文章快速检索     高级检索
  福建农业学报  2019, Vol. 34 Issue (7): 824-828    DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2019.07.011
0

引用本文 [复制中英文]

樊荣辉, 罗远华, 钟淮钦, 等. 逆转录环介导等温扩增技术检测齿兰环斑病毒[J]. 福建农业学报, 2019, 34(7): 824-828.
[复制中文]
FAN R H, LUO Y H, ZHONG H Q, et al. RT-LAMP Detection of Odontoglossum Ringspot Virus[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2019, 34(7): 824-828.
[复制英文]

基金项目

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2017R1026-8);福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队建设项目(STIT2017-2-9);福建省农业科学院生产性工程化实验室中试基金(AG2017-2)

通讯作者

黄敏玲(1960-), 女, 研究员, 研究方向:花卉种质创新、资源评价及生物技术研究(E-mail:huangml618@163.com)

作者简介

樊荣辉(1983-), 女, 硕士, 助理研究员, 研究方向:花卉生物技术研究(E-mail:rhfan1012@163.com)

文章历史

收稿日期: 2018-04-11 初稿
2019-03-19 修改稿
逆转录环介导等温扩增技术检测齿兰环斑病毒
樊荣辉 1,2,3, 罗远华 1,2,3, 钟淮钦 1,2,3, 叶秀仙 1,2,3, 黄敏玲 1,2,3     
1. 福建省农业科学院作物研究所, 福建 福州 350013;
2. 福建省农业科学院花卉研究中心, 福建 福州 350013;
3. 福建省特色花卉工程技术研究中心, 福建 福州 350013
摘要:【目的】 齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值,建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。【方法】 本研究根据ORSV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop-mediated Iisothermal Amplification)检测方法。【结果】 结果显示该方法能特异扩增ORSV,与其他4种侵染兰花的病毒(建兰花叶病毒、菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒和小苍兰花叶病毒)不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察即可判断样品是否感染ORSV,省去电泳分析的时间,并且增加了在田间的应用价值。【结论】 该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。
关键词齿兰环斑病毒    RT-LAMP    检测    
RT-LAMP Detection of Odontoglossum Ringspot Virus
FAN Rong-hui1,2,3, LUO Yuan-hua1,2,3, ZHONG Huai-qin1,2,3, YE Xiu-xian1,2,3, HUANG Min-ling1,2,3     
1. Institute of Crop Sciences, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou, Fujian 350013, China;
2. Flowers Research Center, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou, Fujian 350013, China;
3. Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture, Fuzhou, Fujian 350013, China
Abstract: 【Objective】 To establish a rapid and reliable detection method on Odontoglossum ringspot virus (ORSV), a major pathogen that seriously affects the ornamental value of orchids. 【Method】 Primers were designed for the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay from the conserved region in the coat protein (CP) gene of ORSV available in GenBank, and its reaction conditions optimized. 【Result】 Using the selected primer, RT-LAMP specifically identified ORSV but not Cymbidium mosaic virus (CyMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), Freesia mosaic virus (FreMV) or Cucumber mosaic virus (CMV). The sensitivity of the assay was 10 times higher than that of RT-PCR, while identical in positive rate on test of 20 specimens. Furthermore, the amplification products of the newly developed method could be visually inspected using SYBR Green I without gel electrophoresis. 【Conclusion】 The RT-LAMP assay was considered a specific, sensitive, and rapid method for ORSV detection.
Key words: Odontoglossum ringspot virus    RT-LAMP    detection    
0 引言

