Mapping microenvironment of hepatobiliary tumors with spatial single-cell proteomics: from technical innovations to clinical translation
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摘要:
原发性肝癌微环境的高度异质性是限制免疫联合疗法疗效的核心障碍。空间单细胞蛋白质组学技术的突破弥补了传统病理学低通量与单细胞测序丢失空间信息的不足，使得在保留组织完整架构的前提下原位高通量解析关键蛋白质成为可能。本文综述了基于荧光和质谱的主流空间成像技术在肝胆肿瘤中的应用进展，阐述了该技术体系在解构肝胆肿瘤微环境中的关键发现，包括识别独特的免疫排斥基质屏障与免疫抑制性“细胞邻域”、揭示驱动基因突变对空间表型的重塑机制以及解析治疗耐药与复发过程中的微环境空间进化特征。该技术为深入理解肝胆肿瘤的发生、发展提供了全新的空间维度证据，有助于发现具备临床预测价值的空间生物标志物，从而指导精准治疗策略的制定。
Abstract:The high heterogeneity within the tumor microenvironment (TME) represents a critical barrier limiting the efficacy of combination immunotherapy for primary liver cancer. The development of spatial single-cell proteomics compensates for the limitations of low throughput in traditional pathology and the loss of spatial information in single-cell sequencing. This technology enables high-throughput, in situ analysis of key proteins while maintaining tissue architectural integrity. Here, we review the progress of mainstream fluorescence- and mass spectrometry-based spatial imaging technologies in hepatobiliary tumors. We focus on elucidating key findings on TME architecture, such as the identification of immune-excluded stromal barriers and immunosuppressive "cellular neighborhoods", the remodeling of spatial phenotypes by driver mutations, and the spatial evolution of the microenvironment during drug resistance and recurrence. Collectively, these technologies provide spatial evidence that deepens our understanding of hepatobiliary tumor development and progression, facilitating the discovery of predictive spatial biomarkers and the refinement of precision treatment strategies.
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原发性肝癌主要包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA），是全球范围内致死率极高的恶性肿瘤[1-2]。尽管免疫检查点抑制剂联合抗血管生成药物（如阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗[3]）已被确立为晚期HCC的一线标准治疗，免疫检查点抑制剂联合化疗（如度伐利尤单抗联合吉西他滨与顺铂[4]）也已成为晚期iCCA的一线标准方案，但临床数据显示仅有20%~30%的患者能够获得持久响应，大多数患者仍面临原发性或继发性耐药的困境[5-6]。这种治疗响应的显著异质性根源在于肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）复杂的空间生态系统，TME决定了细胞间的物理互相作用及信号转导，影响着肿瘤的生物学行为和对治疗的反应[7]。
