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  福建农业学报  2016, Vol. 31 Issue (12): 1280-1288  
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邵恩斯, 林辉, 江书朋, 等. 两种芦竹(Arundo donax L.)的生物量及分子转录水平的差异性分析[J]. 福建农业学报, 2016, 31(12): 1280-1288.
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SHAO E-S, LIN H, JIANG S-P, et al. Biomasses and Transcript Levels of Aundo donax L. Species[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2016, 31(12): 1280-1288.
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基金项目

福建农林大学国家菌草工程技术研究中心开放课题(JCJJ14012)

通讯作者

林占熺(1943-), 男, 研究员, 研究方向:菌草工程技术(E-mail:lzxjuncao@163.com)

作者简介

邵恩斯(1985-), 男, 博士, 助理研究员, 研究方向:分子生物学

文章历史

收稿日期: 2016-03-12 初稿
2016-05-14 修改稿
两种芦竹(Arundo donax L.)的生物量及分子转录水平的差异性分析
邵恩斯1, 林辉1, 江书朋2, 陈碧成1,3, 李晶1, 林洁荣1,3, 林占熺1     
1. 福建农林大学国家菌草工程技术研究中心, 福建 福州 350002;
2. 福建农林大学作物学院, 福建 福州 350002;
3. 福建农林大学动物科学学院, 福建 福州 350002
摘要: 芦竹Arundo donax L.由于其生长快速、抗逆性强、蛋白含量高等优点,正以重要能源植物的定位受到越来越多的重视。本研究针对本单位收集的源自我国山东省烟台市及福建省福州市永泰县的2种芦竹进行叶片形态、生物量及营养物质含量等生物学特性分析,发现2个芦竹品种在干物质产量、水分含量、纤维含量、粗灰分含量等指标上存在一定差异性。基于上述差异性,对2个芦竹品种的叶片进行Illumina高通量测序分析,构建芦竹转录组数据库。通过de novo的方法对获得的转录组数据进行组装,并预测各组装获得Unigene的开放阅读框,从而获得可能的蛋白氨基酸序列。通过基因表达量差异性分析,筛选2个芦竹品种中表达量差异显著的基因,并将上述基因与Gene Ontology(GO)、Eukaryotic Orthologous Groups of proteins(KOG)及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)等数据库比对分析,预测差异表达基因的功能及参与的代谢信号通道。针对与生物量及生物乙醇产量相关的代谢途径的分析发现,2个芦竹品种在碳固定光合作用、淀粉/糖代谢及木质素合成相关的信号通道中关键酶基因的表达量上具有显著差异。上述结论从生物学及生物信息学角度分别分析了源自我国不同地域的芦竹品种在生物产量及生物质能源相关指标上的差异性。研究结论为筛选芦竹品种作为优质生物质能源草种提供了依据。
关键词: 芦竹    生物质能源    产量    叶片    转录组    差异表达基因    
Biomasses and Transcript Levels of Aundo donax L. Species
SHAO En-si1 , LIN Hui1 , JIANG Shu-peng2 , CHEN Bi-cheng1,3 , LI Jing1 , LIN Jie-rong1,3 , LIN Zhan-xi1     
1. China National Engineering Center of JUNCAO Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. College of Tropical Crops, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
Abstract: Arundo donax is a promising crop for bioenergy as it is fast growing, stress-tolerant and high in protein content. The morphological characteristics and biomass yields of A. donax species originated from Yantai, Shandong and Fuzhou, Fujian were compared. Transcriptome analysis in the leaf RNA of both species were conducted by Illumina sequencing. Their expression levels were calculated, and differently expressed genes screened and annotated with databases from sources including Gene Ontology (GO), euKaryotic Orthologous Groups (KOG) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Further analyses on the signal pathways, such as carbon fixation in photosynthetic organisms, starch and sucrose metabolism and phenylpropanoid biosynthesis, showed significant differences on the expressions of some key enzymes in them. The results provided a useful clue in selecting and breeding A. donax for bioenergy.
Key Words: Arundo donax    bioenergy    biomass    leaf    transcriptome    expression level    

