在全球气候变暖加剧的严峻背景下，极端高温事件发生的频次、强度和持续时间都在急剧增加，由此带来的健康威胁也愈演愈烈^[1]。对于不得不长期暴露于高温高湿环境从事高强度体力劳动的特殊职业群体，如运动员、消防员、士兵及建筑工人等，罹患热射病的风险急剧升高，严重威胁其生命健康及作业安全^[2-4]。热习服训练是公认的预防热损伤、提升热耐受能力和作业效率的有效非药物干预手段^[5-7]。热习服的形成是机体应对高温环境的生理适应性调节，包括心率和核心体温降低、血容量增加、出汗量增加、有氧耐力增强等^[8-9]。然而，对热习服效果的精准评估至今仍然是实践中的一大难题。目前主要依赖的生理指标包括心率、核心体温、出汗量等，但核心体温的“金标准”测量方法如直肠或食管温度探头具有侵入性，受试者依从性差，且因环境和监测设备影响大，在大规模群体训练中难以实时准确测量。这不仅限制了对热习服进程的动态监控，也阻碍了个体化训练方案的制定与优化。因此，找到一种客观且精准的方法来评估热习服状态具有重大的现实意义和应用价值。

为了应对这一挑战，热习服评估研究已转向分子生物学领域。多项研究表明，血液中的代谢物和蛋白质能灵敏地反映机体的应激与适应状态^[10-12]。在众多候选分子中，热激蛋白（heat shockprotein，HSP）70、皮质醇、甲状腺素（tetraiodothyronine，T4）、血肌酐等备受关注。HSP70作为细胞内的分子伴侣，在热应激时表达上调以保护蛋白质免受损伤，其基础水平的升高可能标志着细胞层面的预适应^[13-14]。皮质醇作为经典的应激激素，其反应模式的变化能反映神经内分泌系统对反复热应激的适应情况^[15-16]。T4是调节基础代谢率和产热的关键激素，机体为适应长期热负荷，可能通过降低T4水平来减少内源性产热^[17-18]。血肌酐是评估肾脏负荷和肌肉代谢状态的关键指标。热应激下的脱水和血流重新分布会增加肾脏压力，而血肌酐是临床估算肾小球滤过率的基础，其水平变化可反映肾脏对热习服的适应过程^[19-20]。尽管已有研究探讨了这些分子在单次热暴露后的反应，但它们在系统性热习服训练前后的变化特征，尤其是在自然环境下开展热习服训练期间的变化规律仍有待阐明。本研究通过在自然热环境下对受试者进行为期7~14 d的热习服训练，并监测其血浆HSP70、皮质醇、T4、肌酐水平的变化，筛选能客观、准确评估热习服训练效果的潜在生物标志物，为建立客观、精准的热习服评估方法提供实验依据。

1   对象和方法

1.1   受试对象与分组

招募健康成年男性志愿者180人，年龄为18~35岁，BMI为18.5~24.0 kg/m2。纳入标准：身体健康，近2周未发生腹泻、感冒、心肌炎等急性病，无慢性疾病史，无皮肤病，无热射病经历，无严重痔疮，无失眠，近1个月内无饮酒及抗生素类药物服用史，无长期服药史。试验前，受试者进行3 km跑耐力测试，依据耐力测试成绩分为耐力优秀组（11 min 30 s以内，90人）和耐力合格组（11 min 30 s~13 min 50 s，80人），其余10人成绩不合格，故不纳入试验。每组再进一步分为热习服训练组和对照组：耐力优秀训练（high endurance training，HET）组60人、耐力优秀对照（high endurance control，HEC）组30人、耐力合格训练（qualified endurance training，QET）组50人、耐力合格对照（qualified endurance control，QEC）组30人。受试者被充分告知整个试验流程与风险，并签署研究知情同意书。本试验经海军军医大学医学研究伦理委员会审核批准。

1.2   试验方法

1.2.1   热习服训练

依据《部队热习服指南》和户外热习服训练方法和研究^[21-22]，采取自然室外环境热习服训练方案，依据耐力素质差异划分受试对象，分别开展不同时长的热习服训练。当室外湿球黑球温度（wet-bulb globe temperature outdoor，WBGTo）≥35 ℃时受试者着短袖训练服，WBGTo为30~＜35 ℃时着长袖训练服+负重服，WBGTo＜30 ℃时着长袖训练服+负重服+暴汗服+泳帽，在标准操场的400 m跑道训练组（HET组和QET组）受试者2.5 h内依次完成10 min慢跑和行进间操、100 m或200 m中速跑×5组、5 km负重快走×2组，每日训练1次；训练第4天和第12天，第1组5 km负重快走完成过程中多名受试者核心体温＞39.3 ℃，故只进行了1组5 km负重快走训练。HET组连续训练7 d，QET组连续训练12 d。对照组（HEC组和QEC组）受试者不进行热习服训练，其余活动同训练组。