目前，解析TME异质性仍面临方法学挑战，传统病理学缺乏高通量解析能力，单细胞RNA测序不可避免会丢失细胞的原始空间坐标和微观结构信息，空间转录组学受限于分辨率及转录后调控影响，难以精准反映执行功能的蛋白质真实水平[8]。相比之下，空间单细胞蛋白质组学结合了组织病理学的形态学和高通量检测优势，能够在保留组织完整架构的前提下原位检测几十种甚至上百种蛋白质标志物[9-10]。该领域技术主要分为两大流派。一类是基于荧光的超多重成像技术，以索引共检测技术（co-detection by indexing，CODEX）（PhenoCycler）为代表，通过“荧光探针杂交-成像-洗脱”的温和循环策略[11-12]利用DNA偶联抗体实现检测，其具有高达250 nm的光学分辨率，能清晰界定肝癌中密集堆叠细胞的边界，且支持全切片扫描。另一类是基于质谱的成像技术，如成像质谱流式（imaging mass cytometry，IMC）[13]和多重离子束成像（multiplexed ion beam imaging）[14]，利用金属同位素标记抗体通过激光或离子束剥蚀组织后进入质谱仪定量，其核心优势在于完全避免了背景自发荧光的干扰，定量准确性优越，但成像速度相对较慢且具有破坏性。
“细胞邻域”[15]的提出，将研究视角从单一细胞提升至多细胞相互作用的功能单元[16]，研究不再孤立地看待某一种细胞，而是通过整合细胞表型与空间坐标并将不同的细胞置于复杂的相互作用网络中来揭示细胞邻域在肝胆肿瘤免疫排斥及复发耐药中的核心作用。本文将综述这些技术在解构肝胆肿瘤免疫排斥、耐药机制及复发演进中的应用进展。
1 空间单细胞蛋白质组学在HCC中的应用
1.1 HCC的免疫排斥空间机制
HCC常表现为免疫细胞被阻隔于边缘的“免疫排斥”特征，空间单细胞蛋白质组学为此提供了精细解释。Salié等[7]利用IMC技术解析了HCC微环境，识别出3种主要的免疫空间表型：耗竭型、区域化型和富集型。其中，富集型患者在免疫检查点抑制剂治疗下表现出最佳的无进展生存期；而区域化型TME虽然有免疫细胞浸润，但被限制在特定区域无法接触肿瘤细胞，处于“空间隔离”状态。这种空间隔离不仅仅是物理阻隔，Maestri等[17]研究指出，即便在T细胞密度较高的区域，如果T细胞与肿瘤细胞缺乏空间邻近度，患者预后依然不佳。该研究中定义的免疫分型2亚型患者具有最佳生存率，其核心特征正是CD8+ T细胞与肿瘤细胞的物理距离最近，形成了有效的依赖于物理接触的免疫突触样相互作用；相反，免疫分型1亚型和免疫分型3亚型虽然可能有较高的免疫浸润，但T细胞被限制在基质中，形成了“空间隔离”。特定区域的功能性抑制在HCC免疫排斥中的作用同样关键。Ruf等[18]聚焦于黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT）这一肝脏中富集的先天样T细胞进行研究，发现MAIT在HCC中不仅数量减少，而且主要滞留在侵袭前沿且处于深度功能障碍状态。进一步空间分析揭示，表达集落刺激因子1受体和细胞程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的肿瘤相关巨噬细胞在空间上紧密包围MAIT，这种特定的细胞邻域通过细胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）/PD-L1轴直接诱导MAIT的细胞毒性丧失；阻断这一空间相互作用可有效恢复MAIT的杀伤功能，这为PD-1抑制剂的疗效机制提供了新的细胞学解释。
打破HCC免疫排斥不仅仅依赖于T细胞的浸润，Ho等[19]在新辅助治疗（卡博替尼联合纳武利尤单抗）的研究中发现，治疗应答者TME除了出现效应T细胞的富集，还呈现出独特的B细胞空间拓扑排列和三级淋巴结构形成。这提示有效的抗肿瘤免疫不仅需要打破基质屏障，还需要在空间上重构包括B细胞在内的多细胞协作网络。
1.2 HCC耐药机制的空间重塑
针对目前晚期HCC的一线标准双免疫疗法（曲美木单抗联合度伐利尤单抗），Myojin等[20]利用CODEX技术结合多组学分析解析了治疗耐药的空间根源。该研究表明，治疗无应答并非单纯由于缺乏T细胞浸润，而是在特定的“免疫富集邻域”中高表达诱导性T细胞共刺激分子和PD-1的调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）在空间上紧密伴随CD8+ T细胞。这种特定的空间邻近关系促进了Treg对效应T细胞的直接抑制，导致治疗失败。该结果提示在双免疫阻断治疗中单纯评估免疫细胞的丰度不足以预测疗效，必须考量Treg与效应细胞的空间拓扑关系。Qiu等[21]利用CODEX技术绘制的HCC空间图谱生动地展示了类似的抑制机制，具有高度免疫抑制功能的波形蛋白高表达巨噬细胞并非弥散分布，而是特异性地招募并物理性包裹Treg。这种紧密的物理接触构成了局部免疫抑制的核心，波形蛋白高表达巨噬细胞通过分泌IL-1β直接作用于邻近的Treg从而维持其抑制活性，有效地在肿瘤局部建立了免疫豁免区，而靶向破坏这种空间相互作用比单纯清除单一细胞亚群具有更高的治疗潜力。
除了构建免疫抑制屏障，TME的空间异质性还从代谢与血管重塑维度影响肿瘤耐药。在代谢层面，关于非酒精性脂肪性肝炎相关HCC的研究证实，肿瘤细胞的脂质代谢状态直接重塑了周围的免疫空间，富含脂滴的肿瘤区域呈现出“免疫沙漠”表型，而PD-L1+髓源性抑制细胞倾向于聚集在脂质代谢活跃区并包裹CD8+ T细胞，表明脂质代谢产物可能通过空间接触直接诱导T细胞功能耗竭[22]。Marsh-Wakefield等[23]研究了血管周围的生态位，发现血管内皮生长因子A阳性巨噬细胞在空间上紧密贴合CD34+血管内皮细胞，这种特异性的邻域结构介导了直接的促血管生成信号传递，解释了巨噬细胞如何协助肿瘤构建营养输送网络从而介导耐药形成。
