胃癌是一种具有高发病率和高死亡率的消化系统恶性肿瘤。GLOBOCAN 2022统计数据显示，胃癌是全球第五大常见癌症（占新发癌症病例数的4.85%），同时也是第五大癌症相关死因（占癌症死亡总人数的6.78%）^[1-2]。目前胃癌治疗以手术治疗、药物治疗和免疫治疗等疗法为主，但往往疗效不佳，且各种化疗药物的不良反应对患者生活质量也会产生不可忽视的影响^[3]。因此，积极采取针对性治疗措施，解决胃癌治疗效果不佳、药物不良反应严重的问题以及提高患者生存率至关重要。

二甲双胍是目前2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者使用最广泛的临床一线口服降糖药物，其作用机制是抑制肝脏糖异生并增加胰腺外周组织对胰岛素的敏感性，从而有效降低机体血糖^[4]。衰老是驱动癌症发生、发展的关键危险因素，有研究表明二甲双胍能够有效延缓衰老进程，因此这一新发现为探索二甲双胍在肿瘤防治中的应用潜力奠定了重要的理论基础^[5-6]。流行病学数据显示，二甲双胍可以降低消化系肿瘤的发病率和死亡率^[7-8]。研究表明，二甲双胍的分子机制是抑制线粒体呼吸链复合体，激活腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路，从而抑制脂肪合成、提高机体对胰岛素的敏感性^[9]。AMPK激活可以抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，抑制蛋白质合成、细胞生长和增殖，在肿瘤细胞中mTOR是细胞生长和增殖的中心调节因子，它可以促进蛋白质合成、核糖体生物合成和细胞生长^[10]。mTOR在大多数肿瘤中过度激活，促进肿瘤细胞的无限制增殖。AMPK激活可以诱导自噬，而肿瘤细胞通过这种机制可降解受损的蛋白质或细胞器，以维持细胞的稳态^[11]。

胃癌患者常伴T2DM等代谢性基础疾病。流行病学证据提示，接受二甲双胍治疗的T2DM合并胃癌患者可能预后更佳^[12]。该发现为二甲双胍在肿瘤领域的“药物重定位”（drug repurposing）研究提供了有力依据。现有研究已初步揭示了部分作用机制，但其完整的分子调控网络仍未阐明，尤其在二甲双胍如何直接影响胃癌细胞增殖方面仍缺乏系统的实验数据^[13]。本研究旨在通过体外与体内实验阐明二甲双胍对胃癌细胞增殖的直接调控作用及其分子机制，为其抗癌应用提供理论与实验基础。

1   材料和方法

1.1   试剂

二甲双胍、氯喹（货号C6628，纯度98.5%）、雷帕霉素（货号553210，纯度95%）和z-VAD-fmk（货号V116，纯度98%）均购自美国Sigma-Aldrich公司。所有试剂在体外实验中均用无菌PBS稀释，在体内实验中用无菌生理盐水稀释。

1.2   细胞

人胃癌细胞系AGS购自中国典型培养物保藏中心，人胃癌细胞系HGC-27购自美国ThermoFisher Scientific公司。所有细胞均采用含10% FBS（美国Zeta life公司，货号z7010）和1%青霉素-链霉素（美国Gibco公司，货号10378016）的RPMI 1640培养基（大连美仑生物技术有限公司，货号MA0553）于37.5 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.3   细胞毒性和增殖实验

细胞毒性和增殖实验使用CCK-8[比色法，翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号40203ES92]按照说明书进行。设置细胞空白组和培养基空白组。调整HGC-27和AGS细胞悬液密度后，将100 μL细胞悬液接种到96孔板，细胞量为2 000个细胞/孔。96孔板的边缘孔用无菌PBS填充。在5% CO₂、37 ℃环境中孵育细胞，直到细胞在96孔板孔底形成单层。然后吸弃培养基，加入200 μL含不同浓度（0、5、10、20、40 mmol/L）二甲双胍的培养基，继续孵育72 h后在倒置显微镜下观察。向每个孔中添加20 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育30 min，使用酶标仪测量450 nm波长处光密度值（D值）。

