Molecular interaction between theophylline and DNA aptamers
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摘要:目的
采用多种技术探究茶碱与DNA适配体（APT）分子间相互作用的机制。
方法先采用生物膜干涉（BLI）技术，以100 mmol/L Tris-HCl+3 mmol/L MgCl2（pH 7.5）为缓冲液，对2 μmol/L的APT溶液与系列浓度梯度茶碱溶液（31.25、62.5、125、250、500和1 000 nmol/L）进行亲和力测定。再用圆二色谱（CD）技术测定4 μmol/L APT结合2 μmol/L茶碱前后的CD光谱。最后用表面增强拉曼光谱（SERS）技术采集50 μmol/L APT溶液和200 μmol/L茶碱溶液混合前后的SERS图谱，并对茶碱-APT复合物的SERS图谱和APT的SERS图谱进行差谱分析。
结果BLI实验测得APT与茶碱之间亲和力良好，平衡解离常数Kd为0.25 μmol/L，且APT对茶碱的亲和力远高于可可碱和咖啡因，APT对茶碱的选择性较好。通过随机DNA序列作为阴性对照，证实了APT与茶碱之间是特异性结合而不是非特异性吸附；CD实验证实了APT结合茶碱后构象会向茎环结构转变；SERS实验测得APT与茶碱结合后会引起APT上鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶的变化，说明APT结合茶碱后构象发生了改变，进而引起了APT的SERS信号发生了改变。
结论茶碱与DNA APT分子之间存在相互作用，且具有较好的亲和力；茶碱可以诱导APT分子结构发生改变，引起APT上碱基位置的改变。
Abstract:ObjectiveTo explore the molecular interaction mechanism between theophylline and DNA aptamers (APT) using various techniques.
MethodsFirstly, biolayer interferometry (BLI) was employed to determine the affinity between 2 μmol/L APT and a gradient of theophylline concentrations (31.25, 62.5, 125, 250, 500 and 1 000 nmol/L) in 100 mmol/L Tris-HCl+3 mmol/L MgCl2 (pH 7.5). Then, circular dichroism (CD) was used to measure the CD spectra of 4 μmol/L APT before and after binding with 2 μmol/L theophylline. Finally, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) was used to record spectra of 50 μmol/L APT and 200 μmol/L theophylline before and after mixing, and difference spectra were analyzed between the theophylline-APT complex and APT alone.
ResultsThe BLI experiment showed good affinity between APT and theophylline with an equilibrium dissociation constant Kd of 0.25 μmol/L. Moreover, the affinity of APT for theophylline was much higher than those of theobromine and caffeine, and the selectivity of APT for theophylline was good. With random DNA sequences as negative controls, it was confirmed that the binding between APT and theophylline was specific rather than non-specific adsorption. The CD experiment confirmed that the conformation of APT transformed to the stem-ring structure after binding to theophylline. The SERS experiment showed that the combination of APT and theophylline caused changes in guanine, adenine and cytosine on APT, indicating that the conformation of APT changed after binding to theophylline, which in turn led to changes in the SERS signal of APT.
ConclusionTheophylline interacts with DNA APT molecules with good affinity, inducing changes in the molecular structure of APT and altering the positions of its bases.
