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  福建农业学报  2017, Vol. 32 Issue (4): 425-430  
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罗奉奉, 张昌伟, 莫亚玲, 等. 桑园土壤中高产纤维素酶菌株的筛选与鉴定[J]. 福建农业学报, 2017, 32(4): 425-430.
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Luo F-F, Zhang C-W, Mo Y-L, et al. Screening and Identification of High Cellulase-producing Bacteriafrom Soil at Mulberry Fields[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2017, 32(4): 425-430.
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基金项目

广西高校微生物及植物资源开发利用重点实验室开放课题(2015HL008);河池学院重点科研课题(XJ2016ZD002)

通讯作者

岑忠用(1977-), 男, 副教授, 主要从事植物生理与微生物资源研究(E-mail:zhongyong20@163.com)

作者简介

罗奉奉(1986-), 女, 讲师, 主要从事资源环境微生物研究(E-mail:bang131212@163.com)

文章历史

收稿日期: 2016-10-05 初稿
2016-11-29 修改稿
桑园土壤中高产纤维素酶菌株的筛选与鉴定
罗奉奉, 张昌伟, 莫亚玲, 岑忠用     
河池学院化学与生物工程学院, 广西 宜州 546300
摘要: 为获得高产纤维素酶菌株,以桑园土壤为对象筛选纤维素酶产生菌。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作唯一碳源,利用刚果红染色法从桑园土壤中筛选得到12株产纤维素酶菌株,其中菌株YZB46产酶效果最好,经酶学性质初步分析,YZB46在pH 6.0、40℃条件下发挥最佳内切葡聚糖酶活性,为17.08 U·mL-1,经传代,YZB46的产纤维素酶能力能稳定遗传。通过形态观察、革兰氏染色、生理生化特征及16S rDNA分析,发现菌株YZB46与芽孢杆菌属的Bacillus cereus同源性达99%,并将菌株YZB46鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
关键词: 纤维素酶    筛选    鉴定    
Screening and Identification of High Cellulase-producing Bacteriafrom Soil at Mulberry Fields
LUO Feng-feng, ZHANG Chang-wei, MO Ya-ling, CEN Zhong-yong     
College of Chemical and Biological Engineering, Hechi Vniversity, Yizhou, Guang xi 546300, China
Abstract: High cellulase-producing strains of microorganisms were screened and identified from soil at mulberry fields. Using CMC-Na as the sole carbon source, 12 target bacteria were isolated with Congo red dyeing. YZB46 was found to show the greatest cellulasesecretion among all. Preliminary analysis on thesecreted metabolitesindicated that the endo-cellulaseactivityreached 17.08 U·mL-1 at pH 6.0 and 40 ℃, and the enzymedisplayed a desirable genetic stability. Based on the results of morphological observation, gram-staining, physiological and biochemical characterizations, as well as 16S rDNA sequencing, the isolated YZB46 appeared to beclosely related to Bacillus cereus.
Key Words: cellulase    screening    identification    

纤维素酶在纺织、造纸、饲料、食品、医药等领域已得到广泛的应用[1-2],而且在能源开发上也是当今研究热点[3],不仅成本低,且可将纤维生物质废弃物再利用。随着技术进步和应用推广,纤维素酶将实现酶工业化应用[4-5]。现已有来自昆虫、真菌、放线菌、细菌等来源的纤维素酶的研究和应用报道[6-7],但纤维素酶活力及产量差异,工业化应用难度还较大[8]。秦翠静等[9]从菌糠中筛选得到高产纤维素酶的菌株S-4,初步确定为枯草芽孢杆菌,其纤维素酶活(内切葡聚糖酶,CMCase)为67.5 U·mL-1;赵萍等[10]以玉米秸秆诱导分离到一株羊毛状青霉PL2#具有较高的纤维素酶活性,CMCase为27.01 mg·L-1;梅凡等[11]从温泉中筛选得到产纤维素酶的嗜热细菌LY8,鉴定属土芽孢杆菌属Geobacillus,其CMCase为145 U·mL-1;Refaz Ahmad Dar等[12]以羧甲基纤维素(CMC)为碳源获得植物内生菌的CMCase为16.8 U·mL-1;Karina I Dantur等[13]在以蔗渣为唯一碳源的培养基上从蔗杆草螟幼虫肠道内分离得到118株菌株,其中经鉴定得出短小芽孢杆菌Kd101的CMCase最高,为0.32 U·mL-1。因此从自然环境中筛选高产纤维素酶的菌种对有效利用纤维素资源、实现生产规模化有重要意义,也是获得优良菌株的前提[14-15]。环境中富含纤维素资源的来源较为广泛,如桑树在种植过程中会因剪枝产生大量桑枝条,桑枝条常被丢弃或焚烧于桑园土壤中,长年累月形成一定的腐殖土壤,含丰富的纤维素资源。本研究从广西宜州常年种植桑树园地的土壤中筛选高产纤维素酶的菌株,以期获得具有较强内切纤维素酶活性的菌株,为有效利用纤维素废弃物,适应纤维素酶工业化生产需求提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品

