高分子学报  2017 Issue (1): 135-142   DOI: 10.11777/j.issn1000-3304.2017.16278   PDF    
http://dx.doi.org/10.11777/j.issn1000-3304.2017.16278
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史杰中, 贾昊旸, 刘冬生
Jie-zhong Shi, Hao-yang Jia, Dong-sheng Liu
单根DNA短链构筑pH响应超分子水凝胶
pH-Responsive Supramolecular Hydrogel Based on One Short Strand DNA
高分子学报, 2017, (1): 135-142
Acta Polymerica Sinica, 2017, (1): 135-142.
http://dx.doi.org/10.11777/j.issn1000-3304.2017.16278

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2016-09-11 收稿
2016-10-10 修稿
单根DNA短链构筑pH响应超分子水凝胶
史杰中, 贾昊旸, 刘冬生    
有机光电子与分子工程教育部重点实验室 清华大学化学系 北京 100084
摘要: 设计合成了一条包含两段自互补序列和一段富含胞嘧啶(C)序列的DNA单链.在碱性条件下,两段自互补序列可通过分子间自组装形成一维DNA纳米线,调节pH至酸性条件后,胞嘧啶序列通过形成双分子i-motif结构将纳米线交联,从而形成DNA水凝胶.当加入酸或碱调节体系的pH时,水凝胶的力学强度会发生变化.在pH为5.3时,水凝胶力学强度达到最大,增大或减小pH都会使水凝胶强度降低.同时,改变DNA单链浓度也能够调节水凝胶的力学强度.此凝胶制备过程原料合成简便,无需涉及不同DNA链定量配比的问题,大大简化了实验操作;另外i-motif结构在形成与解离两态之间的转换非常迅速,在几秒钟之内便可完成,也赋予该凝胶快速pH响应的特性.
关键词DNA水凝胶    自互补    i-motif结构    pH响应   
pH-Responsive Supramolecular Hydrogel Based on One Short Strand DNA
Jie-zhong Shi, Hao-yang Jia, Dong-sheng Liu    
Key Laboratory of Organic Optoelectronics & Molecular Engineering of the Ministry of Education, Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084
Corresponding authors: Dong-sheng Liu, E-mail: liudongsheng@tsinghua.edu.cn
Abstract: We design a single strand DNA containing two self-complementary sequences and a half i-motif structure. The two self-complementary sequences can self-assemble to form DNA nanowires. Then, the hydrogel can be formed by crosslinking the half i-motif structures under acid condition. The single strand DNA is diluted to 3 mmol/L in 1×TAE buffer (pH=7.5) containing 12.5 mmol/L MgCl2. The system is heated to 95℃ for 5 min and slowly annealed to room temperature. The pH is adjusted to 5.3 to form the DNA hydrogel. The DNA oligomers and assemblies are characterised by PAGE. Then circular dichroism is used to characterize the structure of the duplex and the i-motif. Rheological characterization is used to evaluate the mechanical properties and thermal stability of the hydrogels at different concentration and pH. By changing concentration of the single strand DNA, one can adjust the mechanical strength and thermal stability of the hydrogels. Besides, the mechanical strength can be tuned by changing pH values. When pH value is 5.3, the storage modulus (G') of the hydrogel is 243.9 Pa. When the pH value is increased to 6.0, the G' is lowered to 225.7 Pa because the stability of the i-motif structure decreases as the pH value increases. However, when pH value is changed to 5, the G' is greatly reduced to 57.4 Pa, which is caused by the instability of the duplex structure under acidic condition. In this procedure, the single strand DNA is very easy to be synthesized and the ratio of DNA strands has not to be controlled. Thus, the experimental steps are greatly simplified. Also, the transition of the i-motif between hydrogel formation and its dissociation is reversible and fast (within several seconds), which makes the DNA hydrogel fast pH responsive. Due to these characteristics, this DNA hydrogel holds great potential in bio-sensing, drug delivery and 3D printing.
Key words: DNA hydrogel    Self-complementation    I-motif structure    pH responsiveness   

DNA分子具有特异的碱基识别能力、明确的二级结构、序列的可设计性和功能序列的响应性等优异的性质,是一种理想的自组装材料[1]. 近年来,DNA分子已经被用于构建精确的微纳米组装结构[2~7]、动态DNA分子器件[8, 9]和生物材料[10, 11]等. 除了双螺旋结构[12]以外,DNA还拥有一些更为多样的结构类型. 其中,i-motif分子[13, 14]是由富含胞嘧啶(C)的DNA序列形成的一种特殊四链结构,在这种四链结构中,平行链间的2个胞嘧啶需要通过结合一个质子来形成三组氢键,所以只能够在弱酸性条件下稳定存在. 通过改变体系的pH,i-motif结构能够在形成与解离两态之间迅速转换(在1 s内就可以完成两态切换)[15],并且反应产物只有盐和水,对DNA结构及稳定性没有影响,利用i-motif构建的分子马达[16]在智能表面[17~19]、纳米通道[20]等方面都有广泛的应用.