1.3 HCC复发中的空间进化与来源追溯
HCC复杂的空间重塑机制影响着其临床治疗后的病灶残留及复发。Lemaitre等[24]对经动脉化疗栓塞术治疗后的HCC样本进行分析发现，残留的肿瘤细胞通过构建特殊的“治疗后残留生态位”得以存活。在该邻域中，PD-L1+ M2型巨噬细胞通过旁分泌作用激活邻近肿瘤细胞的TGF-β1信号通路，从而维持肿瘤干性特征并介导复发。Yang等[25]进一步对比了原发与复发HCC的空间单细胞蛋白质组图谱，揭示了肿瘤复发并非原发灶特征的简单表型重现，而是发生了特定的空间进化，早期复发的肿瘤表现出更为独特的免疫逃逸特征，其空间架构经历了重组，能更有效地排斥效应免疫细胞。具体而言，癌周PD-L1+树突状细胞通过招募Treg为残留癌细胞形成“抑制性庇护所”。
解析HCC空间异质性及其进化方向还需追溯细胞的组织来源，Sheng等[26]通过拓扑分析指出，肝脏驻留的库普弗细胞与招募的浸润性巨噬细胞占据不同的空间生态位且功能相反，前者主要定位于促癌邻域并介导免疫抑制。这一发现在Chen等[27]开展的一项前瞻性Ⅱ期临床试验中得到验证，驻留型巨噬细胞的空间状态可以有效预测HCC患者对经动脉化疗栓塞术联合仑伐替尼及恩沃利单抗三联疗法的应答效果。这些研究共同表明，从空间维度解析细胞的相互作用、演化与来源，不仅能从底层机制上揭示HCC耐药与复发的根源，更能为精准筛选的联合治疗获益人群提供可靠的生物标志物。
2 空间单细胞蛋白质组学在iCCA中的应用
2.1 空间图谱解析免疫屏障
iCCA以促结缔组织增生为典型特征，其致密的基质微环境构成了复杂的免疫屏障，使得化疗药物和免疫效应细胞难以渗透至肿瘤核心，导致其对传统化疗和新兴免疫治疗表现出极强的抵抗性[28]。Affo等[29]研究初步揭示了这一屏障的异质性，发现基质中的成纤维细胞存在显著的空间分工，炎症型肿瘤相关成纤维细胞位于肿瘤边缘招募抑制性细胞，而肌纤维母细胞型肿瘤相关成纤维细胞则紧密包裹肿瘤巢构建“物理墙”。Hong等[30]近期开展了一项大规模空间多组学研究，利用IMC技术整合了155例患者的数据，绘制了详尽的iCCA空间图谱。该研究不仅鉴定了5种具有不同预后特征的空间亚型，而且独立证实了驻留巨噬细胞在iCCA中的关键抑制作用。该研究还锁定了一群CD163高表达的M2型驻留巨噬细胞，发现它们在空间上对CD8+ T细胞实施“贴身防守”，通过直接的物理相互作用导致T细胞功能耗竭。基于这些高维特征，该研究团队开发了一种深度学习系统，仅需分析微小肿瘤样本中的细胞社区构成等拓扑特征，即可准确预测患者预后，为临床分层提供了强有力的工具。
2.2 驱动基因塑造的空间表型
驱动基因突变参与了iCCA空间微环境的重塑，Baretti等[31]利用CODEX技术对iCCA样本进行了高参数免疫表型分析，首次建立了“基因型-空间表型连锁”，发现不同驱动基因突变会塑造不同的空间免疫景观。如成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）融合型iCCA呈现出显著的“髓系富集”特征，即存在大量多形核髓源性抑制细胞浸润，这提示该亚型患者可能从FGFR2抑制剂联合CXC趋化因子受体2抑制剂（靶向髓源性抑制细胞）的治疗中获益；异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）突变型iCCA则表现为“免疫荒漠”和“成纤维细胞富集”，提示针对基质僵硬度的调节策略可能对此类患者更有效。这一发现标志着iCCA的免疫治疗研究已从单纯的“打破屏障”迈向了基于“突变-微环境轴”的精准联合治疗时代。
3 总结和展望
本文综述了空间单细胞蛋白质组学在肝胆肿瘤中的研究进展，揭示了该技术在理解TME复杂性方面的独特价值。肝胆肿瘤的免疫逃逸和耐药不仅取决于免疫细胞的浸润数量，还取决于其空间分布模式。从HCC中“免疫排斥”屏障的物理构建，到iCCA中驱动基因对空间免疫景观的特定重塑；从富脂代谢区域对CD8+ T细胞的排斥，到驻留巨噬细胞在微小残留病灶中构建“免疫性庇护所”，这些发现均证实了“细胞邻域”作为功能单元在疾病进展中的核心作用（表 1），也提示特定的细胞物理相互作用网络是决定肝胆肿瘤治疗应答与预后的关键因素。