1.4   凋亡抑制剂干预实验

设置对照组（PBS）、二甲双胍组（0.4 mmol/L）、z-VAD-fmk组（20 mmol/L）和二甲双胍（0.4 mmol/L）+z-VAD-fmk（20 mmol/L）联用组，各组分别在处理AGS细胞72 h后通过CCK-8法测定细胞存活率。

1.5   自噬调节剂联合处理实验

将自噬抑制剂氯喹和自噬促进剂雷帕霉素分别按10 μmol/L和0.5 μmol/L的浓度单独或与二甲双胍联用处理AGS、HCG-27细胞。通过蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）表达变化。

1.6   流式细胞术分析

用5 mmol/L二甲双胍处理AGS细胞后，使用膜朕蛋白Ⅴ-FITC/PI凋亡测定试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号MA0220），通过Cyto FLEX流式细胞仪（美国Beckman Coulter Life Science公司）检测AGS细胞的凋亡水平。

1.7   蛋白质印迹法分析

从经二甲双胍处理的AGS细胞中提取总蛋白质，使用BCA法精确定量后，通过SDS-PAGE分离蛋白质，然后用湿法转膜至NC膜上，再用3%牛血清白蛋白溶液封闭。依次孵育一抗[LC3抗体，货号2775，美国Cell Sigaling Technology公司，稀释比例为1∶500；切割活化形式的caspase 3（cleaved caspase 3）抗体，货号TA7022S，艾比玛特医药科技（上海）有限公司，稀释比例为1∶1 000；β肌动蛋白，货号P30002S，艾比玛特医药科技（上海）有限公司，稀释比例为1∶2 000]与相应二抗[山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG，货号分别为M211620、M210520，均购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司，稀释比例均为1∶1 000]以特异性识别目标蛋白质，最后利用ECL法进行显影，并通过ImageJ软件对蛋白质条带进行定量分析。

1.8   裸鼠皮下移植瘤模型建立与体内实验

所有动物实验方案均严格遵守海军军医大学转化医学中心实验动物福利与伦理委员会规定，并已获得其审核批准。

选用6~8周龄雄性BALB/c裸鼠[上海灵畅生物科技有限公司，货号为FCB0106；实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2023-0003]，在SPF级环境中饲养。选取处于对数生长期、状态良好的AGS细胞培养至融合度80%~90%时，经胰蛋白酶消化后收集并用预冷的无菌PBS洗涤2次，以彻底去除培养基和血清。随后，将细胞沉淀重悬于PBS中，调整细胞悬液密度为5×10⁷/mL。每只裸鼠于右后肢皮下注射1次0.1 mL含5×10⁶个AGS细胞的悬液。此后持续监测肿瘤生长情况，待皮下移植瘤的平均体积约100 mm³时，将所有荷瘤小鼠随机分组并开始执行相应的给药方案（n＝8）。

（1）二甲双胍单药疗效评估：将荷瘤小鼠随机分为对照组（每日灌胃等体积生理盐水）和二甲双胍组（每日灌胃给予二甲双胍溶液）。二甲双胍配制为100 mg/mL的储备溶液，按100 mg/（kg·d）剂量给药，实验中每次给药前称重并计算每只小鼠的给药体积以保证剂量准确。

（2）联合用药协同效应评估：将荷瘤小鼠随机分为对照组（每日灌胃等体积生理盐水）、氯喹组（每日以50 mg/kg的剂量灌胃氯喹）、二甲双胍组（每日以100 mg/kg的剂量灌胃二甲双胍，配制成100 mg/mL的溶液）和二甲双胍与氯喹联用组（每日同时以100 mg/kg的剂量灌胃二甲双胍和以50 mg/kg的剂量灌胃氯喹）。连续给药3周，在每个给药日对小鼠进行称重并计算灌胃体积。