DNA作为优异的组装基元不仅可用于构建纳米器件,同样可用来构筑超分子水凝胶. 2009年,Liu等首次利用单个DNA双链基元通过两步组装构筑了具有pH响应的纯DNA超分子水凝胶,实现了金纳米颗粒的负载和可控释放[21]. 随后Liu等又利用2种DNA双链基元,在生理条件下通过一步组装原位形成具有热响应和酶响应的DNA超分子水凝胶,该水凝胶具有良好的大分子通透性,在三维培养细胞方面有很大的应用前景[22]. 此外,Liu等还以聚多肽作为高分子主链,以DNA组装结构作为交联剂,构筑了聚多肽-DNA超分子水凝胶,并将其应用于3D细胞打印[23].

上述DNA水凝胶在制备过程中都涉及多条DNA单链,增加了合成的工作量;而且成胶过程需要严格控制不同链段等当量来确保形成规整的网络结构,否则就会引起水凝胶力学强度下降. 基于上述问题,Ke等设计了一条包含三段自互补序列的单链DNA,在加热退火的过程中,该单链DNA可以先组装成小的枝杈型基元,基元之间再通过碱基互补配对交联形成水凝胶,大大简化了实验操作[24]. 受此启发,我们基于之前的研究基础,设计、合成了一条包含两段自互补序列和一段富含胞嘧啶序列的DNA单链(20-i),通过两步组装形成了具有快速pH响应性的水凝胶. 如图 1所示,首先在偏碱性条件下,利用加热退火的方法,使20-i的两段自互补序列通过分子间互补形成一维DNA纳米线,富含胞嘧啶的序列成为其侧链,之后将pH调至酸性,富含胞嘧啶的序列就可以形成双分子i-motif结构,将DNA纳米线交联在一起,从而得到水凝胶. 之后再次调节pH至碱性,双分子i-motif结构就会解开,使DNA纳米线失去交联点,体系转变为溶液状态. 基于以上方法,我们实现了利用单根DNA短链制备出同时具有热响应性和快速pH响应性的纯DNA超分子水凝胶,该水凝胶在药物运输、生物传感以及3D打印方面有着潜在的应用前景.

Fig. 1 Scheme of the DNA hydrogel formation and its pH responsive property
1 实验部分 1.1 主要原料

硼酸、Tris、EDTA、Stains All、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、尿素、甲酰胺、异丙醇、三氟乙酸、盐酸、氯化镁、乙酸镁等试剂购买于Sigma Aldrich公司,未经进一步纯化. 三纯水由Millipore 纯水仪制备(18.2 MΩ cm-1).

本实验中用到的DNA分子均由Bioautomation公司的Mermade-12合成仪合成,用Agilent 1260的高效液相色谱(HPLC)进行纯化.

1.2 DNA的制备、纯化与定浓

将DNA合成柱放入DNA合成仪中,利用亚磷酰胺固相合成法合成预先设计的DNA序列[25]. 向其中加入浓氨水,60 °C恒温3 h进行氨解,使DNA从固相载体上分离. 氨解后将样品放入浓缩仪中脱氨,直至无氨水味道为止. 之后将样品过滤后,用高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化. 将收集到的样品浓缩,并加入三氟乙酸(CF3- COOH)振荡,使保护基DMT脱离. 之后将样品转移至截留分子量为3000的超滤管中离心,充分除去样品中的盐,得到纯DNA水溶液.

将DNA水溶液,用Varian公司Bio Cary-100 UV-Vis光谱仪在扫描波长范围λ = 220 ~ 320 nm,扫描速度ν = 1 nm/min的条件下测定单链DNA吸收光谱图. 取λ = 260 nm处的吸光度A,由朗伯-比尔定律求出DNA单链的浓度. 取所需量的DNA单链水溶液用冻干机将样品冻干至粉末状态,放置于-20 °C条件下备用.