土壤样品采集于广西宜州桑园地,取距土壤表层5~20 cm的土壤。

1.1.2 培养基

富集培养基:蛋白胨0.3 g,酵母膏0.1 g,KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CMC-Na 10 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.4。

筛选培养基:蛋白胨0.3 g,酵母膏0.1 g,NH4NO3 1 g,KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CMC-Na 10 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.4。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基:蛋白胨0.5 g,NH4NO3 1 g,KH2PO4 2 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl2·2H2O 0.3 g,CMC-Na 10 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.4。

产酶培养基:蛋白胨5 g,酵母膏5 g,NH4NO3 2 g,KH2PO4 4 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl2·2H2O 0.3 g,CMC-Na 10 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.4。

种子培养基:PDA培养基,马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,pH自然,蒸馏水定容至1 000 mL。

菌种鉴定培养基:参见《常见细菌系统鉴定手册》[16]

以上培养基均121℃灭菌20 min备用。

1.1.3 主要仪器和试剂

试剂:所有试剂均为国产分析纯。仪器:Hirayama高压灭菌锅HVE-50,梅特勒-托利多电子分析天平BP121S,SW-CJ-IF型超净工作台,HYG-型恒温摇床,奥林巴斯荧光显微镜等。

1.2 方法 1.2.1 纤维素降解菌的富集、分离

称取20 g土壤于200 mL含玻璃珠的蒸馏水中振荡2 h,制备菌悬液,以10%的接种量接到富集培养基中,30℃培养2 d。然后以无菌水梯度稀释至10-6,取10-4、10-5、10-6各200 μL涂布于筛选培养基平板,每个稀释度3次重复,30℃培养48 h。培养期间根据形态、颜色、大小等情况挑取单菌落至种子培养基备用。

1.2.2 纤维素酶产生测定

分离得到的菌株接种至CMC-Na培养基上30℃培养,每天观察生长情况,并用刚果红染色法挑取产生水解圈的菌株,测定水解圈直径(D)和菌落直径(d)。对D/d比值较大的单菌落进行纯化[17],至少纯化3次以上获得纯培养物。

1.2.3 菌种保存

将初步纯化的产纤维素酶菌株接种至液体CMC-Na培养基,30℃培养24 h后,加30%灭菌甘油(1:1),保存于-20℃冰箱。

1.2.4 CMC酶活曲线测定

产酶菌株于产酶培养基中培养,30℃、180 r·min-1振荡培养12、24、36、48、60 h。取发酵液离心5 000 r·min-1、15 min,获得上清液即为粗酶液,以CMC-Na为底物,测定菌株CMC酶活,测定方法参照文献[18],即:取粗酶液0.5 mL,加入经50℃预热的含0.5%CMC-Na的柠檬酸缓冲液(pH 5.0,0.05 mol·mL-1)1.5 mL中,混匀,50℃水浴30 min后,加1.5 mL DNS试剂,5 min沸水浴后,迅速冷却至室温,去离子水定容至20 mL,以灭活的粗酶液为对照组,在540 nm处测吸光值,对照葡萄糖标准曲线计算酶活。

酶活力单位定义:在50℃,pH 5.0条件下,每1 min产生的1 μmol的葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位(U·mL-1)。

1.2.5 粗酶液最适反应温度测定

在pH 5.0条件下,将菌株粗酶液置于不同温度下(20~70℃),10℃做一个梯度,进行CMC酶活反应测定,筛选酶的最适反应温度。

1.2.6 粗酶液最适反应pH测定

在50℃条件下,将菌株粗酶液置于不同pH下(3.0~9.0),进行CMC酶活反应测定,筛选酶的最适反应pH。

1.2.7 菌株产酶能力稳定性测定

菌株保存后,按周传代,半年内至少传代10次以上,并在最适条件下检测酶活。

1.2.8 培养特征观察及生理生化鉴定

菌落形态特征、菌落颜色、大小、革兰氏染色等观察参照《微生物学实验教程》[19];生理生化鉴定参考文献[16]方法进行。

1.2.9 菌株分子生物学鉴定

菌株选择细菌通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')、1492R(5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')扩增16S rDNA,由华大基因有限责任公司进行序列测定。测序结果经BLAST,并与GenBank数据库的基因序列同源性比对,采用MEGA4.0软件的Neighbor-Joining法构建进化树。

2 结果与分析 2.1 纤维素降解菌的分离与筛选

根据菌落生长情况,经分离纯化筛选后,得到162个菌株,编号YZB1~162。

2.2 纤维素酶测定

获得菌株在筛选培养基上培养48 h后加刚果红染色,部分菌株染色结果如图 1。比较水解圈直径和菌落直径大小。结果有9株产生水解圈,各菌株水解圈直径(D)与菌落直径(d)之比见表 1。其中,挑取菌株D/d比值最大的YZB46为下一步鉴定。