随着绿色能源产业的日渐发展,生物质能源作为一种优质的清洁碳源已受到越来越多的关注。当前,通过发酵生物获得的生物质能源乙醇、甲烷等已经能够作为交通运输工具的燃料,为未来缓解燃油发动机造成的空气污染及能源短缺提供了可持续的解决方案[1]。已有研究显示,从水稻秸秆中能够提取到生物乙醇从而作为生物质能源使用[2]。尝试从其他禾本科植物提取生物乙醇以扩大生物质能源来源范围,并探索更高生物乙醇产量的植物品种能够为生物质能源的研究以解决能源紧缺问题提供更广阔的前景。

芦竹Arundo donax L.是禾本科芦竹属的多倍体C3植物,是与毛竹Phyllostachys pubescens、甘蔗Saccharum officenarum等经济作物近缘的物种,广泛分布于我国华东、华南及台湾地区[3],在亚洲、非洲及大洋洲热带地区也有发现[4],与芒草(Miscanthus spp., C4)、虉草(Phalaris arundinacea, C4)及柳枝稷(Panicum virgatum, C4)一起并称为4大潜在能源植物[5]。芦竹不仅被认为是一种重要的生物质能源植物,还被应用于中药、家畜饲料、造纸、管乐簧片制作、食用菌栽培及重金属吸附等[6-9]。针对我国东部及西部部分城市的芦竹品种研究显示,不同的芦竹品种在粗灰分、木质素及纤维素的含量上均存在差异,且芦竹茎、枝、叶片的木质素与纤维素含量呈递减趋势[10-11]。因此,源自不同地域不同环境下生长的不同芦竹品种在生物质能源产量上也存在差异性可能。

转录组测序是通过二代高通量测序技术获得物种或组织mRNA大数据的方法[12]。利用该方法在构建靶标物种或组织的转录本文库的同时,通过序列组装、比对、注释等方法对转录组数据进行一系列生物信息学分析,并能够预测出各基因在生物体或组织内的表达量及不同物种或处理间某基因的表达水平差异性,为分子层面的生物学研究提供了新的途径[13-14]。当前,针对芦竹的转录组研究已有所报道。Sablok等[5]于2014年率先公布了产于意大利佛罗伦萨的芦竹转录组数据,并对该品种芦竹叶片、茎秆及嫩芽中与生物质能源及生物量相关的基因进行了分析。Fu等[1]于2016年通过转录组分析的方法对意大利佛罗伦萨品系的芦竹的耐旱水平进行了分析,并发现芦竹转录组数据中存在大量耐寒、耐盐碱等抗逆性相关基因。

本研究对收集于山东省烟台市及福建省福州市永泰县的芦竹品种进行了田间种植和生物量及营养物质的分析。在此基础上对2个芦竹品种的叶片转录组进行了高通量测序。经过序列组装、基因功能注释及差异表达分析,对2个芦竹品种中参与生物量及生物质能源相关信号通道的基因表达水平进行了预测及差异性比较。本研究对筛选适合用做能源植物的芦竹品种提供了理论依据。

1 材料与方法 1.1 芦竹的品种来源与产量测定

本研究所采用山东芦竹品种引种自山东省烟台市,福建芦竹品种引种自福建省福州市永泰县。2个芦竹品种均种植于福建农林大学位于福建省福州市闽侯县的试验基地内。试验区海拔10 m,属亚热带季风气候区,2014年年平均气温20.8℃,极端高温38.1℃,极端低温2.0℃,年平均降雨量1 628 mm,年平均日照时数超1 789 h。实验植株于2014年4月进行种植,采用组培苗移栽的形式,种植密度株行距为60 cm×40 cm,人工浇水灌溉以保持土壤湿润。出苗后至封行前人工中耕除草。

实验设计采用随机区组加局部控制布局试验小区法,小区面积为2.40 m×5.0 m=12.0 m2,重复3次。生长8个月后,受试植株的产量于2014年12月进行产量测定。鲜草重量在切割后直接称量。干草重量利用烘箱干燥法处理后称量获得。