1.2.2   血液样本采集与检测

分别于热习服训练前1 d和全部训练结束后的第2天，对受试者进行基础测试和热习服训练的效果评价测试，测试项目为5 km负重快走×2组。2次测试前后分别采集受试者外周静脉血，以3 000 r/min（离心半径14 mm）离心分离血浆，于－20 ℃保存。采用ELISA法检测HSP70、皮质醇、T4水平（试剂盒货号分别为JL12956、JL12377、JL12183），采用肌氨酸氧化酶法检测肌酐水平（试剂盒货号为JL-T0928）。上述ELISA检测试剂盒均为上海江莱生物科技有限公司产品。

1.3   统计学处理

应用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。呈正态分布的计量资料以$\bar{x} \pm s$表示，身高、体重、BMI等基础数据的组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法。训练组和对照组之间血液学指标的比较采用独立样本t检验，并采用线性回归模型校正基础值和耐力素质分层因素；进一步采用协方差分析校正基础值后比较HET、HEC、QET和QEC组之间的差异。采用双因素多水平重复测量方差分析和LSD法分析同组受试者在不同测试阶段血液学指标的差异。采用多因素logistic回归方法分析热习服的评价因子并建立联合评估模型。通过ROC曲线评价HSP70、皮质醇及联合模型的热习服评估价值，采用DeLong检验比较AUC值。检验水准（α）为0.05。

2   结果

2.1   受试对象基础特征

各组受试者身高、体重、BMI差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表 1。

2.2   热习服对血浆HSP70水平的影响

训练组受试者基础测试前、基础测试后血浆HSP70水平与对照组相比差异均无统计学意义（P＝0.342、0.929），而效果评价测试前、效果评价测试后训练组HSP70水平均低于对照组（均P＜0.01）；采用线性回归校正基础测试前个体差异和耐力分层因素后，效果评价测试前、后训练组HSP70水平依然低于对照组（均P＜0.01）。双因素多水平重复测量方差分析结果显示，测试时间主效应、训练分组主效应、交互效应均有统计学意义（F＝243.723，P＜0.001，偏η²＝0.596；F＝11.828，P＜0.001，偏η²＝0.066；F＝33.927，P＜0.001，偏η²＝0.169）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，训练组HSP70水平在基础测试后（P＜0.01）和效果评价测试后（P＝0.018）与基础测试前相比均升高，而效果评价测试前HSP70水平与基础测试前相比差异无统计学意义（P＝0.132）；效果评价测试后HSP70水平低于基础测试后水平（P＜0.01），且与效果评价测试前比较差异无统计学意义（P＝0.196）。对照组基础测试后、效果评价测试前、效果评价测试后HSP70水平均比基础测试前升高（均P＜0.01），效果评价测试后HSP70水平较效果评价测试前升高（P＜0.01）。以上结果表明，单次热暴露刺激会引起血浆HSP70水平升高；经过热习服训练后再次经热暴露刺激血浆HSP70水平虽然升高，但是升高幅度明显小于单次热暴露刺激，提示热习服训练可在一定程度上抑制热应激下血浆HSP70水平的过度升高。见图 1。

图  1  热习服训练对血浆HSP70水平的影响

Fig.  1  Influence of heat acclimatization training on plasma HSP70 levels

Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. *P < 0.05, **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$. HSP70: Heat shock protein 70.