【研究意义】齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)是兰花中最严重的病毒之一, 建兰、墨兰等国兰主要以单独侵染ORSV为主。建兰花叶病毒侵染兰花,使植株出现花叶、畸形、坏死及花瓣变色等症状[1],使品质下降,影响观赏价值,制约兰花产业发展[2-3]。目前尚缺乏有效防治建兰花叶病毒的药剂,最有效的方法是培育无毒种苗,而这就需要对种苗进行病毒检测及鉴定,因此,建立快速、灵敏的检测技术尤为重要。【前人研究进展】目前,病毒检测主要有酶联免疫法[1]和PCR检测法[4-5]等方法。酶联免疫法是目前较常用的一种方法[6],但存在灵敏度不高和假阳性等缺点。近几年,灵敏度更高的PCR技术已成为常规检测手段[7],但由于实验设备要求比较高,在基层的检验检疫部门推广应用难。【本研究切入点】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是应用4条特异性引物,通过Bst DNA聚合酶,在水浴锅中对靶基因进行的一种恒温扩增技术[8],该技术具有扩增特异性强、灵敏度高、操作快速简便、检测简单等特点,摆脱了对PCR仪等昂贵仪器的依赖[9-11],在基层单位的检测更加方便。【拟解决的关键问题】基于以上优点,本研究针对ORSV的保守外壳蛋白(CP)基因设计了4条特异性引物,建立了检测ORSV的RT-LAMP方法,利于向基层检验部门推广。

1 材料与方法 1.1 供试材料

试验于福建省农业科学院花卉育种科技创新团队实验室进行。感染建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CyMV)、齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)、菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus(BYMV)、小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的阳性样品及健康对照样品的叶片均由本实验室保存提供。荧光染料SYBR GreenⅠ购自北京鼎国公司;Bst聚合酶、MgSO4购自New England Biolabs(美国);RNAiso Plus购自TaKaRa;甜菜碱购自Sigma(美国);Trizol购自TaKaRa。

1.2 试验方法 1.2.1 RT-LAMP体系的建立

取待测样品的叶片,按照Trizol方法提取样品的总RNA。根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的ORSV较保守的CP基因序列为靶标基因(HQ644131),设计得到6个特定区域的4条特异性引物,其中F3和B3为外引物、FIP和BIP为内引物(表 1),引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系(25 μL):2.5 μL 10× Bst buffer、4 μL MgSO4(25 mmol·L-1)、4 μL Betaine(5 mmol · L-1)、4 μL dNTPs(2.5 mmol · L-1)、1 μL Bst聚合酶(8 U · μL-1)、2 μL FIP(20 μmo·L-1)、2 μL BIP(20 μmol·L-1)、0.5 μL F3(10 μmol · L-1)、0.5 μL B3(10 μmol · L-1)、2 μL ddH2O、2.5 μL cDNA(50 ng·μL-1)。反应条件为:65℃ 60 min,80℃ 5 min。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析;或在PCR管盖上加入2 μL的1 000×SYBR GreenⅠ,混匀后目视观察结果。RT-LAMP结果分析:反应结束后,在不开盖的情况下离心反应管,使染色剂与扩增产物混合,肉眼观察试验结果,或取10 μL扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统(Bio-Rad SYSTEM GelDoc XR+)上观察并记录结果。

表 1 RT-LAMP检测所用的引物 Table 1 Primers for RT-LAMP assay
1.2.2 RT-LAMP扩增产物酶切验证

为了进一步验证LAMP扩增的正确性,在设计LAMP引物时引入了EcoR Ⅰ酶切位点。将LAMP产物电泳,梯形条带进行胶回收,再用EcoR Ⅰ酶37℃酶切过夜,连接于PMD18-T载体上,用JOM109感受态细胞转化,测序。

1.2.3 RT-LAMP特异性验证和灵敏度检测

分别提取感染CyMV、BYMV、FreMV、CMV、ORSV的阳性样品的总RNA,采用RT-LAMP技术进行特异性检测。以感染ORSV样品的总RNA为基本模板(160 ng·μL-1),进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍梯度稀释,分别进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度检测。

1.2.4 田间样品检测

应用本研究建立的RT-LAMP和RT-PCR技术,对田间随机采集的10份建兰和10份文心兰样品进行检测和验证。

2 结果与分析 2.1 RT-LAMP体系的建立

通过反应体系的优化,建立了能扩增ORSV的RT-LAMP反应体系(图 1),RT-LAMP阳性反应产物梯形的条带,阴性对照未发现条带;在产物中加入SYBR GreenⅠ,混匀,ORSV RT-LAMP阳性反应产物颜色为黄绿色,阴性对照为橙色。

图 1 RT-LAMP检测ORSV Fig. 1 Detection of ORSV by RT-LAMP 注:M:DL2000 DNA marker; 1:阴性对照;2:LAMP产物(ORSV)。 Note:M:DL2000 DNA marker; 1:Negative control; 2:LAMP product.
2.2 RT-LAMP扩增产物酶切验证