1.2 芦竹植株营养成分测定

芦竹营养成分的测定分别于植株生长100、130、160、190、220 d时进行。选择有代表性的样点取样,每个样本取2.0 kg。新鲜芦竹植株用刀切至3 cm片段后置于65℃烘箱中烘干至恒重。利用小型植物粉碎机(FW高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司)粉碎并过40目筛,密封保存备用。

营养成分测定方法如下。粗蛋白质:凯氏定氮法;粗脂肪:索氏抽提法;粗纤维:酸碱消煮法;中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维:范氏纤维测定法;粗灰分:550℃高温灼烧法;无氮浸出物:差减法计算。

1.3 芦竹叶片样品采集及叶片RNA的提取

芦竹叶片采集自芦竹成株,选择完全展开的健康嫩叶。采集获得的叶片组织立刻至于预冷的研钵中,并在液氮中研磨后利用植物组织RNA提取试剂盒(OMEGA,美国)提取叶片RNA。RNA提取步骤详见试剂盒说明书。RNA浓度及质量利用Nano Photometer分光光度计(IMPLEN,美国)及Qubit 2.0荧光分析仪(Life Technologies,美国)进行测定与分析。

1.4 转录组文库的构建及高通量测序

RNA建库共使用3 μg RNA,通过NEBNext Ultra Illumina RNA建库试剂盒(NEB,美国)进行。首先,利用Oligo (dT)的磁珠从总RNA中富集纯化出真核生物mRNA。加入Frangmentation Buffer将mRNA随机打断,以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链,并通过DNA聚合酶作用合成第二链,最后利用AMPure XP beads纯化cDNA。纯化后的双链DNA经过末端修复、加A尾后连接测序接头,用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后通过PCR富集完成文库构建。高通量RNA测序采用HiSeq2500系统进行双端测序,平均长度达125个碱基。

1.5 转录组数据的组装、基因功能注释及差异表达分析

将高通量测序获得的原始数据经过Illumina GA Pipline v1.3软件处理,除去测序引物、接头序列等人工序列,获得纯净数据。由于当前暂时没有芦竹基因组公布,因此处理后的数据利用Trinity v2.1.1进行de novo组装,以获得unigene序列[15]。组装获得的unigene序列利用BLAST软件分别与Gene Ontology (GO)[16]、Eukaryotic Orthologous Groups of proteins (KOG)[17]及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)[18]数据库进行比对以获得基因可能参与的信号通道及生理生化功能信息。基因表达量的分析通过计算每个unigene的FPKM值(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)进行[19]。差异表达基因的筛选利用EBSeq[20]方法,并采用Benjamini-Hochberg方法对原有假设检验得到的显著性P值进行校正,并最终采用校正后的P值,即FDR (False Discovery Rate)作为差异表达基因筛选的关键指标,以降低对大量基因的表达值进行独立的统计假设检验带来的假阳性。在筛选过程中, 将FDR<0.01且差异倍数FC (Fold Change)≥2作为标准。

2 结果与分析 2.1 山东及福建芦竹外观差异比较分析

山东芦竹与福建芦竹在整株外观上并未体现出显著差异性,但在叶片背面与茎秆交界处山东芦竹呈现乳白色,光滑状(图 1-A),而福建芦竹呈现淡绿色并带有毛刺(图 1-B)。

图 1 山东芦竹与福建芦竹叶片形态特征差异 Figure 1 Morphologies of A. donax leaves originated from Shandong and Fujian 注:A为山东芦竹叶茎交界处呈乳白色,没有毛刺;B为福建芦竹叶茎交界处呈淡绿色,有毛刺。
2.2 山东芦竹与福建芦竹产量及化学成分分析

两个芦竹品种的产量测定结果如图 2所示。源自福建的芦竹品种干草产量达到23.06 t·hm-2,干物质含量占31.01%,均高于源自山东的芦竹品种。而山东芦竹品种虽然干草产量相对较低,但其鲜草产量相较福建芦竹高,达到76.55 t·hm-2