1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验 1.3.1 单链凝胶电泳实验

量取50 mL 20%变性胶单体溶液(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为19∶1,尿素7 mol/L),加入过硫酸铵(APS)引发剂和四甲基乙二胺(TEMED)促凝剂,搅拌使之混合均匀,注入预先用胶带固定的玻璃板中进行聚合. 将上述变性胶放入电泳槽中,倒入1 × TBE电泳缓冲液. 取2 μL 相应的样品,分别混合10 μL 50% 甲酰胺后注入胶孔,设定电泳电压为450 V,室温下电泳3 h. 电泳完成后将胶取出,用配制的Stains all染色10 min,放入凝胶成像仪(Bio Rad公司,ChemiDOC XRS+型号)中拍照保存.

1.3.2 组装体凝胶电泳实验

量取25 mL 20%非变性胶单体溶液(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为19∶1),5 mL 10 × TAE-Mg2+ 和20 mL 水于100 mL 烧杯中,按照上述变性胶的制备方法聚合成胶. 将制好的非变性胶放入电泳槽中,倒入1 × TAE-Mg2+ 电泳缓冲液. 取5 μL相应的样品,分别混合10 μL 50%蔗糖后注入胶孔,在4 °C冰箱中设置电压100,200和300 V 分别电泳1 h,之后在 350 V 电压下电泳 2 h. 电泳完成后将胶染色并拍照保存.

1.4 DNA组装体解链温度的测定

将组装体稀释至浓度为5 μmol/L,取500 μL 装入光程为1 cm的石英比色皿(带塞,防止样品加热时挥发)中,用Varian公司Bio Cary-100 UV-Vis光谱仪测定样品在260 nm处紫外吸收值随温度变化的情况. 设定温度扫描范围为4 °C到95 °C,升温速率为1 K/min,测试组装体的变温曲线,将数据进行处理得到组装体的解链温度.

1.5 圆二色吸收光谱的测定

将组装体稀释至浓度为5 μmol/L,取500 μL装入光程为1 cm 的石英比色皿中,室温下用Applied Photophysics公司的Chirascan CD测定样品在不同波长下的吸收值. 扫描波长范围220 ~ 300 nm,扫描速度为0.5 nm/s,狭缝宽度为1 μm.

1.6 水凝胶形成

取单链DNA溶于缓冲液中(50 mmol/L MES,12.5 mmol/L MgCl2,pH = 7.5),在95 °C下恒温 5 min后自然退火至室温,再加入HCl调节溶液 pH至5.3.

1.7 流变学表征

采用Malvern公司的Kinexus流变仪对凝胶样品进行力学测试,对不同浓度、不同pH以及不同温度下的DNA水凝胶进行表征. 取40 μL DNA水凝胶放置在测试台上,设置测试参数:8 mm平行板,平行板与测试台间距为0.15 mm,根据不同实验需求选用不同测量模式进行测试.

2 结果与讨论 2.1 DNA纳米线的形成

为了使所设计的DNA单链20-11i(5'-CC CCTAACCCCCATCGCGATGGACTGCAGTC-3') 在12.5 mmol/L MgCl2 的盐浓度下组装成一维纳米线,须使其两段自互补序列SC-1(5'-CATCGC GATG-3')和SC-2(5'-GACTGCAGTC-3')分别通过分子间互补配对形成双链,而非通过分子内互补形成颈环结构. 为了探究其组装过程,我们设计了2组对照组,一组是含有10个碱基的DNA单链10-H(5'-CGCAAAAGCG-3'),该单链在上述盐浓度下会形成颈环结构;另一组是2条完全互补的DNA单链10-1(5'-CACACACACC-3')和10-2(5- GGTGTGTGTG-3'),每条单链含有10个碱基,这2条单链在上述盐浓度下会组装形成双链结构. 我们将上述实验组与对照组分别进行组装,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对组装体进行表征,通过条带位置的比对,就可以判断出两段自互补序列的组装情况.

首先,利用2.2节中所述的单链凝胶电泳实验来检测实验过程中所用到的DNA单链的纯度,结果如图 2(a)所示,含有10个碱基的序列(10-H、10-1、10-2、SC-1、SC-2)基本处于同一位置,均离胶孔相对较远,而含有31个碱基的序列20-i迁移速度相对较慢,位置更靠近胶孔,并且所有样品均呈现单一清晰的条带,这表明我们合成的DNA单链纯度很高.