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适配体（aptamer，APT）指通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选得到的，能与特定靶标以高亲和力、高特异性结合的短链DNA或RNA[1-2]。APT诞生于20世纪90年代[3]，随着筛选技术的不断创新和完善，APT在药物研发、疾病治疗、食品安全检测等多个领域的应用研究也取得重大突破。对APT与配体的相互作用进行研究能阐明相关的生理及病理机制，优化APT性能，提升其在疾病诊断与治疗中的应用效果，为开发新型诊断和治疗方法提供理论基础，以期实现精准治疗。
1994年，科学家首次从寡核苷酸文库中筛选出茶碱的RNA APT[4]，并对茶碱RNA APT的结构和功能进行了深入研究，揭示了其与茶碱结合的分子机制。相较于RNA APT，DNA APT的稳定性更高、合成成本更低且易于修饰，有利于APT的检测和应用。Huang等[5]筛选出茶碱的DNA APT并测定了其与茶碱的亲和力，还制备了APT传感器用于检测，但并未对DNA APT与茶碱分子间相互作用机制进行研究。本文通过生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技术、圆二色谱（circular dichroism，CD）技术、表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技术对DNA APT与茶碱分子间相互作用机制进行了研究。
1 材料和方法
1.1 试剂
茶碱、可可碱、咖啡因（分析纯，中国食品药品检定研究院）；无水MgCl2、MgSO4、AgNO3、KI、二水合柠檬酸三钠、DMSO（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；Tris-HCl缓冲液、DEPC处理水（简称DEPC水）[分析纯，生工生物工程（上海）股份有限公司]；核酸APT（5′-GACGACGATTGTGGTCTATTCATA-GGCGTCCGCTGAGTCG-TC-3′）、随机单链DNA序列（random single-stranded DNA oligonucleotide sequence，RD）（5′-AGCTGCACTGCGTACGCTA-GCATCGTACGTGCATGCATGCAG-3′）以及含5′端Biotin修饰的核酸APT和RD[HPLC纯化，生工生物工程（上海）股份有限公司]；去离子水（海军军医大学药学院药物分析教研室自制）。
1.2 仪器与耗材
NanoDrop One型超微量紫外可见光分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司），Octet型超级链霉亲和素（super streptavidin，SSA）生物传感器（美国ForteBio公司），OctetRED 96型BLI仪（美国ForteBio公司），HA-202M型电子天平（日本AND公司），TG16-WS型高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），XploRA PLUS型共聚焦显微拉曼光谱仪（日本Horiba公司），DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司），HT7700 Exalens型透射电子显微镜（日本Hitachi公司），Zetasizer Nano ZS型粒径电位测定仪（英国马尔文仪器有限公司），Smart-D UV型实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司），Chirascan型CD仪（英国应用光物理公司）。
1.3 BLI检测APT与茶碱间的亲和力
1.3.1 溶液的配制
茶碱、可可碱、咖啡因溶液的配制：精确称取18.0 mg茶碱、18.0 mg可可碱、19.4 mg咖啡因，分别溶于500 mL缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，3 mmol/L MgCl2，pH 7.5；后续步骤均采用此缓冲液）中，完全溶解后即得浓度为200 µmol/L的茶碱、可可碱、咖啡因储备液。使用时按照所需浓度进行稀释。
生物素标记的APT/RD溶液配制：取5.02 nmol的APT/RD干粉离心（2 min，2 550×g），加入502 µL缓冲液充分溶解，涡旋混匀后得到浓度为10 µmol/L的APT/RD储备液。
1.3.2 BLI检测
BLI检测主要分为校正（缓冲液，1 min）、连接APT/RD（5 min）、清洗（缓冲液，1 min）、小分子结合（2 min）和解离（2 min）5个过程。