表 1 空间单细胞蛋白质组学在肝胆肿瘤微环境研究中的应用汇总癌种 参考文献 技术 样本 主要发现 HCC Salié等[7] IMC 101例活检/切除样本 定义了3种主要的空间免疫表型：耗竭型、区域化型和富集型 Ruf等[18] CODEX 15例初治样本 在肿瘤浸润前沿，TAM在空间上包围MAIT Ho等[19] IMC 12例新辅助靶免治疗样本 治疗应答者表现出独特的B细胞空间拓扑排列，伴TLS形成 Myojin等[20] CODEX 双联免疫治疗配对样本 ICOS+ Treg与CD8+ T细胞的近距离空间邻近关系抑制了T细胞活化 Qiu等[21] CODEX 401例手术切除样本 波形蛋白高表达巨噬细胞招募并物理包裹Treg，构建紧密的免疫抑制微环境 Li等[22] IMC 16例NASH相关HCC，11例病毒相关HCC，6例健康对照 NASH特异性特征：富含脂滴的肿瘤区域表现为“免疫荒漠”；PD-L1+ MDSC物理包裹CD8+ T细胞并导致其耗竭 Marsh-Wakefield等[23] IMC 16例初治样本 VEGFA+巨噬细胞在空间上紧邻CD34+血管内皮细胞，促进直接的血管生成信号转导 Lemaitre等[24] CODEX 55例TACE术后残留病灶，53例初治对照 PD-L1+ M2型巨噬细胞通过旁分泌作用激活TGF-β1信号通路，维持邻近肿瘤细胞的干性 Yang等[25] IMC 46对原发灶vs复发灶 癌周PD-L1+ DC招募Treg，为残留癌细胞形成“抑制性庇护所” Sheng等[26] IMC 134例HCC，7例健康对照 肝脏驻留的库普弗细胞与招募的浸润性巨噬细胞占据不同的空间生态位；库普弗细胞主要存在于促肿瘤的邻域中 Chen等[27] IMC 基线活检vs治疗后切除 肝脏驻留巨噬细胞的基线空间状态是三联疗法临床应答的预测生物标志物 iCCA Hong等[30] IMC 155例手术切除样本 CD163+巨噬细胞与CD8+ T细胞在空间上共定位以诱导T细胞功能耗竭 Baretti等[31] CODEX 24例基因分型队列（7例FGFR2融合，9例IDH1突变，8例野生型） 基因型驱动空间表型：FGFR2融合型富含髓系细胞浸润，而IDH1突变型则表现为“免疫荒漠”或“成纤维细胞富集” HCC：肝细胞癌；IMC：成像质谱流式；CODEX：索引共检测技术；TAM：肿瘤相关巨噬细胞；MAIT：黏膜相关恒定T细胞；TLS：三级淋巴结构；ICOS：诱导性T细胞共刺激分子；Treg：调节性T细胞；NASH：非酒精性脂肪性肝炎；PD-L1：细胞程序性死亡配体1；MDSC：髓源性抑制细胞；VEGFA：血管内皮生长因子A；TACE：经动脉化疗栓塞术；TGF-β1：转化生长因子β1；DC：树突状细胞；iCCA：肝内胆管癌；FGFR2：成纤维细胞生长因子受体2；IDH1：异柠檬酸脱氢酶1. 尽管空间单细胞蛋白质组学推动了肝胆肿瘤研究，但实现临床应用仍面临挑战。首先，高维数据解析与多模态整合、分析存在瓶颈。未来应依托开源生态，利用R语言或Python构建标准化、模块化的降维、聚类及空间拓扑分析流程，同时引入基于人工智能的“空间基础模型”来提高多模态数据整合的稳健性与特征提取的泛化能力。其次，在细胞排列致密的肝胆肿瘤中，实现单细胞精准分割依然困难。基于细胞核扩张的传统分割算法容易导致相邻细胞的信号溢出，因此实验层面需在抗体面板（panel）中加入特异性的细胞膜和细胞骨架标志物，分析层面需结合专业数字病理算法及人工核验实现更精确的单细胞边界识别与信号定量。
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表 1 空间单细胞蛋白质组学在肝胆肿瘤微环境研究中的应用汇总
癌种 参考文献 技术 样本 主要发现 HCC Salié等[7] IMC 101例活检/切除样本 定义了3种主要的空间免疫表型：耗竭型、区域化型和富集型 Ruf等[18] CODEX 15例初治样本 在肿瘤浸润前沿，TAM在空间上包围MAIT Ho等[19] IMC 12例新辅助靶免治疗样本 治疗应答者表现出独特的B细胞空间拓扑排列，伴TLS形成 Myojin等[20] CODEX 双联免疫治疗配对样本 ICOS+ Treg与CD8+ T细胞的近距离空间邻近关系抑制了T细胞活化 Qiu等[21] CODEX 401例手术切除样本 波形蛋白高表达巨噬细胞招募并物理包裹Treg，构建紧密的免疫抑制微环境 Li等[22] IMC 16例NASH相关HCC，11例病毒相关HCC，6例健康对照 NASH特异性特征：富含脂滴的肿瘤区域表现为“免疫荒漠”；PD-L1+ MDSC物理包裹CD8+ T细胞并导致其耗竭 Marsh-Wakefield等[23] IMC 16例初治样本 VEGFA+巨噬细胞在空间上紧邻CD34+血管内皮细胞，促进直接的血管生成信号转导 Lemaitre等[24] CODEX 55例TACE术后残留病灶，53例初治对照 PD-L1+ M2型巨噬细胞通过旁分泌作用激活TGF-β1信号通路，维持邻近肿瘤细胞的干性 Yang等[25] IMC 46对原发灶vs复发灶 癌周PD-L1+ DC招募Treg，为残留癌细胞形成“抑制性庇护所” Sheng等[26] IMC 134例HCC，7例健康对照 肝脏驻留的库普弗细胞与招募的浸润性巨噬细胞占据不同的空间生态位；库普弗细胞主要存在于促肿瘤的邻域中 Chen等[27] IMC 基线活检vs治疗后切除 肝脏驻留巨噬细胞的基线空间状态是三联疗法临床应答的预测生物标志物 iCCA Hong等[30] IMC 155例手术切除样本 CD163+巨噬细胞与CD8+ T细胞在空间上共定位以诱导T细胞功能耗竭 Baretti等[31] CODEX 24例基因分型队列（7例FGFR2融合，9例IDH1突变，8例野生型） 基因型驱动空间表型：FGFR2融合型富含髓系细胞浸润，而IDH1突变型则表现为“免疫荒漠”或“成纤维细胞富集” HCC：肝细胞癌；IMC：成像质谱流式；CODEX：索引共检测技术；TAM：肿瘤相关巨噬细胞；MAIT：黏膜相关恒定T细胞；TLS：三级淋巴结构；ICOS：诱导性T细胞共刺激分子；Treg：调节性T细胞；NASH：非酒精性脂肪性肝炎；PD-L1：细胞程序性死亡配体1；MDSC：髓源性抑制细胞；VEGFA：血管内皮生长因子A；TACE：经动脉化疗栓塞术；TGF-β1：转化生长因子β1；DC：树突状细胞；iCCA：肝内胆管癌；FGFR2：成纤维细胞生长因子受体2；IDH1：异柠檬酸脱氢酶1. -