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考虑到受试者存在的耐力差异，采用协方差分析校正基础测试前HSP70水平后，效果评价测试前、效果评价测试后训练组和对照组间耐力优秀者（F＝15.910、47.690，均P＜0.001）和耐力合格者（F＝13.872、36.579，均P＜0.001）的HSP70水平差异均有统计学意义，但在基础测试后两组间比较差异均无统计学意义（F＝0.038、0.048，P＝0.845、0.827）。双因素多水平重复测量方差分析结果显示，测试时间主效应、训练分组主效应、交互效应均有统计学意义（F＝251.641，P＜0.001，偏η²＝0.604；F＝7.349，P＜0.001，偏η²＝0.118；F＝17.453，P＜0.001，偏η²＝0.241）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，与基础测试前相比，HET组和QET组受试者基础测试后HSP70水平均升高（均P＜0.01），效果评价测试前均无显著变化（均P＞0.05）；HET组效果评价测试后HSP70水平较基础测试前和效果评价测试前均升高（均P＜0.01），而QET组效果评价测试后HSP70水平与基础测试前、效果评价测试前相比均无显著变化（均P＞0.05）。在基础测试前、基础测试后、效果评价测试前HET组与QET组之间HSP70水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），仅在效果评价测试后HET组HSP70水平高于QET组（P＜0.01）。以上结果表明，不论耐力优秀还是合格，经热暴露刺激后血浆HSP70水平均升高，而热习服训练后HSP70水平降低，提示耐力差异不会影响热习服训练对热暴露后血浆HSP70水平升高的抑制效果，耐力优秀者可能因为训练天数相对较短HSP70水平未恢复至静息水平。见图 2。

图  2  耐力差异对热习服训练后血浆HSP70水平变化的影响

Fig.  2  Effects of endurance differences on changes in plasma HSP70 levels following heat acclimatization training

HET: High endurance training; QET: Qualified endurance training; HEC: High endurance control; QEC: Qualified endurance control. Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$. HSP70: Heat shock protein 70.

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2.3   热习服对血浆皮质醇水平的影响

训练组基础测试前及测试后血浆皮质醇水平与对照组相比差异均无统计学意义（均P＞0.05），而效果评价测试前及测试后皮质醇水平均低于对照组（均P＜0.01）；采用线性回归校正基础测试前个体差异和耐力分层因素后，效果评价测试前及测试后训练组与对照组之间血浆皮质醇水平差异仍有统计学意义（均P＜0.01）。双因素多水平重复测量方差分析结果显示，测试时间主效应、训练分组主效应、交互效应均有统计学意义（F＝123.101，P＜0.001，偏η²＝0.424；F＝20.048，P＜0.001，偏η²＝0.107；F＝19.017，P＜0.001，偏η²＝0.102）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，训练组基础测试后和效果评价测试后皮质醇水平均高于基础测试前（均P＜0.01），而效果评价测试前皮质醇水平与基础测试前相比差异无统计学意义（P=0.640）；效果评价测试后皮质醇水平较效果评价测试前升高（P＜0.01），但低于基础测试后水平（P＜0.01）。对照组基础测试后、效果评价测试前、效果评价测试后皮质醇水平均比基础测试前升高（均P＜0.01），效果评价测试后较效果评价测试前升高（P＜0.01）。上述结果表明，不论是单次热暴露还是多天连续热习服训练均会使血浆皮质醇水平升高，并且热习服训练可以在一定程度上抑制热暴露后血浆皮质醇的升高。见图 3。

图  3  热习服训练对血浆皮质醇水平的影响

Fig.  3  Influence of heat acclimatization training on plasma cortisol levels

Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$.

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采用协方差分析校正基础测试前皮质醇水平后，效果评价测试后训练组和对照组间耐力优秀者（F＝23.789，P＜0.001）和耐力合格者（F＝37.304，P＜0.001）的皮质醇水平差异均有统计学意义，但在基础测试后（P=0.751、0.664）和效果评价测试前（P=0.172、0.324）两组间比较差异均无统计学意义。双因素多水平重复测量方差分析结果显示，测试时间主效应、训练分组主效应、交互效应均有统计学意义（F＝121.565，P＜0.001，偏η²＝0.424；F＝8.562，P＜0.001，偏η²＝0.135；F＝7.107，P＜0.001，偏η²＝0.114）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，HET组和QET组基础测试后皮质醇水平均较基础测试前升高（均P＜0.01）；与效果评价测试前相比，效果评价测试后HET组皮质醇水平升高（P＜0.01）、QET组无显著变化（P=0.225），但两组效果评价测试后皮质醇水平均较基础测试后降低（均P＜0.01），且效果评价测试前较基础测试前无显著变化（P=0.290、0.644）。上述结果表明，无论耐力优秀还是合格，热习服训练后皮质醇水平均有所降低，耐力合格者可降至静息水平，耐力优秀者仍较静息水平稍高，但耐力优秀者和耐力合格者之间并无显著差异，这说明热习服训练降低血浆皮质醇的效应不受耐力差异影响，但能否恢复至静息水平可能受基础水平影响。见图 4。

图  4  耐力差异对热习服训练后血浆皮质醇水平变化的影响

Fig.  4  Effects of endurance differences on changes in plasma cortisol levels following heat acclimatization training

HET: High endurance training; QET: Qualified endurance training; HEC: High endurance control; QEC: Qualified endurance control. Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$.

