烧伤、慢性创面和感染等造成的皮肤损伤广泛存在，尤其在老年人群和糖尿病患者中其发病率逐年升高，严重时可导致患者组织坏死、功能缺失甚至死亡^[1-2]。现有的皮肤修复材料多以生物敷料或组织移植为主，存在结构单一、功能重建不足等问题，难以完全模拟天然皮肤的各种功能^[3-4]。组织工程皮肤是通过组织工程技术形成的三维多细胞结构，其可复制皮肤的主要结构和功能，但当前的组织工程皮肤往往存在构建结构不完整、耗时长、费用高等不足，难以应用于大面积皮肤缺损^[5-6]。

近年来，静电纺丝技术合成的生物压电材料因可构建仿生纳米结构支架而广泛应用于组织工程领域^[7]。压电材料能够将机械刺激转化为微弱电信号，通过模拟皮肤伤口处的生物电环境调节细胞行为，促进细胞迁移、增殖及组织再生^[8-9]。左旋聚乳酸（poly(L-lactic acid)，PLLA）作为一种可降解高分子材料，具备良好的力学强度和成膜性能，但其表面疏水性限制了细胞的黏附与扩展^[10]。透明质酸（hyaluronic acid，HA）具有良好的亲水性与生物相容性，是改善材料表面性质的常用手段^[11]。本研究通过静电纺丝技术制备PLLA纳米纤维膜，并在其一侧浸涂HA以增强亲水性，随后将人永生化表皮角质形成细胞HaCaT与人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）分别接种于膜的两侧，模拟天然皮肤结构，构建表皮-真皮双细胞协同的三维组织工程皮肤模型。该模型不仅结构明确、细胞功能良好，还结合了压电特性和HA特性，可在体外模拟早期创面修复的微环境，为皮肤修复材料开发及相关疾病研究提供新的策略和仿生学依据。

1   材料和方法

1.1   主要试剂及仪器

人永生化表皮角质形成细胞系HaCaT、HDF、胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合液、无血清细胞冻存液[赛百慷（上海）生物技术股份有限公司]；DMEM、FBS（美国ThermoFisher Scientific公司）；钙黄绿素AM（calcein-AM）/PI细胞双染试剂盒、CCK-8试剂盒、Triton X-100通透液、4%多聚甲醛固定液、DAPI染色液（上海碧云天生物技术有限公司）；六氟异丙醇、HA（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PLLA（深圳聚生生物科技有限公司）；静电纺丝设备E05（佛山轻子精密测控技术有限公司）；扫描电子显微镜（德国Zeiss公司）；接触角测量仪（德国Dataphysics公司）；显微镜（德国Leica公司）。

1.2   实验细胞培养

HaCaT细胞采用含10% FBS、1%青霉素-链霉素混合液的高糖型DMEM置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中常规培养，当细胞密度达到90%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化并按1∶4比例传代培养，培养基每2~3 d更换一次。HDF采用含10% FBS、1%青霉素-链霉素混合液的低糖型DMEM在37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，当细胞密度达到约80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化并按1∶3比例传代培养，培养基每2~3 d更换一次。实验均选用第3~6代细胞。

1.3   材料合成及表征

1.3.1   PLLA纳米纤维膜的制备

将分子量80 000的PLLA按照13%（质量/体积百分比）溶解于六氟异丙醇中，在室温下磁力搅拌至少12 h以充分溶解形成均匀的纺丝前驱液。将溶液装入10 mL一次性注射器中，连接金属针头并安装于静电纺丝装置。设定纺丝参数如下：正高压电压为+7.53 kV，负高压电压为－2.41 kV；注射泵供液速度为0.55 mL/h；收集距离为15 cm；接收装置采用旋转鼓轮形式，鼓轮转速控制为手动移动速度30 cm/min，以保证纤维在轴向均匀沉积。整个过程在室温（25±2）℃、相对湿度40%~50%的环境中进行。纺丝完成后，所得PLLA纳米纤维膜过夜自然干燥以去除残留溶剂。

1.3.2   PLLA膜的HA浸涂改性处理

为了改善PLLA膜的亲水性并提升其细胞黏附性能，用HA对膜表面进行单侧浸涂处理。将HA按照1%（质量/体积百分比）溶于无菌去离子水中制备HA溶液。将溶液浸涂铺盖在PLLA膜表面的一侧，确保覆盖均匀，放置于37 ℃培养箱中孵育1 h。将膜取出后去除表面多余溶液并置于37 ℃恒温培养箱中过夜干燥，使HA牢固附着于PPLA膜表面。

1.3.3   PLLA膜表面接触角测定

为评估PLLA膜及其HA改性后的表面亲水性，采用接触角测量仪对膜的静态水接触角进行测定。测试前将膜裁剪为大小1 cm×1 cm的贴片，平整贴附于干净玻璃载片上。在室温（25±2）℃环境下，使用加液系统垂直滴加4 μL去离子水于膜表面，自动定时采集图像进行分析，总采集时长为90 s，图像采集间隔时间为15 s。接触角通过图像分析软件进行自动拟合，分析算法采用椭圆拟合法（elliptical fitting）。每种膜片随机选取3个样本，分别测量接触角并取其平均值用于后续统计分析。

