使用，汽车发动机不必改装；④其生产原 料来源广泛。利用生物质生产燃料乙醇已经引起多 国重视，经过上世纪70年代和80年代初3次石油 危机的冲击，人们越来越清醒地认识到人类社会不 能只依赖石油等化石资源获得能源，必须逐步扩大 可再生的生物质资源的比例。
生产乙醇的生物质原料主要有植物纤维原料、 糖蜜和含淀粉质原料等。地球上每年大约形成1700 亿t 植物有机物，是自然界分布最广、含量最多、 价格低廉而又未得到充分利用的可再生资源[1]，除 少量用于造纸、建筑、纺织等行业或用作粗饲料、 薪柴外，大部分未被有效利用而烂掉或烧掉，有些 还造成环境污染（例如焚烧），通过生物技术将这些 纤维废弃物转化为能源和化工产品可一举数得。所 有植物来源的木质纤维均含有丰富的纤维素、半纤 维素和木质素，在植物纤维原料中，戊聚糖约占 20%～30%，在植物纤维原料水解液中戊糖占30%左右，因此，戊糖发酵是决定植物纤维资源生产乙 醇经济可行的关键技术之一[4]。了解戊糖发酵有利 于制糖副产品甘蔗渣生产燃料乙醇的研究和发展， 提高甘蔗渣的综合利用价值。
木糖是植物纤维原料半纤维素戊糖的主要成分，过去一直认为不能被微生物发酵成乙醇[5]。Karczewskav于1959年第一次提出了用木糖发酵乙醇，但这个发现未引起人们的足够重视[6]。直到1980年，Wang等人提出木糖可被一些微生物发酵成乙醇[7]。此后，国际上掀起一股木糖乙醇发酵菌种的研究热潮，迄今为止已发现100多种微生物能代谢木糖成乙醇，包括细菌、真菌和酵母[8]。
在植物纤维素中，纤维素、半纤维素以及木质素的含量比为4∶3∶3，天然半纤维素如木聚糖水解产物的85%～90%是木糖。 充分利用纤维素原料中的木糖发酵生产酒精，能使纤维素原料的酒精发酵的产量在原有的基础上增加25%[9]。细菌能发酵的糖类物质较多，除了单糖外还能发酵纤维素、生物高聚糖等，但细菌发酵的缺点是副产物多，乙醇得率低，同时，高pH条件下的细菌发酵容易引起杂菌感染。乙醇发酵能力最强的细菌是Zymomonas mobils，但它只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖而不能发酵木糖。 在具有戊糖发酵能力的菌种中，Clostridium thermohydrosulfuricum39E发酵木糖的能力最强，乙醇得率达0.39 g/g(乙醇/消耗糖)。与细菌一样，真菌不仅能发酵单糖，而且还能发酵二糖、纤维素和木聚糖，真菌的这种性质特别适合于植物纤维原料的同步糖化发酵。在戊糖发酵的微生物中，酵母的戊糖发酵能力最强，目前人们研究最多且最有工业应用前景的木糖发酵微生物有3 种酵母菌种，即管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和休哈塔假丝酵母(Candida shechatae)，它们的木糖发酵乙醇转化率和生产能力分别达0.24～0.48 g/g(乙醇/消耗糖)和0.02～0.66 g/(L·h)[10]。
酵母菌大多为兼性厌氧微生物，需从环境中摄 取营养物质以供生长和代谢。酵母所需营养物质包 括：碳源、氮源、无机盐及生长素。酵母在适宜的 环境条件下，不断地吸收营养物质进行新陈代谢。 在这过程中细胞的原生质量不断增加，菌体的体积 增大。但增长到一定程度便开始出芽繁殖，分裂形 成2个细胞。酵母菌繁殖很快，经过迟滞期、对数 期、稳定期、衰亡期，在适宜条件下酿酒酵母的世 代时间约为2 h。在某些条件下，随着发酵的进行， 酵母菌的世代时间出现延长现象。影响世代时间延 长的因素有：氧供应不足、培养液粘度增加、种子 酵母中的生长素耗尽、可能存在于培养液的或酵母 本身所分泌的抑制剂的积累以及较高的渗透压等。
酵母细胞内有若干条分解糖的途径，主要有厌 氧条件的糖酵解途径(glycolytic pathway)、有氧条件 的三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)及利用戊糖及 戊糖醇的己糖单磷酸途径。酵母在有氧或无氧条件 下糖代谢途径都要经过丙酮酸，因此，丙酮酸是糖 代谢的中心物质。在有氧条件下，丙酮酸通过三羧 酸循环后彻底氧化；在厌氧条件下，丙酮酸则形成 乙醇与二氧化碳。因此，氧对酵母的生长速度与代 谢途径的影响至关重要。有研究表明：木糖异构酶 基因xy/A在酿酒酵母H158中得到活性表达，其最 高酶活条件为85℃，pH7.0，在接近酶生长温度的 30℃和40℃时，其相对酶活分别下降3.7%和 11%[11]。所以，不同的营养物质、环境氧浓度、培 养温度及其它环境参数都对酵母的生长和代谢途径 有或多或少的影响。