图 2 山东芦竹与福建芦竹整株产量 Figure 2 Yields of A. donaxs originated from Shandong and Fujian

两个受试芦竹品种在营养成分上也存在差异性。如表 1所示,以生长100 d的芦竹为例,福建芦竹的粗蛋白质含量高于山东芦竹,而在酸性洗涤纤维含量上山东芦竹又略高于福建芦竹。此外,随着芦竹植株的生长,各测定的营养成分含量在2个芦竹品种中的变化规律基本一致。粗蛋白含量随着生长时间的增加呈现明显下降;中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量随着生长时间的增加呈现显著增加;其他成分变化不明显。此外,虽然2个芦竹品种在各营养成分含量上并未体现出显著差异,但福建芦竹的粗蛋白含量在各生长时间节点都略高于山东芦竹(表 1)。

表 1 山东芦竹与福建芦竹整株的化学成分 Table 1 Chemical compositions of A. donaxs plant originated from Shandong and Fujian
2.3 芦竹叶片转录组Illumina测序及组装

对山东芦竹及福建芦竹的叶片转录组Illumina测序分别获得了35 690 191(山东芦竹)及33 429 418(福建芦竹)个reads,测序总长达8 991 535 464(山东芦竹)及8 420 992 914(福建芦竹)个碱基,Q30皆大于88%,证明测序结果可信度良好。

鉴于二者在遗传关系上皆属于芦竹属植物,且暂无全基因组信息可供参考。我们将2组芦竹数据混合后,进行de novo组装,以求获得最大数量的contigs。针对2个芦竹品种的de novo组装共获得194 365个unigene,平均长度为666.87 bp。其中序列长度在200~500 bp的unigene数量达到126 855个,占总量的65.27%;长度在500 bp以上的unigene数量达到67 509个,占总量的34.73% (图 3)。

图 3 芦竹转录组unigene长度分布 Figure 3 Distribution in lengths of unigenes derived from A.donax transcriptome
2.4 山东芦竹与福建芦竹叶片转录组差异基因分布及功能注释

以FDR (False Discovery Rate)<0.01且差异倍数FC (Fold Change)≥2作为筛选标准。山东芦竹与福建芦竹转录组数据中,差异表达基因共9 735个,其中福建芦竹相对于山东芦竹表达量上调的基因数为2 776个,表达量下调基因数为6 959个,2组样品间的表达水平差异程度及其统计学显著性如图 4所示。

图 4 差异表达基因火山 Figure 4 Volcano plot of differently expressed genes in two A. donax species

横坐标表示芦竹转录组中的基因在2个芦竹品种转录组数据库中表达量差异倍数的对数值,其绝对值越大,说明表达量在两样品间的表达量倍数差异越大。纵坐标表示错误发现率的负对数值,其值越大,表明差异表达越显著,筛选得到的差异表达基因越可靠。图中绿色的点代表有显著性表达差异的基因, 红色的点代表无显著性表达差异的基因。

为了分析2个芦竹品种转录组在基因功能及代谢信号通道上的差异性,本研究分别利用Gene Ontology (GO)、euKaryotic Orthologous Groups (KOG)及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库对差异表达基因进行功能注释。针对GO数据库的二级节点功能注释结果显示,山东芦竹与福建芦竹的差异表达基因在多数功能聚类上均有分布。但是,在细胞组成(Cellular component)一级聚类中的extracellular region part、nucleoid、virion、extracellular matrix part、viron part、synapse、collagen trimer及synapse part分支;分子功能(Molecular function)一级聚类中的protein binding transcription factor activity、guanyl-nucleotide exchange factor activity、metallochaperone activity、translation regulator activity、channel regulator activity及protein tag分支;生物学过程(Biological process)一级聚类中的locomotion及cell killing分支中未有差异表达基因分布(图 5-A)。在KOG基因功能聚类分析中,2个芦竹品种的差异表达基因在General function prediction only聚类中分布丰度最高,然而在Cell motility及Nuclear structure两个分支中鲜有分布(图 5-B)。差异表达基因在KEGG数据库功能聚类分布情况如图 5-C所示。绝大多数差异表达基因均分布在代谢途径(Metabolism)与遗传信息处理(Genetic information processing)两大聚类中。在RNA transport与mRNA surveillance pathway中分布的差异基因最多,达到71个。在代谢途径中,2个芦竹品种在多种氨基酸代谢途径、淀粉代谢途径、糖代谢途径及脂肪酸代谢途径中均有差异表达基因分布,在嘌呤代谢(Purine metabolism)及淀粉与糖代谢(Starch and sucrose metabolism)途径中差异基因较多(图 5-C)。