Fig. 2 (a) 20% Denaturing PAGE (19:1) analysis of purified DNA strands: 10-H,5′-CGCAAAAGCG-3′; 10-1, 5′-CACACACACC-3′; 10-2, 5′-GGTGTGTGTG-3′; SC-1,5′-CATCGCGATG-3′; SC-2, 5′-GACTGCAGTC-3′; 20-i, 5′-CCCCTAACCCCCATCGC GATGGACTGCAGTC-3′; (b) MALDI-TOF-MS of 20-i single strand

我们又利用MALDI-TOF-MS对20-i的分子量进行了表征,如图 2(b)所示,可以看到质谱谱图在分子量为9344处有一个单一主峰,而通过理论计算20-i的分子量为9362,实验值与理论值在误差范围内基本吻合,证明所合成的20-i序列正确.

随后将上述单链(100 μmol/L)在1 × TAE缓冲液(含12.5 mmol/L MgCl2)中加热至95 °C恒温 5 min,自然退火至室温进行组装,并利用2.2中组装体凝胶电泳实验来检测组装情况. 10-D是由上述单链10-1与10-2组装而成的双链结构,如图 3(a)所示,2段自互补序列SC-1、SC-2的条带位置与双链结构10-D相同,均比颈环结构10-H迁移速度慢,这是因为颈环结构体积较小,相同电压下更容易通过聚丙烯酰胺胶的胶孔,这也证明两段自互补序列在上 述条件下只会形成双链结构,从而为20-i分子间自组装形成DNA纳米线提供了可能. 最右边的条带是20-i的组装结果,样品条带在胶孔附近,迁移速度很慢,证明形成了高级组装结构,为之后水凝胶的形成提供可能.

Fig. 3 (a) 10% Native PAGE (19:1) analysis of DNA assemblies in TAE buffer containing 12.5 mmol/L MgCl2; (b) UV-Vis spectra for the melting temperature of the DNA assemblies

随后,利用2.3节中所述的方法对20-i组装体的熔点进行了表征,如图 3(b)所示,测得组装体的熔点为52.1 °C,远高于室温,这证明组装体在室温条件下具有良好的稳定性,为之后室温条件下原位形成水凝胶提供了可能.

2.2 I-motif 结构表征

利用2.4节所述方法通过圆二色吸收光谱对组装体结构进行了表征. 如图 4所示,在pH = 7.5条件下,组装体在275 nm处出现正峰,在240 nm处出现负峰,与DNA双螺旋结构的特征峰相吻合,证明在pH = 7.5的条件下20-i组装体中存在双链结构. 当pH变为5.3时,组装体的正峰吸收波长增大至285 nm,负峰吸收波长增大至260 nm,与i-motif结构的特征峰相吻合,证明在pH = 5.3的条件下,20-i组装体中有双分子i-motif结构形成[26].

Fig. 4 The circular dichroism spectra (CD) of 20-i in buffers of different pH values
2.3 水凝胶形成及其力学强度表征

基于以上组装原理,取DNA单链溶于缓冲液(50 mmol/L MES,12.5 mmol/L MgCl2,pH = 7.5)中,使其浓度为3 mmol/L,合固含量2.8 wt%. 在95 °C下恒温5 min后自然退火至室温,然后加

入HCl调节溶液pH至5.3. 如图 5(a)所示,加入HCl后,样品黏度变得很大,将EP管倒置样品也不会流下,我们推测可能形成了凝胶. 之后我们利用流变仪对样品进行时间扫描模式测试. 如图 5(b)所示,pH = 7.5时,样品的储能模量和损耗模量很小,低于仪器的检测范围,所以可以认为样品处于溶液状态;当pH降为5.3时,样品的储能模量为243.9 Pa,损耗模量为48.0 Pa,储能模量大于损耗模量,说明形成了水凝胶[27].

Fig. 5 Rheological testing for the hydrogel: (a) hydrogel formation, (b) time-scan test, (c) strain-scan test and (d) temperature-ramp test

我们又对样品进行了应变扫描模式测试. 如图 5(c)所示,当剪切应变在50%以下时,随着剪切应变的增加,DNA水凝胶的模量保持稳定,储能模量约为225.0 Pa,损耗模量约为48.0 Pa;当剪切应变大于50%后,随着剪切应变的增加,DNA水凝胶的储能模量在小幅上升后开始降低,损耗模量开始升高,当剪切应变增加至103%时,二者出现交点,之后储能模量小于损耗模量. 这说明在剪切应变低于50%时,样品的力学强度较为稳定,而之后随着剪切应变的增加,样品的力学强度开始下降,直至剪切应变增加至103%时,样品发生了凝胶-溶胶的转变,这证明该水凝胶具有良好的剪切变稀性能. 最后还研究了温度对水凝胶力学强度的影响,如图 5(d)所示,通过温度扫描模式测试,发现随着温度不断升高,样品储能模量缓慢降低,在33.0 °C 时与损耗模量相交,该交点即为样品凝胶-溶胶转变点.