在植物纤维原料中，戊聚糖约占20%～30%， 在植物纤维原料水解液中戊糖占30%左右，因此， 戊糖发酵是决定植物纤维资源生产酒精经济可行的 关键之一。木糖是植物纤维原料半纤维素戊糖的主 要成分[8]。自上世纪80年代初国际上掀起戊糖发酵 的研究热潮以来，戊糖发酵的研究主要集中在木糖 发酵机理的探讨、木糖发酵菌种的选育以及发酵方 式的优化等几个方面。戊糖发酵机理的研究主要集 中在酵母代谢木糖的机理上（图1）。
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图1 酵母代谢木糖的机理 |
如图1所示，在酵母细胞中，发酵过程包含2 种途径：木酮糖途径和木糖醇途径[10]。木糖进入菌 体细胞后首先在木糖还原酶XR（Xylose Reductase） 和木糖醇脱氢酶XDH (Xylitol Dehydrogenase)的作 用下转化为木酮糖。在某些细菌中，木糖异构酶XI （Xylose Isomerase）可以直接将木糖转化为木酮 糖，木酮糖经过木酮糖激酶XK（Xylulokinase）磷酸化生成5-磷酸木酮糖后可以进入磷酸戊糖途径 (PPP)，最终以中间产物6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油 醛进入糖酵解途径生成乙醇[12]。与传统的酿酒酵母 厌氧发酵不同，酵母的戊糖发酵是在“半厌氧”的 条件下进行，酵母代谢己糖和戊糖成乙醇的总反应 式如下：
C6H12O6—→2C2H5OH+2CO2
10C5H10O5—→15C2H5OH+20CO2
由于酵母代谢戊糖的途径比代谢葡萄糖复杂得多，在代谢过程中部分戊糖没有转化成乙醇而进行辅酶NADPH的合成或转化成其它副产物，因此，酵母代谢戊糖的理论转化率为0.46 g/g(乙醇/消耗糖)，低于己糖乙醇发酵理论转化率0.51 g/g(乙醇/消耗糖)[13,14]。
微生物本身代谢戊糖的能力是决定植物纤维原 料水解液戊糖发酵成败的关键。因此，高糖利用率 和高耐抑制物能力的戊糖发酵菌株的选育一直是这 一领域的热门课题。目前，戊糖发酵菌株的选育主 要集中在4个方面：
（1）从自然界中继续筛选戊糖发酵菌种。例如 菌株b-11。其特性研究结果表明，菌株b-11耐乙醇 浓度为5%，对数生长期为12～18 h，在50 g/L的 木糖发酵培养基中发酵48 h时乙醇浓度达到最高值 3.105 9 g/L，木糖利用率达82.52%，糖醇转化率是 理论转化率的16.36%[15]。
（2）采用定向培育技术，通过对已有菌株的长 期驯化筛选从而得到所需菌株。例如：从酸败的酒 糟中筛选得1株降解乙醇能力相对较高的巴氏醋杆 菌(Acetobacter pasteurianus)Ⅶ，其乙醇降解能力为 0.72 mL/d；正交试验得该菌株培养的最佳培养基组 成为0.5%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.3%NaCl、8%无 水乙醇(V/V) 、 0.1%K2HPO4·3H2O 、 0.05%MgSO4·7H2O、0.001%FeSO4·7H2O、pH7.0。 耐乙醇驯化后，Ⅶ号菌株对乙醇的降解能力提高至 2.3 mL/d[16]。
（3）采用原生质体融合(ProtoplastFusion)技术。 ProtoplastFusion技术起源于20世纪50年代。1958 年，日本的Okada发现并证明了灭活的仙台病毒可 诱发体内艾氏腹水癌细胞彼此融合，从而开始了细 胞融合的探索；1977年，Sipiczki与Ferenczy首次 实现酵母菌的原生质体融合；1978年，第3届国际 工业微生物遗传学讨论会上，把原生质体融合作为 一种新的基因重组手段提出来，引起全世界的关注。 这里举个例子：采用双灭活法将酿酒酵母与解苹果 酸裂殖酵母进行属间融合，并用毛细管电泳法精确 测定苹果酸降解率，最终得到一株降解苹果酸能力 高达31.7%，且发酵性能优良的融合子。该菌株发 酵风味好，发酵度高，凝絮性强，对酿造葡萄酒具 有重要的应用价值[17]。