将LAMP产物胶回收后,用EcoRⅠ酶切如图 2,并进行转化测序,最终得出,酶切出的片段为目标基因F2-B2的序列,包括酶切碱基在内大小为165 bp。证明该体系扩增产物为靶基因。

图 2 LAMP产物酶切鉴定 Fig. 2 Digestion of LAMP products 注:M:DL2000 DNA marker; 1:酶切产物; 2:阴性对照;3:LAMP产物(ORSV)。 Note:M:DL2000 DNA marker; 1:LAMP products for EcoRⅠfor 2 h; 2:Negative control; 3:LAMP product.
2.3 RT-LAMP特异性验证和灵敏度检测

以分别感染CyMV、BYMV、FreMV、CMV和ORSV的样品总RNA为模板,进行RT-LAMP扩增。如图 3所示,只有ORSV有梯状条带,检测结果为阳性,其他样品不产生条带,说明建立的检测体系对ORSV检测有较好特异性。

图 3 RT-LAMP特异性分析 Fig. 3 Specificity of RT-LAMP assay 注:M:DL2000 DNA marker; 1~5分别为CyMV、BYMV、CMV、FreMV和ORSV。 Note:M:DL2000 DNA marker; 1-5:CyMV、BYMV、CMV、FreMVand ORSV, respectively.

对不同浓度稀释后的RNA,分别进行RT-LAMP和RT-PCR反应。结果显示,RT-LAMP在稀释1 000倍时,仍能检测出ORSV,而RT-PCR在稀释1 000倍时,未能检出ORSV(图 4),表明RT-LAMP检测ORSV的灵敏度比RT-PCR提高了10倍。

图 4 RT-LAMP与RT-PCR灵敏度比较 Fig. 4 Sensitivity of RT-LAMP and RT-PCR assays
2.4 田间样品检测

随机采取建兰和文心兰样品各10份,分别进行RT-LAMP和RT-PCR检测,结果显示,两者检测结果一致,建兰有4份样品呈阳性,文心兰有2份样品呈阳性(表 2),表明RT-LAMP检测技术能应用于田间样品。

表 2 田间建兰和文心兰样品的检测 Table 2 Field detection on Cymbidium and Oncidium
3 讨论与结论

兰花是中国四大名花之一,代表高贵、典雅,具有极高的观赏和收藏价值。但当病毒病侵染时,植株会出现畸形、坏死,从而造成品质下降,这是制约兰花大规模生产的重要因子。为满足消费需求,培育无病毒苗是防止病毒病的重要措施,因此,建立快速、准确、高效的检测方法,对阻止病毒病的传播有良好作用;或对脱毒苗进行检测,从根源上预防病毒病也具有重要意义。本试验针对齿兰环斑病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点,可以针对性地对兰花脱毒种苗进行检测,从种源遏制病毒病的发生。本研究技术具有较高的应用价值,在基层和现场检测中有很好的应用前景。

目前,病毒检测的常用方法是PCR和酶联免疫技术,均具有较好的检测效果,但存在耗时长,成本高的特点,不适用于基层检测。与常规PCR方法相比,本研究建立的LAMP技术,在保持PCR技术优点的基础上,不需要特殊仪器,操作简单,不需要热循环,整个过程可以在60 min内完成,更加省时。检测结果采用加入SYBR GreenⅠ目测的方式,检测更快捷方便,因此该方法特别适合在基层中应用。

LAMP技术使用4~6条引物,会进一步增强反应的特异性[12-13]。引物设计至关重要,也较复杂和困难,除要遵循一般引物设计原则外,LAMP引物设计自身要注意的事项[14],特别是对于GC含量较高序列或较短序列设计更加困难[15]。本试验针对齿兰环斑病毒CP基因设计引物,经验证该引物的特异性良好。同时,本研究建立的检测ORSV的RT-LAMP方法特异性强,用时短,操作简单,灵敏度较高,比常规PCR灵敏度高10倍,对于病毒含量很少的脱毒苗的快速检测方面也有一定的优势。LAMP方法灵敏度高,容易出现假阳性,因此本研究采用在RT-LAMP反应管盖上滴加SYBR green I染色剂,待反应结束后在不开盖的情况下直接使染色剂与扩增产物混合,以此减少反复开盖而造成的污染问题。