2.4 浓度对凝胶力学性质的影响

通过改变起始单链浓度来探究浓度对凝胶力学性质的影响. 如图 6(a)所示,当单链浓度为0.5和1 mmol/L时,样品储能模量和损耗模量均低于仪器的检测范围,样品处于溶液状态;当浓度为2 mmol/L时,样品储能模量达到48.6 Pa,损耗模量达到9.8 Pa,储能模量大于损耗模量,证明样品处于凝胶状态. 当浓度大于2 mmol/L时,随着单链浓度的增大(即固含量增大),水凝胶的储能模量和损耗模量均有所升高,表明水凝胶的力学强度会随着单链浓度的增大而升高. 这是因为单链浓度升高会使水凝胶的交联密度变大,从而使其力学强度得到提高.

Fig. 6 (a) Rheological properties and (b) time-scan test for hydrogels at different concentrations

之后对2.0、3.0、4.0 mmol/L浓度的样品进行了温度扫描模式测试. 如图 6(b)所示,不同浓度的样品的凝胶-溶胶转变温度均在33 °C左右,说明固含量的改变基本不会影响凝胶-溶胶的转变温度,这证明样品的热稳定性不会随浓度的改变而发生变化. 我们推测这是因为浓度改变不会对双链和i-motif结构的稳定性产生很大影响,所以水凝胶的稳定性也基本不会发生变化.

2.5 pH值对凝胶力学性质的影响

利用流变仪研究了不同pH值条件下水凝胶(3 mmol/L)力学性质的变化. 如图 7(a)所示,随着pH的下降,水凝胶的力学强度呈现上升的趋势,流变学数据显示,当pH从6.0 降到5.3时,水凝胶的储能模量从225.7 Pa上升到243.9 Pa. 这是因为交联点i-motif结构的稳定性会随着pH的下降而升高[28],从而使水凝胶网络结构的强度增加. 但是当pH下降至5.0时,水凝胶的力学强度大幅度下降,其储能模量只有57.4 Pa. 这是因为水凝胶的力学强度不仅取决于作为交联点的i-motif结构,同时也与DNA双链的稳定性有关. 当pH由5.3降至5.0时,虽然i-motif结构的稳定性有所升高,但是双链的稳定性出现大幅下降,从而导致水凝胶网络结构的整体强度降低[29]. 以上结果也说明我们不仅可以用调节pH的办法控制水凝胶是否形成,而且可以通过调控pH梯度控制水凝胶力学强度的大小.

Fig. 7 (a) Rheological properties and (b) time-scan test for hydrogels at different pH values

之后对不同pH条件下的样品进行了温度扫描模式测试. 如图 7(b)所示,在pH = 5.3 时,水凝胶的凝胶-溶胶转变温度最高,达到33.5 °C,pH升高或降低都会使凝胶-溶胶转变温度下降,且变化趋势与力学强度的变化趋势相同. 这是因为pH的改变影响了双链结构和i-motif结构的热稳定性,从而使水凝胶的热稳定性也发生变化.

2.6 凝胶pH响应的可逆性

最后,研究了DNA水凝胶pH响应的可逆性. 如图 8(A)所示,首先利用2.5节所述方法将DNA单链在含有12.5 mmol/L Mg2+、pH = 7.5的MES缓冲液中进行退火组装,得到溶液(a),加入HCl调节pH至5.3,水凝胶快速形成(b),随后再向样品中加入NaOH调节pH至7.5,样品很快又从凝胶变为溶液(c). 上述过程可以反复重复,如图 8(B)所示,经过多次重复水凝胶的力学强度也不会出现明显降低,这说明我们可以通过调控pH来实现样品在溶液和凝胶两态之间的迅速转变.

Fig. 8 (A) The pictures and the (B) rheological test of DNA hydrogel from sol to gel with pH change
3 结论

本文报道了一种只用单根DNA短链原位快速形成pH响应超分子水凝胶的方法. 此方法只用到一条DNA链,无需涉及不同DNA链定量配比的问题,简化了实验操作,并且可以通过调控单链浓度及pH来调控凝胶力学强度及热稳定性. 该方法体现了DNA分子构建响应性生物材料的优势,有望应用于药物可控释放、生物传感和3D打印等领域.

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