[1] BRAY F, LAVERSANNE M, SUNG H, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2024, 74(3): 229-263. DOI: 10.3322/caac.21834. [2] SIEGEL R L, KRATZER T B, GIAQUINTO A N, et al. Cancer statistics, 2025[J]. CA Cancer J Clin, 2025, 75(1): 10-45. DOI: 10.3322/caac.21871. [3] FINN R S, QIN S, IKEDA M, et al. Atezolizumab plus bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma[J]. N Engl J Med, 2020, 382(20): 1894-1905. DOI: 10.1056/nejmoa1915745. [4] OH D Y, RUTH HE A, QIN S, et al. Durvalumab plus gemcitabine and cisplatin in advanced biliary tract cancer[J]. NEJM Evid, 2022, 1(8): 111886. DOI: 10.1056/evidoa2200015. [5] CHENG A L, QIN S, IKEDA M, et al. Updated efficacy and safety data from IMbrave150: atezolizumab plus bevacizumab vs. sorafenib for unresectable hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2022, 76(4): 862-873. DOI: 10.1016/j.jhep.2021.11.030. [6] KELLEY R K, UENO M, YOO C, et al. Pembrolizumab in combination with gemcitabine and cisplatin compared with gemcitabine and cisplatin alone for patients with advanced biliary tract cancer (KEYNOTE-966): a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial[J]. Lancet, 2023, 401(10391): 1853-1865. DOI: 10.1016/S0140-6736(23)00727-4. [7] SALIÉ H, WISCHER L, D′ALESSIO A, et al. Spatial single-cell profiling and neighbourhood analysis reveal the determinants of immune architecture connected to checkpoint inhibitor therapy outcome in hepatocellular carcinoma[J]. Gut, 2025, 74(3): 451-466. DOI: 10.1136/gutjnl-2024-332837. [8] MOSES L, PACHTER L. Museum of spatial transcriptomics[J]. Nat Methods, 2022, 19(5): 534-546. DOI: 10.1038/s41592-022-01409-2. [9] Method of the Year 2024: spatial proteomics[J]. Nat Methods, 2024, 21(12): 2195-2196. DOI: 10.1038/s41592-024-02565-3. [10] LEWIS S M, ASSELIN-LABAT M L, NGUYEN Q, et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology[J]. Nat Meth, 2021, 18(9): 997-1012. DOI: 10.1038/s41592-021-01203-6. [11] GOLTSEV Y, SAMUSIK N, KENNEDY-DARLING J, et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging[J]. Cell, 