图 5 差异表达基因在GO、KOG及KEGG数据库中的功能注释聚类情况 Figure 5 Annotation clusters in GO, KOG and KEGG database of differently expressed genes 注:A为差异表达基因在GO数据库中的功能注释聚类分布;B为差异表达基因在KOG数据库中的功能注释聚类分布;C为差异表达基因在KEGG数据库中的功能注释聚类分布。
2.5 差异表达基因在生物量及生物能源相关代谢途径中的分布

为了进一步分析2个芦竹品种在生物量上的差异,将山东芦竹与福建芦竹叶片转录组中差异表达基因与KEGG数据库中参与光合作用碳固定相关的信号通道(Carbon fixation in photosynthetic organisms,ko00710)及淀粉/糖代谢相关信号通道(Starch and sucrose metabolism,ko00500)的酶进行比对。共有10种参与光合作用碳固定的酶相关基因在2个芦竹品种叶片转录组中有显著表达量差异。其中参与该代谢通路的转羟乙醛酶(transketolase, EC:2.2.1.1)相关基因在山东芦竹中的表达量显著高于福建芦竹。而与磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase, EC:5.3.1.1)、甘油醛--磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, EC:1.2.1.12)、核酮糖二磷酸羧化酶(ribulose-bisphosphate carboxylase, EC:4.1.1.39)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase NADP+, EC:1.1.1.82)及丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, EC:2.7.9.1)相关的基因在山东芦竹叶片转录组中相对于福建芦竹,其表达量较低。此外,天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, EC:2.6.1.1)等5种酶相关基因转录水平在2个芦竹品种叶片中也具有显著的上调或下调趋势(图 6-A)。在淀粉/糖代谢信号通道中,福建芦竹在果聚糖酶(levanase, EC:3.2.1.65)、葡萄糖脱氢酶(UDPglucose 6-dehydrogenase, EC:1.1.1.22)及淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase, EC:2.4.1.1)相关基因上较之山东芦竹均有更高的表达水平。反之,在β-呋喃果糖苷酶(fructofuranosidase, EC:3.2.1.26)、海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose 6-phosphate synthase, EC:2.4.1.15)、1, 3-β-葡聚糖合成酶(1, 3-beta-glucan synthase, EC:2.4.1.34)、1, 3-β-葡萄糖苷酶(1, 3-beta-glucosidase, EC:3.2.1.58)以及α-淀粉酶(alpha-amylase, EC:3.2.1.1)相关基因的转录水平上,福建芦竹显著低于山东芦竹。在果胶酯酶(pectinesterase, EC:3.1.1.11)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase, EC:3.2.1.3)及1, 4-α-葡聚糖分支酶(1, 4-alpha-glucan branching enzyme, EC:2.4.1.18)相关基因的转录水平上2个芦竹品种互有高低但也呈现出显著的潜在转录水平差异(图 6-B)。木质素合成在生物质能源植物的一项重要指标,与多糖-乙醇转化率及产量密切相关[21-23]。而在植物体中苯丙素合成信号通道(Phenylpropanoid biosynthesis, ko00940)又与木质素合成直接相关。在山东芦竹与福建芦竹转录组中,大量基因被发现参与了苯丙素合成。其中,山东芦竹在苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase, EC:4.3.1.24/4.3.1.25)及肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase, EC:1.2.1.44)相关基因的转录水平上显著高于福建芦竹。而福建芦竹在松柏基乙醛脱氢酶相关基因的表达量上则高于山东芦竹。在与4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase, EC:6.2.1.12)、肉桂醇脱氢酶(cinnamyl-alcohol dehydrogenase, EC:1.1.1.195)、β-糖苷酶(beta-glucosidase, EC:3.2.1.21)及过氧化物酶(peroxidase, EC:1.11.1.7)相关基因的转录水平上,2个芦竹品种各有高低(图 6-C)。大量相关基因的转录水平的显著差异证明福建芦竹与山东芦竹在生物量及生物质能源转化率等功能上存在差异性。