在整个治疗周期内，定期检测并记录小鼠体重和肿瘤最长径（L）与最短径（W），计算肿瘤体积（V）：V＝（L×W²）/2。实验结束后采用CO₂窒息法处死小鼠，解剖取出各组肿瘤并称重。

1.9   统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法；肿瘤生长曲线分析采用重复测量方差分析。检验水准（α）为0.05。

2   结果

2.1   二甲双胍可抑制人胃癌细胞AGS、HGC-27的增殖

不同浓度二甲双胍作用72 h均对AGS、HGC-27细胞的增殖表现出抑制作用（均P＜0.01），且随着二甲双胍浓度的升高AGS和HGC-27细胞存活率均逐步下降（图 1A）。通过非线性回归分析计算，二甲双胍对AGS细胞的IC₅₀为5.72 mmol/L，对HGC-27细胞的IC₅₀为13.32 mmol/L。本研究选取10 mmol/L作为后续时间梯度实验的标准化浓度，以考察二甲双胍药效的持续性。将AGS和HGC-27细胞用10 mmol/L二甲双胍分别处理0、12、24、36、48 h，2种细胞的存活率均随二甲双胍作用时间的延长持续降低（均P＜0.01），且表现出时间依赖性（图 1B）。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，二甲双胍处理后存活AGS细胞比例减少，而凋亡细胞比例则相应地增多（图 1C）。这一现象初步提示诱导细胞凋亡可能是二甲双胍发挥其抗肿瘤作用的关键途径之一。

图  1  二甲双胍对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响

A: Changes in cell viability of human gastric cancer cell lines AGS and HGC-27 after 72 h treatment with different concentrations of metformin (^**P＜0.01 vs 0 mmol/L in the same cell line. n＝6, x±s); B: Time-course changes in cell viability of AGS and HGC-27 cells exposed to metformin at 10 mmol/L for 0-48 h (^**P＜0.01 vs 0 h in the same cell line. n＝6, x±s); C: Apoptosis changes of AGS cells detected by flow cytometry after treatment with metformin at 5 mmol/L. PI: Propidium iodide.

Fig.  1  Effects of metformin on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cells

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2.2   二甲双胍诱导胃癌细胞发生caspase依赖性凋亡

蛋白质印迹法检测结果显示，二甲双胍处理后AGS细胞中的cleaved caspase 3蛋白表达增加（图 2A）。z-VAD-fmk组与对照组AGS细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），说明凋亡抑制剂z-VAD-fmk对AGS细胞无保护或杀伤作用；而z-VAD-fmk与二甲双胍联用后，细胞存活率较二甲双胍组提升（P＜0.01），说明抑制凋亡可有效削弱二甲双胍对胃癌细胞的毒性作用（图 2B）。

图  2  二甲双胍对胃癌细胞AGS中凋亡相关蛋白表达的影响（A）及其受z-VAD-fmk干扰的分析（B）

z-VAD-fmk is an apoptosis inhibitor. ^**P＜0.01. n＝6, x±s. caspase 3: Cysteine aspartic acid specific protease 3.

Fig.  2  Effects of metformin on expression of apoptosis-related proteins (A) and interference by z-VAD-fmk (B) in gastric cancer cell AGS

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2.3   二甲双胍诱导胃癌细胞凋亡的同时激活保护性自噬

蛋白质印迹法检测结果显示，二甲双胍处理提升了AGS细胞中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平，与氯喹联用则导致LC3-Ⅱ进一步累积，这说明二甲双胍确实增强了自噬流（图 3A、3B）。与单用二甲双胍相比，二甲双胍与氯喹联用对AGS、HGC-27细胞的毒性增强，导致2种细胞的存活率均进一步下降（均P＜0.01，图 3C、3D），而二甲双胍与雷帕霉素联用则未对2种细胞的存活率产生明显影响（均P＞0.05，图 3E、3F）。