（1）APT与不同浓度梯度茶碱的结合：分别将31.25、62.5、125、250、500和1 000 nmol/L茶碱溶液，2 µmol/L APT溶液，缓冲液各200 µL，加入到对应的96孔板中，进行BLI检测。
（2）APT与不同浓度梯度的可可碱、咖啡因的结合：分别将0.625、1.25、2.5、5和10 µmol/L的可可碱溶液或咖啡因溶液，2 µmol/L的APT溶液，缓冲液各200 µL，加入到对应的96孔板中，进行BLI检测。
（3）茶碱与RD的结合：分别将0.312 5、0.625、1.25、2.5、5和10 µmol/L的茶碱溶液，2 µmol/L的RD溶液，缓冲液各200 µL，加入到对应的96孔板中，进行BLI检测。
1.3.3 数据处理
在OctetRED 96系统的程序中设置APT与配体分子为1∶1的结合模式，得到实验的响应值以及平衡解离常数Kd值。
1.4 CD验证APT结合茶碱后构象的改变
分别配制1 mL浓度为4 µmol/L的APT溶液和1 mL 2 µmol/L茶碱+4 µmol/L APT的混合溶液，使用Chirascan色谱仪分析并分别记录CD光谱。
1.5 SERS测定APT结合茶碱后构象的变化
1.5.1 溶液的配制
茶碱、可可碱、咖啡因溶液的配制：精确称取18.0 mg茶碱、18.0 mg可可碱、19.4 mg咖啡因，分别溶于500 mL DEPC水中，完全溶解后即得浓度为200 µmol/L的茶碱、可可碱、咖啡因溶液。
柠檬酸三钠溶液的配制：精密称取40 mg二水合柠檬酸三钠，溶于4 mL DEPC水中，完全溶解后即得到浓度为34 mmol/L的柠檬酸三钠溶液。KI/MgSO4溶液的配制：精密称取16.6 mg KI粉末、120 mg MgSO4粉末，分别溶于100 mL DEPC水中，完全溶解后即得浓度为1 mmol/L的KI溶液、10 mmol/L的MgSO4溶液。APT/RD溶液的配制：取5.02 nmol的APT/RD干粉离心（2 min，2 550 ×g），加入100.4 µL DEPC水充分溶解，涡旋混匀后得到浓度为50 µmol/L的APT/RD溶液。
1.5.2 纳米银胶溶液的制备
采用经典的Lee法[6]，精密称取硝酸银36 mg完全溶解于6 mL去离子水中，转移至三颈烧瓶内，再加入194 mL去离子水，在回流装置下开启磁力搅拌器加热并溶液微沸时，将4 mL柠檬酸三钠水溶液缓慢加入三颈瓶中，继续反应1 h后关闭加热装置，冷却至室温后转移至棕色瓶，避光保存。
1.5.3 纳米银胶的表征
紫外、透射电镜表征：取0.5 mL银胶溶液进行离心（10 min，6 530×g），去除上清液后加入1 mL去离子水复溶，进行紫外吸收光谱扫描和透射电子显微镜测定。
粒径表征：取1 mL银胶溶液进行离心（10 min，6 530×g），去除上清液后加入10 mL去离子水复溶，取1 mL至粒径皿中进行测定。
1.5.4 SERS测定
（1）银胶的前处理：先进行浓缩，取9 mL银胶溶液离心（10 min，6 530×g），去除上清液后加入150 μL去离子水复溶。再进行清洗，吸取10 μL浓缩银胶溶液加入4 μL 1 mmol/LKI溶液，吹打均匀后，室温下孵育1 h左右。（2）APT/RD的测定：处理后的银胶溶液加入5 μL 50 µmol/L APT/RD溶液吹打均匀，再加入5 μL 10 mmol/L MgSO4溶液，吹打均匀后加入DEPC水至终体积为30 μL，采集SERS图谱。（3）小分子（茶碱/可可碱/咖啡因）溶液的测定：处理后的银胶溶液加入5 μL 200 mmol/L小分子的标准溶液吹打均匀，再加入2 μL 10 mmol/L MgSO4溶液，吹打均匀后加入DEPC水至终体积为30 μL，采集SERS图谱。（4）APT-小分子的测定：处理后的银胶溶液加入5 μL 50 µmol/L APT溶液吹打均匀，然后加入5 μL 200 µmol/L小分子的标准溶液吹打均匀，再加入5 μL 10 mmol/L MgSO4溶液，吹打均匀后，加入DEPC水至终体积为30 μL，采集SERS图谱。（5）RD-茶碱的测定：与APT-小分子的测定方法相同。
2 结果
2.1 BLI检测结果
2.1.1 APT与茶碱的结合情况分析
见图 1，利用BLI仪器测定了2 μmol/L APT与浓度梯度茶碱的结合-解离情况。结果显示，传感系统响应值随着茶碱浓度的增加而逐渐上升，分别为0.011 9、0.021 7、0.036 9、0.056 0、0.075 7、0.090 6 nm，测得的平衡解离常数Kd＝0.25 μmol/L。同时，APT与茶碱的结合曲线在较短时间就达到了平衡状态，说明两者之间存在较高的亲和力。
图 1 APT与不同浓度梯度茶碱的结合-解离曲线Fig. 1 Association-dissociation curves of APT with theophylline in different concentration gradientsAPT: Aptamer.