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2.4   热习服对血浆T4水平的影响

与对照组相比，训练组基础测试前及测试后血浆T4水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），而效果评价测试前及测试后T4水平均降低（均P＜0.01）；采用线性回归校正基础测试前个体差异和耐力分层因素后，效果评价测试前及测试后训练组T4水平与对照组比较差异依然有统计学意义（均P＜0.01）。双因素多水平重复测量方差分析结果显示，测试时间主效应、训练分组主效应、交互效应均有统计学意义（F＝25.895，P＜0.001，偏η²＝0.135；F＝17.894，P＜0.001，偏η²＝0.097；F＝5.557，P=0.020，偏η²＝0.032）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，与基础测试前相比，训练组和对照组基础测试后血浆T4水平均升高（均P＜0.01），对照组效果评价测试前水平亦升高（P＜0.01），而训练组效果评价测试前与基础测试前比较则无显著变化（P=0.355）、效果评价测试后却有所升高（P=0.020），同时两组效果评价测试后T4水平与效果评价测试前相比差异均无统计学意义（P=0.108、0.176）。训练组效果评价测试后T4水平较基础测试后降低（P＜0.01）。以上结果表明，单次热暴露会引起血浆T4水平升高，热习服训练看似在一定程度上缓解了T4水平的升高幅度，但效果评价测试前、后并无显著差异。见图 5。

图  5  热习服训练对血浆T4水平的影响

Fig.  5  Influence of heat acclimatization training on plasma T4 levels

Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. *P < 0.05, **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$. T4: Tetraiodothyronine.

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采用协方差分析校正基础测试血浆T4水平后，训练组和对照组之间耐力优秀者基础测试后（F＝7.919，P=0.006）、效果评价测试前（F＝21.171，P＜0.001）、效果评价测试后（F＝10.272，P=0.002）的血浆T4水平差异均有统计学意义；两组间耐力合格者效果评价测试前（F＝11.917，P＜0.001）、效果评价测试后（F＝4.886，P=0.030）的血浆T4水平差异亦有统计学意义，但基础测试后无显著差异（F＝1.757，P=0.189）。对各组不同测试阶段T4水平进行双因素多水平重复测量方差分析，结果显示，测试时间主效应、训练分组主效应、交互效应均有统计学意义（F＝26.523，P＜0.001，偏η²＝0.139；F＝8.503，P＜0.001，偏η²＝0.135；F＝6.375，P＜0.001，偏η²＝0.104）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，与基础测试前相比，HET组基础测试后T4水平升高（P＜0.01），效果评价测试前T4水平则无变化（P=0.311）；效果评价测试后T4水平比基础测试后降低（P＜0.01），但仍高于基础测试前水平（P=0.039），与效果评价测试前相比差异无统计学意义（P=0.233）。与基础测试前相比，QET组基础测试后T4水平升高（P=0.005），但效果评价测试前和效果评价测试后均无显著变化（P=0.794、0.234）。HEC组基础测试后（P＜0.01）、效果评价测试前（P=0.001）、效果评价测试后（P=0.014）T4水平均较基础测试前升高，效果评价测试后T4水平较基础测试后降低（P＜0.01），但与效果评价测试前相比差异无统计学意义（P=0.295）。QEC组基础测试前与测试后相比、效果评价测试前与测试后相比T4水平差异均无统计学意义（P=0.176、0.391），但效果评价测试后T4水平高于基础测试后（P=0.030）。通过上述结果分析可知，单次热暴露仅引起部分受试者血浆T4水平升高，虽然HET组效果评价测试后T4水平比基础测试后降低，但HEC组同样有所降低，因此并不能说明T4水平的变化是热习服训练的效果。见图 6。

图  6  耐力差异对热习服训练后血浆T4水平变化的影响

Fig.  6  Effects of endurance differences on changes in plasma T4 levels following heat acclimatization training

HET: High endurance training; QET: Qualified endurance training; HEC: High endurance control; QEC: Qualified endurance control. Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. *P < 0.05, **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$. T4: Tetraiodothyronine.