图  3  二甲双胍通过调控自噬影响胃癌细胞的存活

A: Expression of autophagy-related protein LC3 in human gastric cancer cell AGS following treatment with metformin detected by Western blotting; B: Expression of LC3 in AGS cells following treatment with metformin, chloroquine (an autophagy inhibitor), or their combination detected by Western blotting; C, D: Cell viability of AGS cells (C) and HGC-27 cells (D) determined by CCK-8assay after treatment with metformin and chloroquine alone or in combination; E, F: Cell viability of AGS cells (E) and HGC-27 cells (F) determined by CCK-8 assay after treatment with metformin and rapamycin (an autophagy inducer) alone or in combination. ^**P＜0.01. n＝6, x±s. LC3: Microtubule associated protein 1 light chain 3; CCK-8: Cell counting kit 8.

Fig.  3  Metformin affects survival of gastric cancer cells by regulating autophagy

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2.4   抑制保护性自噬可协同增强二甲双胍的凋亡诱导效应

2.4.1   二甲双胍在体内有效抑制胃癌异种移植瘤的生长

在给药后21 d内，对照组肿瘤体积持续快速增长，而二甲双胍组的肿瘤生长受到抑制（P＜0.01，图 4）；第21天时，对照组平均肿瘤体积大于二甲双胍组[（808.45±148.80）mm3 vs（287.76±60.32）mm3，P＜0.01]，平均肿瘤重量高于二甲双胍组[（0.84±0.06）g vs（0.34±0.08）g，P＜0.01]。

图  4  二甲双胍对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型肿瘤生长的影响

^**P＜0.01 vs metformin group at the same time point. n＝8, x±s.

Fig.  4  Effect of metformin on tumor growth in a gastric cancer subcutaneous xenograft nude mouse model

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2.4.2   联合自噬抑制剂可协同增强二甲双胍的体内抗肿瘤功效

与对照组相比，氯喹组的肿瘤生长速度无显著变化，给药第20天末平均肿瘤体积与对照组相比差异无统计学意义[（1 414.85±145.17）mm3 vs（1 522.13±152.75）mm3，P＞0.05]，表明在此模型中氯喹本身不具备独立的抗肿瘤活性；二甲双胍有效抑制了肿瘤生长，第20天末平均肿瘤体积小于对照组[（1 001.71±103.27）mm3 vs（1 522.13±152.75）mm3，P＜0.01]；而二甲双胍与氯喹联合组表现出更优的抗肿瘤效果，其肿瘤生长速度最为缓慢，在第20天末平均肿瘤体积为（599.99±109.62）mm3，优于二甲双胍组（P＜0.01），这一结果证明在体内抑制自噬能够增强二甲双胍的抗肿瘤功效（图 5）。给药第20天末时，对照组平均肿瘤重量为（1.93±0.17）g，氯喹组为（1.88±0.10）g，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；二甲双胍组平均肿瘤重量为（0.84±0.06）g，低于对照组（P＜0.01）；而二甲双胍与氯喹联合组平均肿瘤重量为（0.34±0.08）g，与对照组和二甲双胍组相比均降低（均P＜0.01），进一步说明二甲双胍在体内可产生对胃癌细胞的杀伤作用，且联用自噬抑制剂效果更强。

图  5  二甲双胍在体内对荷瘤小鼠胃癌体积的影响

^**P＜0.01 on day 20. n＝8, x±s.