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2.1.2 APT与不同浓度可可碱和咖啡因的结合情况分析
见图 2，在相同条件下对可可碱-APT、咖啡因-APT进行BLI实验，测得的可可碱与APT的平衡解离常数Kd为656 μmol/L。咖啡因的加入并不会引起响应值的波动，APT与茶碱的亲和力约为APT与可可碱亲和力的2 600倍，APT与咖啡因没有亲和力，证明APT对茶碱的选择性良好。
图 2 APT与浓度梯度可可碱（A）、咖啡因（B）的结合-解离曲线Fig. 2 Association-dissociation curves of APT with theobromine (A) and caffeine (B) in different concentration gradientsAPT: Aptamer.下载:
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2.1.3 APT-茶碱与RD-茶碱的亲和力比较
为了验证所选APT与茶碱之间是特异性结合，而不是非特异性吸附，随机选取了1条DNA序列（RD）作对照，由图 3可知，RD结合茶碱后响应值无升高，表明RD不会与茶碱发生相互作用。
图 3 RD与浓度梯度茶碱的结合-解离曲线Fig. 3 Association-dissociation curves of RD with theophylline in different concentration gradientsRD: Random single-stranded DNA oligonucleotide sequence.下载:
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2.2 CD实验验证结果
见图 4，APT溶液的CD光谱在280 nm处有一个正峰、245 nm处有一个负峰，茶碱加入后CD振幅降低，245 nm处峰发生轻微蓝移。
图 4 APT结合茶碱前后的CD光谱图Fig. 4 CD spectra before and after APT binding theophyllineAPT: Aptamer; CD: Circular dichroism.下载:
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2.3 SERS实验结果
2.3.1 纳米银胶表征结果
银胶的紫外-可见吸收光谱如图 5A所示，在300~750 nm的紫外吸收范围内只在418 nm处存在紫外吸收峰；图 5B为粒径检测结果，银胶的平均粒径约为52.07 nm；透射电子显微镜表征银胶的均一性和粒径结果如图 5C、5D所示，所制备的银胶粒子大体上呈球形，对单个球体直径分别测量并计算平均值，约为52 nm，且均一性良好。
图 5 纳米银胶的表征Fig. 5 Characterization of AgNPsA: Ultraviolet-visible spectroscopy of AgNPs; B: Particle size diagram of AgNPs; C: Transmission electron microscope image of AgNPs; D: Histogram of size distribution in transmission electron microscope. AgNP: Silver nanoparticle.下载:
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2.3.2 APT、茶碱、可可碱、咖啡因的SERS检测
APT、茶碱、可可碱、咖啡因的SERS图谱如图 6所示。APT的SERS信号主要体现在骨架的伸缩与碱基的振动，茶碱、可可碱、咖啡因的SERS信号主要体现在分子的特征官能团上。根据相关文献[7]，对峰位进行了简单的归属，见表 1~4。
图 6 APT（A）、茶碱（B）、可可碱（C）、咖啡因（D）的SERS图谱Fig. 6 SERS spectra of APT (A), theophylline (B), theobromine (C), and caffeine (D)APT: Aptamer; SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy; a.u.: Arbitrary unit.下载:
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表 1 APT的SERS峰位归属Table 1 SERS peak assignment of APTRaman shift/cm－1 Vibrational assignment 509 G, ring deformation 569 G, ring breathing 642 G, ring breathing 732 A, ring breathing 792 C, ring breathing 950 Deoxyribose+dG 1 027 C－O, stretching vibration 1 092 PO2－, symmetric stretching 1 329 dG(C2′-endo/syn) 1 394 A, ring modes 1 573 A+G, ring stretching vibration 1 639 T, ring breathing APT: Aptamer; SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 表 2 茶碱的SERS峰位归属Table 2 SERS peak assignment of theophyllineRaman shift/cm－1 Vibrational