2018, 174(4): 968-981.e15. DOI: 10.1016/j.cell.2018.07.010. [12] BLACK S, PHILLIPS D, HICKEY J W, et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies[J]. Nat Protoc, 2021, 16(8): 3802-3835. DOI: 10.1038/s41596-021-00556-8. [13] GIESEN C, WANG H A, SCHAPIRO D, et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry[J]. Nat Methods, 2014, 11(4): 417-422. DOI: 10.1038/nmeth.2869. [14] ANGELO M, BENDALL S C, FINCK R, et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors[J]. Nat Med, 2014, 20(4): 436-442. DOI: 10.1038/nm.3488. [15] KEREN L, BOSSE M, MARQUEZ D, et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging[J]. Cell, 2018, 174(6): 1373-1387. e19. DOI: 10.1016/j.cell.2018.08.039. [16] GUILLIAMS M, BONNARDEL J, HAEST B, et al. Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily conserved hepatic macrophage niches[J]. Cell, 2022, 185(2): 379-396. e38. DOI: 10.1016/j.cell.2021.12.018. [17] MAESTRI E, KEDEI N, KHATIB S, et al. Spatial proximity of tumor-immune interactions predicts patient outcome in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2024, 79(4): 768-779. DOI: 10.1097/HEP.0000000000000600. [18] RUF B, BRUHNS M, BABAEI S, et al. Tumor-associated macrophages trigger MAIT cell dysfunction at the HCC invasive margin[J]. Cell, 2023, 186(17): 3686-3705. e32. DOI: 10.1016/j.cell.2023.07.026. [19] HO W J, ZHU Q, DURHAM J, et al. Neoadjuvant cabozantinib and nivolumab converts locally advanced HCC into resectable disease with enhanced antitumor immunity[J]. Nat Cancer, 2021, 2(9): 891-903. DOI: 10.1038/s43018-021-00234-4. [20] MYOJIN Y, BABAEI S, TREHAN R, et al. Multiomics analysis of immune correlatives in hepatocellular carcinoma patients treated with tremelimumab plus durvalumab[J]. Gut, 2025, 74(6): 983-995. DOI: 10.1136/gutjnl-2024-334026. [21] QIU X, ZHOU T, LI S, et al. Spatial single-cell protein landscape reveals vimentinhigh macrophages as immune-suppressive in the microenvironment of hepatocellular carcinoma[J]. Nat Cancer, 2024, 5(10): 1557-1578. DOI: 10.1038/s43018-024-00824-y. [22] LI M, WANG L, CONG L, et al. Spatial proteomics of immune microenvironment in nonalcoholic steatohepatitis-associated hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2024, 79(3): 