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2.5   热习服训练对血浆肌酐水平的影响

基础测试前、后和效果评价测试前、后4个时间点，训练组血浆肌酐水平均低于对照组（均P＜0.01）；采用线性回归校正基础测试前个体差异和耐力分层因素后，基础测试后（P＜0.01）和效果评价测试后（P=0.007）训练组和对照组之间血浆肌酐水平差异仍有统计学意义，但效果评价测试前血浆肌酐水平在训练组和对照组间差异无统计学意义（P=0.631）。采用双因素多水平重复测量方差分析进一步比较两组热习服训练前后血浆肌酐的变化情况，结果显示，测试时间主效应和训练分组主效应有统计学意义（F＝15.842，P＜0.001，偏η²＝0.087；F＝89.791，P＜0.001，偏η²＝0.351），但测试时间与训练分组不存在交互效应（F＝0.088，P=0.931，偏η²＝0.001）。进一步采用LSD法进行两两比较，结果显示，训练组和对照组基础测试后血浆肌酐水平与基础测试前相比均升高（均P＜0.01），但效果评价测试前与基础测试前相比无显著变化（P=0.966、0.985）；两组效果评价测试后血浆肌酐水平均比效果评价测试前（均P＜0.01）和基础测试前（均P＜0.01）升高，与基础测试后比较差异无统计学意义（P=0.083、0.141）。上述结果表明，不论单次热暴露训练还是热习服训练均会引起血浆肌酐水平升高，但热习服训练对热暴露下血浆肌酐的变化趋势没有明显的促进或抑制作用。见图 7。

图  7  热习服训练对血浆肌酐水平的影响

Fig.  7  Influence of heat acclimatization training on plasma creatinine levels

Pre-B: Before the baseline test; Post-B: After the baseline test; Pre-E: Before the efficacy evaluation test; Post-E: After the efficacy evaluation test. **P < 0.01. $\bar{x} \pm s$.

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2.6   HSP70和皮质醇对热习服的评估作用

将热习服与否（是＝1，否＝0）作为因变量，效果评价测试后血浆HSP70、皮质醇作为自变量，进行多因素logistic回归分析，结果显示效果评价测试后血浆HSP70和皮质醇降低均是热习服形成的独立影响因素（OR＝0.739，95%CI 0.645~0.845，P＜0.001；OR＝0.977，95%CI 0.967~0.986，P＜0.001）。基于效果评价测试后血浆HSP70和皮质醇建立的热习服效果评估模型为：logitP=7.466－0.303×HSP70－0.024×皮质醇。ROC曲线分析结果显示，效果评价测试后血浆HSP70、皮质醇均具有较好的热习服评估效能（AUC＝0.836，95%CI 0.773~0.898，灵敏度为0.767，特异度为0.809；AUC＝0.791，95%CI 0.716~0.866，灵敏度为0.767，特异度为0.718）。HSP70和皮质醇联合评估模型的AUC值为0.887（95%CI 0.834~0.940，灵敏度为0.882，特异度为0.750），优于两者单独预测（Z＝13.432、11.453，均P＜0.001）。见图 8。

图  8  效果评价测试后血浆HSP70和皮质醇及两者联合评估热习服的ROC曲线分析

Fig.  8  ROC curve analyses of plasma HSP70 and cortisol after efficacy evaluation test and their combination in evaluating heat acclimatization

ROC: Receiver operating characteristic; HSP70: Heat shock protein 70; AUC: Area under curve.

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3   讨论

机体产生的生理应激反应是评价热习服的重要指标，包括核心体温降低、心率下降、出汗量增加、有氧耐力增强、心率变异性改变、新陈代谢率变化等，但这些生理指标的显著变化通常出现在热习服中后期，难以有效反映热习服早期阶段的动态变化，尤其是针对现场大规模人群监测受外界环境、作业模式、测量条件的影响显著^[6-7]。因此，可靠的生物标志物或许更适合于大规模人群热习服的早期评估和精准预测。目前，研究较多的热习服生物标志物包括细胞保护蛋白（HSP）、应激激素（皮质醇、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、T4等）、肾功能和肾损伤标志物（血肌酐等）、炎症因子（IL-6、IL-10、TNF-α等），以及葡萄糖、乳酸盐、氨、尿素、碳酸氢盐、氨基酸等代谢物。但是，尚无兼具高灵敏性和高特异性的单一标志物可单独作为热习服的评价指标。本研究通过研究室外自然环境下主动热习服训练对血浆HSP70、皮质醇、肌酐的影响，分析它们对热习服的评估效能，从而筛选出有效评价因子以综合评估热习服。