assignment 454 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation + CH bending 519 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation + CH bending 568 Pyrimidine ring breathing 643 Imidazole ring deformation + N－H deformation + CH deformation 684 Pyrimidine ring deformation 929 Imidazole ring deformation + O=C deformation + CH3 bending 950 Imidazole ring deformation + N－H bending 1 184 C－N stretching + CH3 bending + CH bending 1 218 C－N stretching 1 306 Imidazole ring stretching 1 380 CH3 bending 1 436 CH3 bending 1 532 Imidazole ring stretching + CH bending + N－H bending 1 586 C=C C－N stretching 1 688 C=O stretching SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 表 3 可可碱的SERS峰位归属Table 3 SERS peak assignment of theobromineRaman shift/cm－1 Vibrational assignment 473 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation 522 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation 637 Pyrimidine ring breathing 696 O=C deformation + N1－H deformation 753 C=O deformation 798 O－H deformation 951 Imidazopyrimidine ring deformation + CH3 bending 1 033 Imidazopyrimidine ring deformation + CH3 bending 1 074 CH3 rocking + C－N stretching 1 194 CH3 bending + C8H deformation 1 234 C－O stretching 1 313 Imidazole ring stretching + CH3 bending 1 353 N－H bending 1 385 Imidazole ring stretching + CH3 bending 1 416 CH3 bending 1 603 C=C stretching SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 表 4 咖啡因的SERS峰位归属Table 4 SERS peak assignment of caffeineRaman shift/cm－1 Vibrational assignment 483 C－N－C deformation 555 O=C－N deformation 644 O=C－N deformation 692 C=O deformation 742 O=C－C deformation 802 N－C－H deformation 949 Imidazopyrimidine ring deformation + CH3 bending 1 027 N－CH3 asymmetric stretching 1 076 C－C flat deformation 1 253 C－N stretching 1 329 Imidazole ring stretching 1 390 C－N asymmetric stretching 1 433 CH3 bending 1 600 C=C symmetrical stretching 1 651 C=O stretching 1 695 C=O stretching SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 2.3.3 APT-小分子、RD-茶碱的SERS检测
对茶碱-APT复合物的SERS图谱与APT的SERS图谱做了差谱（图 7A），发现2条光谱仅在509、567、686、1 292、1 394、1 573 cm－1处显示不同，其中509、567、1 394和1 573 cm－1处的峰相比于APT相应的位置的峰强度增加，同时686和1 292 cm－1处显示新的特征峰。
图 7 DNA与小分子的SERS图谱比较Fig. 7 SERS spectra of small molecule and DNAA: APT and theophylline; B: APT and theobromine; C: APT and caffeine; D: RD and theophylline. SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy; APT: Aptamer; RD: Random single-stranded DNA oligonucleotide sequence; a.u.: Arbitrary unit.下载:
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对咖啡因和可可碱进行了相同处理比较，结果表明APT与可可碱混合后其SERS信号以可可碱的SERS信号为主，含有少量APT信号（图 7B）；而APT与咖啡因混合后其SERS信号只有APT的信号（图 7C）。
选取随机DNA序列RD（2.1.3项BLI实验证实其与茶碱无亲和力）作为对照，结果如图 7D所示。RD与茶碱混合后，其SERS图谱与单独RD的SERS图谱一致，差谱几乎为一条直线。
3 讨论
3.1 茶碱与APT之间的亲和力
BLI是一种无标记、灵敏的实时技术，可用于确定2个结合分子之间的亲和力[8-10]。本实验利用BLI仪测定了APT与茶碱的亲和力，结果传感系统斜率和响应值随着茶碱浓度的增加而逐渐上升，表明随着茶碱浓度的提高，APT与茶碱结合的概率和数量增加。测得的平衡解离常数Kd＝0.25 μmol/L，与等温滴定量热法测定的Kd值0.51 μmol/L[5]十分相近，APT与茶碱的结合曲线在较短时间就达到了平衡状态，说明两者可以快速结合。
3.2 APT结合茶碱后的构象改变
CD技术具有高灵敏度、非破坏性和广泛适用性等优点，在DNA构象研究方面有着广泛的应用[11-12]。配基与DNA结合时会改变DNA的CD信号，通过观察和分析这些变化可以了解DNA与配体结合后的DNA构象变化[13]。如图 4所示，APT溶液的CD光谱峰位与典型B-DNA一致，随着茶碱的加入CD振幅降低，说明APT构象可能由单链转换为茎环[14]。
3.3 APT结合茶碱后SERS图谱
SERS作为一种生物指纹识别技术[15]，近年来因其超高的灵敏度和检测速度而备受关注，可用于检测核酸[16]、蛋白质[17]、药物[18]等。银胶因具有更高的等离子体共振活性，常被用作SERS基底的增强试剂[19-20]。因银胶增强效应与外观形态、颗粒大小、溶液均一性有关，故需对其进行表征。紫外吸收光谱图谱（图 5A）显示，418 nm是银胶的紫外吸收峰[21]，其峰形尖锐且半峰宽较小，说明分散性与均一性良好。结果得到纳米银胶的平均粒径约为52.07 nm，又对银胶进行透射电子显微镜表征，经过计算其平均直径约为52 nm，与粒径检测结果接近。
银胶浓缩后增强效果变好，但其表面的杂质也随之富集，为除去杂质对实验结果的影响，可利用KI溶液对其表面进行清洗[22]。在处理好的银胶溶液中先后加入APT和茶碱溶液，混匀后加入聚沉剂溶液使银胶聚沉。MgSO4的加入可以进一步缩短银胶颗粒之间的距离，使“热点”数目增多[23]。如图 7所示，茶碱-APT的SERS图谱与APT的SERS图谱十分类似，几乎无茶碱特征峰。可能是因为茶碱的体积较小，两者结合时茶碱进入APT内部，而无法靠近纳米银粒子表面。茶碱-APT与APT两者SERS图谱的差谱结果显示，茶碱-APT复合物在509、567和1 573 cm－1处的峰相比于APT相应位置的峰强度增加。509 cm－1处的峰与碱基G的变形振动有关，567 cm－1处的峰与碱基G的呼吸振动有关，1 573 cm－1处的峰与碱基A和G的伸缩振动有关[24-25]。可能的原因是APT与茶碱结合后构象发生改变，使相应碱基与纳米银粒子表面之间的距离缩短，或使相应碱基由内部暴露于纳米银粒子表面；686和1 292 cm－1处的峰不属于APT的特征峰，其中686 cm－1处的峰可与茶碱的特征峰相对应，而1 292 cm－1处的峰既不属于APT也不属于茶碱，可能是由于碱基A和C的环振动引起的[26]。APT加入茶碱前后SERS图谱的变化证明了两者之间存在相互作用，APT结合茶碱后构象会发生改变，同时与BLI和CD实验结果相互印证。
对可可碱与APT和咖啡因与APT混合物进行SERS检测，如图 7B和7C所示，虽然它们与茶碱结构相似，但与APT混合后引起APT的SERS信号的变化却完全不同：可可碱与APT混合后基本上都是可可碱的SERS信号，咖啡因与APT混合后其SERS信号仍只有APT的信号，即加入咖啡因不会改变APT的SERS信号。这个现象说明只有茶碱可以与APT发生相互作用，改变APT的构象及部分碱基在体系的位置。
为了进一步证明APT与茶碱之间的特异性，证明茶碱仅引起所选APT构象发生改变，取与茶碱之间无亲和力的RD作为对照，图 7D显示RD在加入茶碱前后其SERS图谱无明显改变，表明茶碱与RD不发生相互作用，与BLI结果一致。
本研究通过BLI实验证实了茶碱与DNA APT能够特异性结合，且DNA APT对茶碱选择性良好，并测得两者之间的Kd为0.25 μmol/L，亲和力与RNA APT相当[22]；通过CD实验说明APT构象在结合茶碱后发生了改变，可能形成了茎环结构；通过SERS实验进一步证实了茶碱与DNA APT之间存在相互作用，且作用后会引起构象的改变，还可定位DNA APT与茶碱发生相互作用后发生改变的碱基。3种技术对茶碱与APT的相互作用进行分析，结果相互验证，实现了DNA APT构象的简单快速分析。
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图 1 APT与不同浓度梯度茶碱的结合-解离曲线
Fig. 1 Association-dissociation curves of APT with theophylline in different concentration gradients
APT: Aptamer.
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图 2 APT与浓度梯度可可碱（A）、咖啡因（B）的结合-解离曲线
Fig. 2 Association-dissociation curves of APT with theobromine (A) and caffeine (B) in different concentration gradients
APT: Aptamer.