（4）采用基因工程技术对发酵木糖菌株进行改 良。基因工程技术在戊糖发酵菌种的选育上得到了 广泛的应用，构建了一批工程细菌和工程酵母，但 是至今尚未出现重大突破，不过基因工程技术会在 未来构建高得率、高产率和耐高抑制物的戊糖发酵 菌种的研究中起重要作用。
直接发酵法就是以纤维为原料进行直接发酵， 不需要进行酸解或酶解前处理过程。这种工艺方法 设备简单，成本低廉，但乙醇产率不高，而且易产 生有机酸等副产物。利用基因工程技术改造菌株的 性能，也可望进行纤维直接发酵乙醇，但由于要受 到DNA供体、载体质粒、DNA受体菌等多种因素 的影响，构筑基因工程菌非常复杂，难度很大。
先用纤维素酶水解纤维，酶解后的糖液作为发 酵碳源。乙醇产物的形成受以下因素限制：末端产 物抑制、低细胞浓度以及基质抑制。为了克服乙醇 的抑制，必须不断地从发酵罐中移出乙醇，采取的 方法有：减压发酵法、快速发酵法、阿尔法一拉伐 公司的Biotile法[18]。对细胞进行循环利用，可以克 服细胞浓度低的问题。筛选在高糖浓度下存活并能 利用高糖的微生物突变株，以及使菌体分阶段逐步 适应高基质浓度，可以克服基质抑制。
一般的废弃纤维水解液都是葡萄糖、木糖、阿 拉伯糖等单糖和寡糖的混合物。杨斌（1997年）等 针对多碳源发酵乙醇的菌株不多，工艺及设备满足 代谢上有一定困难，碳源利用率低，乙醇产率低等 问题，提出了采用气升柱发酵木糖和溢流柱发酵葡 萄糖的串联发酵工艺[19]。串联发酵是首先经 P.stipitis 酵母（树干毕赤酵母）的限氧发酵后，再 经P.cereisiae的厌氧过程而结束。
在纤维素酶糖化过程中，纤维素酶的最适温度 为50℃左右，而酵母发酵的控制温度是31～38℃。 此法通过热交换控制，使糖化反应产物和初始底物 进行热量交换，糖化产物温度降低进而进入酵母发 酵阶段，初始底物则继续进行糖化反应，由此，很 好地解决了纤维素酶糖化与酵母发酵2个过程温度 不协调的矛盾。
固定化技术是生物工程技术的一个重要方面， 固定化技术就是通过化学或物理方法将酶乃至整个 细胞固定在固相载体上。固定化酶和固定化细胞可 以反复使用，便于回收。该法使用固定化细胞提高 发酵器内细胞浓度，使最终发酵液的乙醇浓度得以 提高，其优点在于固定化细胞可连续使用。对于固 定化细胞的研究，目前研究较多的是酵母和运动发 酵单胞菌的固定化，研究结果表明，固定化运动发 酵单胞菌比酵母更有优越性。因此，固定化技术可 以变革传统的生产工艺，缩短生产周期，降低成本。
由于前景可期，现各大高校院所都在深入做一 些这方面的研究：①广州甘蔗糖业研究所的“工业 酿酒酵母木糖代谢途径的建立及酒精发酵初步研 究”，采用调子束诱变育种技术研究了酵母菌株的离 子束诱变，并构建了发酵木糖乙醇工程菌株。该研 究中的工程菌株GZ4-127的菌体尝试比出发株菌 AS2.1190高5%左右，木糖消耗提高2倍，乙醇产 率提高12%，并伴随大量的木糖醇产生[20]；②山东 大学微生物技术国家重点实验室通过改变辅酶的再 生途径，达到改变细胞内代谢产物构成的目的[21]； ③首都师范大学生命科学学院通过基因工程和细胞 融合等方法对酿酒酵母进行改造，使其能够代谢木 糖生产乙醇[22]，木糖在大多数木质纤维素水解物中 含量可达30%，是仅次于葡萄糖的一种单糖。分析 表明，充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产 乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高25%；④厦门 大学通过构建了携带木糖代谢途径关键酶基因 xyl1、xyl2及xks1的重组整合型质粒，在一定程度 上减少木糖醇的积累，增加乙醇产量[23]。这些都是 这一领域比较新的研究。
自上世纪80 年代初国际上掀起戊糖发酵的研 究热潮以来，戊糖发酵的研究主要集中在木糖发酵 机理的探讨、木糖发酵菌种的选育以及发酵方式的 优化等几个方面。前人对木糖发酵机理的研究已较 为成熟，迄今为止已发现100多种微生物(包括天然 菌株和重组菌株)能代谢木糖发酵生成乙醇，但是能 同化戊糖的酵母大多不能发酵戊糖生产乙醇，而能 发酵戊糖酵母发酵木糖的乙醇产率较低。因此，选 育高效的木糖发酵菌将仍然是开发纤维类可再生资 源的重要技术关键之一，有待科学工作者去研究和 探索。
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