参考文献
[1]
HU J S, FERREIRA D, WANG M, et al. Detection of cymbidium mosaic virus, odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawai[J]. Plant Disease, 1993, 77: 464-468. DOI:10.1094/PD-77-0464
[2]
WONG S M, CHENG C G, LEE Y H, et al. Incidence of cymbidium mosaic and odontoglossum ringspot viruses and their significance in orchid cultivation in Singapore[J]. Crop Protection, 1994, 13: 235-239. DOI:10.1016/0261-2194(94)90084-1
[3]
ZETTLER F W, KO N J, WISLER G C, et al. Viruses of orchids and their control[J]. Plant Disease, 1990, 74(9): 621-626. DOI:10.1094/PD-74-0621
[4]
MENZEL W, JELKMANN W, MAISS E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control[J]. Journal of Virological Methods, 2002, 99: 81-92. DOI:10.1016/S0166-0934(01)00381-0
[5]
THOMPSON J R, WETZEL S, KLERKS M M, et al. Multiplex RT-PCR detection of four aphid-borne strawberry viruses in Fragaria spp. in combination with a plant mRNA specific internal control[J]. Journal of Virological Methods, 2003, 111(2): 85-93. DOI:10.1016/S0166-0934(03)00164-2
[6]
梁敏国, 刘光华. 广东兰花病毒病调查和病原检测[J]. 江西植保, 2004, 27(3): 97-100.
LIANG M G, LIU G H. Research and Pathogeny Identification on Virus Disease of Orchid in Guangdong Province[J]. Jiangxi Plant Protection, 2004, 27(3): 97-100. (in Chinese) DOI:10.3969/j.issn.2095-3704.2004.03.001
[7]
柳爱春, 赵芸, 刘超, 等. 双重一步法RT-PCR检测2种主要兰花病毒[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(27): 12960-12961, 13009.
LIU A C, ZHAO Y, LIU C, et al. Detection of Two Main Orchid Viruses with the Method of Double One-step RT-PCR[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009, 37(27): 12960-12961, 13009. (in Chinese)
[8]
NOTOMI T, OKAYMA H, MASUBUCHI H. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(12): 63. DOI:10.1093/nar/28.12.e63
[9]
HARPER S J, WARD L I, CLOVER G R. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications[J]. Phytopathology, 2010, 100(12): 1282-1288. DOI:10.1094/PHYTO-06-10-0168
[10]
RANJAN R, KANJAYAN M, SUBRAMANIAM S, et al. Development and evaluation of a one-step reverse transcription-loop mediated isothemal amplication assay(RT-LAMP) for rapid detection of foot and mouth disease virus in India[J]. Virus Disease, 2014, 25(3): 358-364.
[11]
SINGH P, MIRDHA B R, AHUJA V, et al. Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assay for rapid detection of Entamoeba histolytica in amoebic liver abscess[J]. World Microbiol Biotechnol, 2013, 29: 27-32. DOI:10.1007/s11274-012-1154-7
[12]
高宏伟, 徐彪, 朱来华, 等. 应用LAMP检测方法检测肉制品中的单增李斯特菌[J]. 食品安全质量检测技术, 2010, 27(1): 12-17.
GAO H W, XU B, ZHU L H, et al. Detection of Listeria monocytogenes in meat by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)[J]. Journal of Food Safety and Quality, 2010, 27(1): 12-17. (in Chinese)
[13]
ZHANG Y Q, SHAN X X, SHI L, et al. Development of a fim Y-based loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Salmonella in food[J]. Food Research international, 2012, 45(2): 1011-1015. DOI:10.1016/j.foodres.2011.02.015
[14]
王永, 兰青阔, 赵新, 等. 转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用[J]. 中国农业科学, 2009, 42(4): 1473-1477.
WANG Y, LAN Q K, ZHAO X, et al. Development and Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Genetically Modified Crops[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(4): 1473-1477. (in Chinese) DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.04.044
[15]
CHEN L, GUO J, WANG Q, et al. Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assay for seven genecitally modified maize events and their application in practical samples analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(11): 5914-5918. DOI:10.1021/jf200459s