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图 3 RD与浓度梯度茶碱的结合-解离曲线
Fig. 3 Association-dissociation curves of RD with theophylline in different concentration gradients
RD: Random single-stranded DNA oligonucleotide sequence.
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图 4 APT结合茶碱前后的CD光谱图
Fig. 4 CD spectra before and after APT binding theophylline
APT: Aptamer; CD: Circular dichroism.
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图 5 纳米银胶的表征
Fig. 5 Characterization of AgNPs
A: Ultraviolet-visible spectroscopy of AgNPs; B: Particle size diagram of AgNPs; C: Transmission electron microscope image of AgNPs; D: Histogram of size distribution in transmission electron microscope. AgNP: Silver nanoparticle.
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图 6 APT（A）、茶碱（B）、可可碱（C）、咖啡因（D）的SERS图谱
Fig. 6 SERS spectra of APT (A), theophylline (B), theobromine (C), and caffeine (D)
APT: Aptamer; SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy; a.u.: Arbitrary unit.
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图 7 DNA与小分子的SERS图谱比较
Fig. 7 SERS spectra of small molecule and DNA
A: APT and theophylline; B: APT and theobromine; C: APT and caffeine; D: RD and theophylline. SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy; APT: Aptamer; RD: Random single-stranded DNA oligonucleotide sequence; a.u.: Arbitrary unit.
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表 1 APT的SERS峰位归属
Table 1 SERS peak assignment of APT
Raman shift/cm－1 Vibrational assignment 509 G, ring deformation 569 G, ring breathing 642 G, ring breathing 732 A, ring breathing 792 C, ring breathing 950 Deoxyribose+dG 1 027 C－O, stretching vibration 1 092 PO2－, symmetric stretching 1 329 dG(C2′-endo/syn) 1 394 A, ring modes 1 573 A+G, ring stretching vibration 1 639 T, ring breathing APT: Aptamer; SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 表 2 茶碱的SERS峰位归属
Table 2 SERS peak assignment of theophylline
Raman shift/cm－1 Vibrational assignment 454 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation + CH bending 519 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation + CH bending 568 Pyrimidine ring breathing 643 Imidazole ring deformation + N－H deformation + CH deformation 684 Pyrimidine ring deformation 929 Imidazole ring deformation + O=C deformation + CH3 bending 950 Imidazole ring deformation + N－H bending 1 184 C－N stretching + CH3 bending + CH bending 1 218 C－N stretching 1 306 Imidazole ring stretching 1 380 CH3 bending 1 436 CH3 bending 1 532 Imidazole ring stretching + CH bending + N－H bending 1 586 C=C C－N stretching 1 688 C=O stretching SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 表 3 可可碱的SERS峰位归属
Table 3 SERS peak assignment of theobromine
Raman shift/cm－1 Vibrational assignment 473 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation 522 Pyrimidine ring deformation + O=C－N deformation 637 Pyrimidine ring breathing 696 O=C deformation + N1－H deformation 753 C=O deformation 798 O－H deformation 951 Imidazopyrimidine ring deformation + CH3 bending 1 033 Imidazopyrimidine ring deformation + CH3 bending 1 074 CH3 rocking + C－N stretching 1 194 CH3 bending + C8H deformation 1 234 C－O stretching 1 313 Imidazole ring stretching + CH3 bending 1 353 N－H bending 1 385 Imidazole ring stretching + CH3 bending 1 416 CH3 bending 1 603 C=C stretching SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. 表 4 咖啡因的SERS峰位归属
Table 4 SERS peak assignment of caffeine
Raman shift/cm－1 Vibrational assignment 483 C－N－C deformation 555 O=C－N deformation 644 O=C－N deformation 692 C=O deformation 742 O=C－C deformation 802 N－C－H deformation 949 Imidazopyrimidine ring deformation + CH3 bending 1 027 N－CH3 asymmetric stretching 1 076 C－C flat deformation 1 253 C－N stretching 1 329 Imidazole ring stretching 1 390 C－N asymmetric stretching 1 433 CH3 bending 1 600 C=C symmetrical stretching 1 651 C=O stretching 1 695 C=O stretching SERS: Surface-enhanced Raman spectroscopy. -
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