图 6 芦竹品种转录组中与生物量及生物乙醇相关信号通道基因差异表达情况 Figure 6 Three biomass and bio-ethanol related signaling pathways in A. donax 注:红色边框表示山东芦竹叶片转录组中表达量显著高于福建芦竹的酶;绿色边框表示山东芦竹叶片转录组中表达量显著低于福建芦竹的酶;蓝色边框表示与该酶相关的基因在山东芦竹与福建芦竹中表达量互有高低;蓝色背景表示在芦竹转录组中发现的参与该信号通道的酶;方框中的编号为KEGG数据库中的酶编号,可在KEGG数据库中检索(http://www.kegg.jp/kegg/annotation/enzyme.html)。
3 讨论与结论

虽然针对芦竹的生物能源相关生物学特征及功能已有所研究。然而,对不同地域芦竹在形态上的差异却鲜有报道。本研究所采用的山东烟台及福建永泰芦竹在叶片形态特征上有显著差异,说明不同生态环境下生长出的同种植物在存在形态上分化的可能。

随着有关芦竹运用在生物质能源方面的研究逐渐增加,针对其作为生物质能源植物的相关生物特性的研究也日渐增多。曾汉元等2012年的研究发现,来自浙江、杭州、南京、湖南、江苏、云南等地的不同芦竹种群在木质素及纤维素产量上菌有所差异[10]。本研究对不同生长时间的山东芦竹与福建芦竹粗纤维、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维含量的研究显示,在绝大多数的生长时间段,山东芦竹在3种纤维素指标上都高于福建芦竹。然而,福建芦竹在粗蛋白含量上又高于山东芦竹。因此,相对于福建芦竹,山东芦竹可能在生物酒精产量上有所优势而福建芦竹在作为动物饲料等需要高蛋白产量指标的功能上更有优势。

将本研究组装获得的福建、山东芦竹叶片转录组数据结果与已公布的欧洲意大利芦竹叶片转录组比较发现在GO数据库及KEGG数据库的功能聚类分布上,国内的2种芦竹与意大利芦竹大致近似[5]。然而,在分析碳固定及光合作用、淀粉及糖代谢、木质素合成相关的3个信号通道后发现,在一些关键酶的表达量上,山东芦竹与福建芦竹在一些关键酶的表达量上有着显著的转录水平差异,这些差异酶中的一部分在意大利芦竹的相应代谢通道中也有较高的表达量。关于国内芦竹与欧洲芦竹在上述代谢通道相关基因上的差异还有待后续研究进一步分析。

综上所述,山东芦竹和福建芦竹虽然均为禾本科芦竹属植物,但其在叶片形态、生物量、营养物质含量及分子层面的基因表达量上均表现出差异性。本研究能为2个芦竹品种在后续应用研发提供理论依据。

源自山东省烟台市及福建省福州市永泰县的2个芦竹品种在相同环境下生长后其生物量及营养物质含量部分指标具有一定的差异性。从分子生物学及生物信息学角度对2个芦竹品种转录组数据进行分析发现,二者在与生物质产量及生物乙醇生产相关的多个信号通道中,有部分基因存在表达量的差异。上述结论证明源自不同地域的芦竹品种在作为生物能源植物的潜在能力上存在差异。

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