HSP是研究最为广泛的热习服生物标志物，尤以对热敏感性较高的HSP70研究最为深入。HSP70是一组高度保守的蛋白质，在正常情况下几乎不表达，但是热应激、运动、营养、缺氧、能量消耗、酸中毒、活性氧等因素均可诱导其表达^[23-25]。HSP70已经被证实是细胞热应激的生物标志物，其mRNA和蛋白质表达会随着热应激反应增加^[26]。研究报道，细胞内HSP70和细胞外HSP70在热习服中都起着重要的作用^[27-28]。细胞内HSP70可发挥分子伴侣功能，结合错误折叠的蛋白质并协助其正确折叠，加速细胞修复，从而保护细胞免受应激损伤。应激状态下HSP70可由多种细胞释放到全身血液循环中，细胞外HSP70可通过触发促炎细胞因子释放来刺激免疫反应，因此有研究提出血浆HSP70可作为潜在的热习服生物标志物^[27]。本研究结果显示室外热环境下单次热暴露训练可刺激血浆HSP70水平增高。有意义的是，本研究观察到受试者在经历热习服训练后血浆HSP70水平虽然升高，但是升高幅度小于单次热暴露训练，而且其水平低于与未进行热习服训练的受试者，表明热习服训练可以抑制热应激下运动导致的血浆HSP70水平增高。同时需要注意的是，热习服训练并未对静息状态下的血浆HSP70水平造成明显影响。尽管HSP70已经被证实是热应激的生物标志物，但其随着多次热应激减弱的应答反应提示其同样可以作为热习服的潜在标志物。目前的研究也支持其作为热习服的主要分子标志物^[28]。本研究还考虑了个体耐力差异对热习服的混杂影响，将热习服受试对象根据耐力差异分为耐力优秀和耐力合格组，两类受试者在热习服训练前后血浆HSP70水平变化规律基本一致，其差异也仅表现在热习服获得后运动诱导的血浆HSP70水平，表明耐力因素不影响HSP70对热习服的评估。耐力差异对血浆HSP70水平最明显的影响在于耐力优秀者获得热习服后，再次热暴露后血浆HSP70水平比耐力合格者高，推测可能原因在于训练天数的不同，因为HSP70表达量与训练天数呈显著正相关^[29]，本研究中耐力优秀者训练时间仅为7 d，耐力合格者训练时间为12 d，耐力合格者多出的5 d训练可能使HSP70升高幅度持续下降到了更低水平。根据效果评价测试前两类受试者HSP70水平无差异的结果，推测两者会恢复到相同水平即静息水平，但是到底在训练结束后多长时间内恢复到静息水平仍需在后续研究中进一步探讨。有研究表明，在跑步机上进行11 d热习服训练，训练停止1 h后血浆HSP72（HSP70家族诱导型成员）即恢复到静息水平^[27]。热习服不会改变静息状态下HSP70的原因可能与儿茶酚胺有关，α肾上腺素和去甲肾上腺素刺激HSP70释放进入血液循环，儿茶酚胺可能是运动诱导细胞外HSP70浓度升高的重要诱因^[30-31]。对于热习服获得后细胞外HSP70并没有表现出运动诱导的持续大幅升高现象，可能与热习服获得后机体热应激减弱有关。因为体温升高也是细胞外HSP70升高的重要因素^[27]，热习服获得后由于机体核心体温的适应性调节，运动引起的细胞外HSP70释放浓度比未习服者低。