560-574. DOI: 10.1097/HEP.0000000000000591. [23] MARSH-WAKEFIELD F, SANTHAKUMAR C, FERGUSON A L, et al. Spatial mapping of the HCC landscape identifies unique intratumoral perivascular-immune neighborhoods[J]. Hepatol Commun, 2024, 8(11): e0540. DOI: 10.1097/HC9.0000000000000540. [24] LEMAITRE L, ADENIJI N, SURESH A, et al. Spatial analysis reveals targetable macrophage-mediated mechanisms of immune evasion in hepatocellular carcinoma minimal residual disease[J]. Nat Cancer, 2024, 5(10): 1534-1556. DOI: 10.1038/s43018-024-00828-8. [25] YANG M, SONG X, ZHANG F, et al. Spatial proteomic landscape of primary and relapsed hepatocellular carcinoma reveals immune escape characteristics in early relapse[J]. Hepatology, 2025, 81(5): 1452-1467. DOI: 10.1097/HEP.0000000000000979. [26] SHENG J, ZHANG J, WANG L, et al. Topological analysis of hepatocellular carcinoma tumour microenvironment based on imaging mass cytometry reveals cellular neighbourhood regulated reversely by macrophages with different ontogeny[J]. Gut, 2022, 71(6): 1176-1191. DOI: 10.1136/gutjnl-2021-324339. [27] CHEN Y, ZHANG J, HU W, et al. Envafolimab plus lenvatinib and transcatheter arterial chemoembolization for unresectable hepatocellular carcinoma: a prospective, single-arm, phase Ⅱ study[J]. Sig Transduct Target Ther, 2024, 9(1): 280. DOI: 10.1038/s41392-024-01991-1. [28] MORIS D, PALTA M, KIM C, et al. Advances in the treatment of intrahepatic cholangiocarcinoma: an overview of the current and future therapeutic landscape for clinicians[J]. CA Cancer J Clin, 2023, 73(2): 198-222. DOI: 10.3322/caac.21759. [29] AFFO S, NAIR A, BRUNDU F, et al. Promotion of cholangiocarcinoma growth by diverse cancer-associated fibroblast subpopulations[J]. Cancer Cell, 2021, 39(6): 866-882. e11. DOI: 10.1016/j.ccell.2021.03.012. [30] HONG L, MEI J, SUN X, et al. Spatial single-cell proteomics landscape decodes the tumor microenvironmental ecosystem of intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Hepatology, 2026, 83(1): 57-74. DOI: 10.1097/HEP.0000000000001283. [31] BARETTI M, SHEKHAR S, SAHAI V, et al. Deep immune profiling of intrahepatic cholangiocarcinoma with CODEX multiplexed imaging[J]. Hepatol Commun, 2025, 9(3): e0632. DOI: 10.1097/HC9.0000000000000632.