Fig.  5  Effect of metformin on tumor volume of gastric cancer in tumor-bearing mice in vivo

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3   讨论

胃癌是全球范围内高致死率的恶性肿瘤之一^[1]。大部分患者发现胃癌时常合并其他基础疾病，而基础疾病、基础疾病用药与肿瘤发生和发展以及治疗之间的相互作用尚未得到充分的研究。目前二甲双胍对于抗衰老、治疗认知障碍和癌症等多种疾病的影响是研究热点^[5]。有研究表明二甲双胍通过影响脂肪酸合成抑制膀胱癌细胞增殖^[14]，还通过干扰肿瘤细胞的糖酵解作用抑制肿瘤细胞增殖^[15]。本研究的核心发现是，二甲双胍在诱导胃癌细胞凋亡的同时激活了一种拮抗其疗效的保护性自噬。首先通过体外实验证实，二甲双胍能以浓度和时间依赖的方式抑制人胃癌AGS和HGC-27细胞的增殖。细胞凋亡是多细胞生物体的一种程序性细胞死亡过程，也是抗肿瘤药物发挥疗效的核心机制之一。基于流式细胞术观察到的凋亡现象以及既有文献报道，二甲双胍的抗肿瘤效应通常与经典的细胞信号通路调控相关。本研究推测，二甲双胍主要通过激活caspase蛋白酶级联反应，即典型的caspase依赖性凋亡途径，促进caspase 3激活，最终导致胃癌细胞凋亡。细胞在面临药物、缺氧或营养匮乏等应激条件时，除了启动凋亡等死亡程序外，还可能激活其他细胞生物学过程以试图适应和生存^[16]。

自噬作为一种重要的细胞内循环降解机制，在维持细胞稳态和应对外界压力中扮演着关键角色。本研究发现，AGS细胞经不同浓度的二甲双胍处理后其自噬相关蛋白LC3的表达呈现出典型的自噬激活模式。LC3由胞质可溶形式（LC3-Ⅰ）转变为与自噬体膜结合的脂化形式（LC3-Ⅱ）是自噬激活的核心标志。自噬在肿瘤治疗中扮演着复杂的双重角色，既可作为一种促死亡机制，也可作为一种促生存（保护性）机制^[14]。氯喹通过抑制自噬体与溶酶体的融合来阻断自噬流的末端降解环节^[17]。本实验结果有力地证明，二甲双胍在胃癌细胞中诱导的自噬是一种保护性自噬，它并非协同药物杀伤肿瘤，而是通过拮抗药物自身的抗肿瘤效应，作为一种细胞的适应性抵抗机制而存在^[18]。本实验还发现，二甲双胍处理也上调了自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的水平，该结果揭示了这种自噬的“双刃剑”属性：抑制自噬（联用氯喹）能够增强二甲双胍的细胞毒性，而促进自噬则无此效果^[19]。这有力地证明二甲双胍诱导的自噬并非细胞死亡的执行者，而是一种细胞为应对药物压力而启动的促生存防御机制^[20]。在多种化疗和靶向治疗中，保护性自噬均被证实是导致药物疗效受限和肿瘤复发的重要原因^{[14, 21]}。本实验结果表明，二甲双胍在胃癌治疗中也面临同样的挑战。这一细胞内部凋亡与自噬的“博弈”可能源于上游关键能量感受器AMPK的激活，该通路既能通过抑制mTOR促进凋亡，又能直接启动自噬程序^[22]，二甲双胍的最终疗效取决于这2种下游效应的平衡结果。本研究提出了一个合理的联合治疗策略，并在裸鼠皮下移植瘤模型中验证了其有效性：与二甲双胍单药相比，二甲双胍与氯喹联合应用增强了体内抗肿瘤效果。这一结果提示通过抑制保护性自噬可“解除”癌细胞的防御，有望成为提高二甲双胍在胃癌患者中疗效的关键^[23]。

本研究也存在一些局限性。首先，体外实验所用的二甲双胍浓度远高于临床生理浓度，其结果的直接转化需谨慎。其次，本研究未直接检测AMPK/mTOR等上游信号分子的磷酸化状态，对核心机制的阐释仍有待深化。未来的研究应致力于在体内模型中验证联合用药对凋亡和自噬的分子调控，并进一步探索可预测二甲双胍敏感性的生物标志物，为实现个体化治疗提供指导。同时，开展针对不同糖尿病状态的胃癌患者使用二甲双胍的预后对比研究将具有重要的临床价值。