图 1 部分菌株刚果红染色结果 Figure 1 Strains after Congo red dyeing
表 1 菌株水解圈直径与菌落直径比值 Table 1 Ratio ofcolonyto transparent areadiameters
2.3 CMC酶活测定

菌株YZB46在30℃下进行产酶发酵,测定其CMC酶活力,根据葡萄糖标准曲线,测定在不同发酵时间(12、24、36、48、60 h)菌株YZB46的酶活力,如图 2所示,由曲线可知,YZB46的最佳产酶时间在36 h,达到峰值,酶活力为13.94 U·mL-1

图 2 YZB46菌株不同发酵时间的酶活力 Figure 2 Cellulase activities of metabolites after fermentation for varied durations
2.4 粗酶液最适反应温度

菌株YZB46的粗酶液在不同温度下与底物CMC-Na反应后,测定酶活力,结果如图 3,在40℃时酶活力为最佳,随着温度的升高,酶活力呈下降趋势。说明高温不适应YZB46分泌的纤维素酶发挥活性。

图 3 不同温度对YZB46的纤维素酶活力影响 Figure 3 Effect of temperature on cellulase activity of YZB46 metabolites
2.5 粗酶液最适反应pH

菌株YZB46的粗酶液在最适温度中进行不同pH条件下的酶活力测定,结果如图 4所示,在pH 5.0~6.0范围内处于较高酶活性,pH 6.0时酶活力达17.08 U·mL-1,说明YZB46所产的纤维素酶能在偏酸性的条件下保持较高的酶活力。

图 4 不同pH对YZB46的纤维素酶活力的影响 Figure 4 Effect of pH on cellulase activityof YZB46 metabolites
2.6 菌株产酶稳定性

菌株YZB46共传代10次,在最适条件下测定YZB46的纤维素酶活力,结果见表 2,在前3代以内产酶活力有所下降,第4代后保持在12.45 U·mL-1左右,说明YZB46具有较好的产酶遗传稳定性。

表 2 YZB46菌株不同传代次数的酶活力 Table 2 Cellulase activities inmetabolites of YZB46 in different generations
2.7 菌株鉴定 2.7.1 形态特征观察

菌株YZB46在种子培养基上长势良好,30℃培养48 h菌落直径达4 mm,呈白色不透明、质地致密、表面湿润的圆形菌落;经革兰氏染色后,在显微镜下观察,如图 5可知,YZB46为革兰氏阳性,短杆状。

图 5 YZB46菌株革兰氏染色结果 Figure 5 Gram-staining on YZB46
2.7.2 生理生化鉴定

菌株YZB46生理生化试验结果见表 3。可知,菌株YZB46与芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌(B.cereus)特征相符。

表 3 菌株YZB46生理生化反应特征结果 Table 3 Physiological and biochemical characteristics of YZB46
2.7.3 YZB46的分子生物学鉴定

经测序,对YZB46的16S rRNA序列进行BLAST分析,从GenBank数据库中选取部分相似序列,用ClustalX软件进行多序列比对,并在MAGE4.0软件中(NJ法)构建进化树(图 6),由结果可看出,YZB46与芽孢杆菌属(Bacillus)同源性较高,特别是与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)同源性达99%。综合形态特征、生理生化特征比较,鉴定YZB46为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

图 6 菌株YZB46的16srRNA系统发育树 Figure 6 Phylogenetic tree based on 16srRNA sequences of YZB46
3 讨论与结论

目前对纤维素酶产生菌也有一些来自芽孢杆菌属[20-25],如短小芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等,但酶学性质上有所差异,而芽孢杆菌具有环境适应性强、产酶活性高等优点,有利于工农业应用。Venkata等[26]研究得出土壤纤维素酶产生菌B.cereus为潜在菌株,Yang JK等[27]也表明芽孢杆菌中蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌能产生较高纤维素酶活性,而Patagundi等[28]研究表明分离出土壤中B.cereus产生的纤维素酶活性最高。本研究初步确定YZB46具有内切葡聚糖酶活性,与Afzal等[29]从土壤中筛选得到Bacillus cereus MRLB1具有内切葡聚糖酶活性研究一致。内切葡聚糖酶主要对纤维素多糖链内无定型区作用切割,形成寡糖,在纤维素降解中起到重要的作用。而从桑园中筛选得到产内切葡聚糖酶的蜡样芽孢杆菌鲜见报道,在桑园土壤环境下筛选得到的产纤维素酶菌株可能与桑树桑枝有一定的关系,这为后续优化菌株的产酶条件,提高菌株产酶活性奠定基础。

本研究从桑园土壤中筛选得到的菌株YZB46在30℃下培养36 h后得到CMC酶活性最高,为13.94 U·mL-1,经初步的酶学性质研究,得到在pH 6.0,40℃条件下,YZB46分泌的纤维素酶可发挥酶的最佳活性,达到17.08 U·mL-1,经传代,其产纤维素酶能力具有良好的遗传稳定性,是一株具有开发潜力的菌株。通过形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定,将YZB46鉴定为蜡样芽孢杆菌。

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