同时不可忽视的是，HSP70本质上是多种应激因素（如炎症、氧化应激、缺氧等）的共同反应蛋白，HSP70升高并不能完全归因于热习服的作用，将其单独作为生物标志物并不能完全反映热习服效应^{[28, 32]}。皮质醇是反映机体应激反应的重要标志物，同样在机体应对热应激的反应中起着至关重要的作用。单次耐力训练和热应激均促使下丘脑-垂体-肾上腺轴启动应激反应，下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素进入血液，刺激肾上腺皮质产生皮质醇，引发一系列代谢和免疫变化。基于血液皮质醇应对生理和心理压力时的快速反应，可根据血液皮质醇水平评估机体对热应激的反应。研究表明，皮质醇水平与运动强度相关，最大摄氧量为40%的低强度运动对皮质醇水平无显著影响，但中高强度运动会诱发皮质醇水平升高^[33]。本研究中单次运动会引起血浆皮质醇水平升高，这与高温条件下长时间剧烈持续运动导致皮质醇分泌增多的观点^[33]一致。但热习服可以在一定程度上减小运动和热应激导致的血浆皮质醇水平升高幅度，这种变化与热习服训练过程中HSP70的变化规律相似。皮质醇反映了个体对压力的短期适应性反应，训练有素的个体可能因核心体温降低和心血管适应而使热应激反应减轻，从而减弱皮质醇的升高幅度。因此，皮质醇的这种变化可能与热习服获得后核心体温降低及应激压力减小有关。有研究报道，当核心体温超过39 ℃时，志愿者唾液皮质醇水平显著升高，当核心体温降低时皮质醇水平变化较小^[34]。除此之外，还有研究提出补充水分对血浆皮质醇的浓度有一定影响，当水分摄入不足时血浆皮质醇浓度增高^[35]，但是本研究中的受试者在训练过程中均给予了充分饮用盐水的保障，因此可排除因水分摄入不足导致皮质醇水平升高的可能性。

本研究中HSP70和皮质醇均具有较好的热习服评估效能，但两者联合评估效能更优。事实上，HSP与皮质醇之间并非彼此孤立的指标，而存在双向调控关系。皮质醇作为肾上腺皮质分泌的糖皮质激素，是机体应对压力的核心激素之一；而HSP70则是细胞内的关键分子伴侣，在应激条件下保护蛋白质结构、防止错误折叠和聚集；两者相互作用是细胞内蛋白质稳态系统与机体神经内分泌系统之间交叉对话的核心环节。皮质醇作为一种脂溶性激素，不能直接作用于细胞膜，必须与细胞内的糖皮质激素受体结合才能发挥生物学效应。糖皮质激素受体的成熟、激活与功能发挥全程都离不开分子伴侣的帮助，HSP70作为分子伴侣直接影响糖皮质激素受体的成熟、稳定性和功能，从而调节皮质醇的生物学效应^[36]。皮质醇对HSP70的表达也有影响。皮质醇可以有效降低大鼠正常口腔黏膜角质细胞中HSP70的表达^[37]。虹鳟鱼热应激后肝细胞内HSP70水平增加了7倍，外泌体HSP70表达也升高20倍；而皮质醇预处理后再进行热应激暴露，HSP70阳性外泌体的数量显著降低，但肝细胞HSP70表达无显著变化，且皮质醇处理与热应激之间无显著交互效应，表明皮质醇可能影响HSP70从靶组织的释放，这可能是血浆外泌体HSP70水平降低的原因^[38]。本研究中皮质醇和HSP70在热习服训练过程中表现出相似的变化特点，很可能是两者相互作用、协同发挥作用的体现。

本研究还检测了血浆肌酐和T4水平，但是血浆肌酐、T4水平在单次热暴露训练后均没有随热习服训练的进展发生明显改变，两者不能很好地反映热习服训练的效果。有研究显示热习服不会改变运动热应激后血肌酐的升高幅度，血浆T4水平在不同研究中呈现出不同的结果，特别是热习服期如何变化争议较大^[17-20]。未来的研究还需要进一步探索血肌酐和T4在热习服过程中的动态变化。

综合分析已有研究，鉴于热习服的多系统反应特性，目前单一生物标志物并未表现出足够好的灵敏性和特异性，很难作为热习服评估的良好指标。利用多因素logistic回归进行建模的生物标志物多集中在代谢组学方面，虽然代谢组学可直接关联数百甚至数千种代谢标志物，但也面临诸多挑战，包括对大样本量的要求、对样本存储和分析的严格技术要求，以及潜在的个体差异、人口统计因素等混杂效应等。本研究仅仅检测了热习服训练前和训练后的即时血样，并没有追踪热习服训练停止后HET组受试者HSP70和皮质醇恢复至静息状态的时间，存在一定的局限性。此外，如能整合表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学数据，将有助于揭示HSP70和皮质醇促进热习服形成的分子机制和早期动态变化规律，也为探索热习服生物标志物提供了更多方向。