1.4   材料生物相容性验证

1.4.1   活/死细胞双染色

对PLLA膜和PLLA/HA膜紫外照射2 h进行灭菌处理，随后将已灭菌的2种膜裁剪成大小为1 cm×1 cm的贴片，分别加入含10% FBS的完全培养基中，按照提取剂体积与材料面积1 mL/cm²的比例配制浸提工作液，37 ℃恒温分别孵育24、48和72 h取上清，即为材料浸提液。将HDF接种于24孔板，待细胞贴壁稳定后，吸除原有培养基，换用对应组别的材料浸提液继续培养24 h，随后进行活/死细胞双染色：按试剂说明书配制活/死细胞双染色工作液（钙黄绿素AM与PI混合）并作用于细胞30 min，然后用PBS轻洗，置于荧光显微镜下观察。绿色荧光表示活细胞，红色荧光表示死细胞。

1.4.2   CCK-8检测

将灭菌后的PLLA膜和PLLA/HA膜剪裁为直径约6 mm的小圆片，分别贴附于96孔板孔底。每孔接种5×10³个HaCaT细胞，每组设3个重复孔。分别在培养24、48和72 h后加入10 μL CCK-8工作液，继续37 ℃孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长下测定光密度值（D值），计算细胞增殖活性。

1.5   组织工程皮肤培养及表征

1.5.1   组织工程皮肤构建与培养

将灭菌后的PLLA/HA膜裁剪成大小为1 cm×1 cm的片状，分别放置于12孔板中。将1×10⁵个HaCaT细胞接种于PLLA/HA膜的PLLA侧，将HDF以同样密度接种于膜的HA侧，注意接种均匀。细胞接种后，将培养板置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中静置孵育2~3 h，使细胞充分附着。孵育结束后，沿培养孔壁缓慢加入完全培养基，每孔约2 mL，避免冲刷细胞。随后将培养板置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，以观察和检测组织工程皮肤的形态、生长状态及细胞活性。

1.5.2   鬼笔环肽细胞骨架染色

为观察HaCaT细胞与HDF在PLLA/HA膜两侧的黏附与铺展情况，将合成的组织工程皮肤模型培养至第3天进行鬼笔环肽细胞骨架染色。取出组织工程皮肤模型，使用PBS清洗3次以去除残余培养基。随后使用4%多聚甲醛固定液室温固定10 min，再次用PBS清洗3次。使用0.1% Triton X-100通透液于室温透膜10 min，继续用PBS清洗3次。将提前配制好的鬼笔环肽染色工作液滴加于组织工程皮肤两侧表面，避光孵育30 min。随后使用DAPI染色液（1 μg/mL）对细胞核复染5 min，最后用PBS清洗去除多余染液。染色完成后将组织工程皮肤模型转移至玻片上，封片并置于荧光显微镜下观察。红色荧光代表F肌动蛋白（F-actin）细胞骨架结构，蓝色荧光代表细胞核。

1.5.3   HA引入对细胞增殖的促进作用验证

为验证HA的引入是否促进了细胞黏附增殖，将HaCaT细胞和HDF分别接种于PLLA膜和PLLA/HA膜的HA侧，以比较2组材料对细胞生长的影响。将PLLA膜与PLLA/HA膜分别裁剪为大小1 cm×1 cm的片状，置于12孔板中。分别将HaCaT细胞和HDF以1×10⁵个/孔的密度接种于膜上，每种细胞类型与膜材料组合均设3个重复孔。细胞接种后，将培养板置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中静置孵育2~3 h，随后每孔缓慢加入2 mL完全培养基，避免扰动细胞。培养至第3天，使用活/死细胞双染色工作液进行染色，避光作用于细胞30 min，PBS清洗后置于荧光显微镜下观察。

1.6   体外愈合实验

采用HaCaT细胞划痕实验验证PLLA/HA组织工程皮肤模型在体外促进皮肤细胞迁移及创面愈合的作用。将HaCaT细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于12孔板，培养至细胞单层长满（约90%融合）后，使用无菌200 μL枪头在孔中央垂直刮出一条均匀划痕。刮痕后轻柔吸除培养液，使用PBS清洗2~3次以去除浮游细胞和碎片，设空白对照、PLLA/HA膜对照及组织工程皮肤模型3组：空白对照组未加入任何膜材料，仅继续培养细胞；PLLA/HA膜对照组在细胞层上方加入PLLA/HA膜；组织工程皮肤模型组则加入预培养3 d的PLLA/HA膜组织工程皮肤。各组划痕后继续在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，随后使用显微镜拍摄划痕区域图像，记录细胞迁移及划痕愈合情况。通过ImageJ软件测量划痕初始宽度与培养24 h时的残余宽度，计算愈合率，以评价组织工程皮肤模型对HaCaT细胞迁移与创面愈合能力的影响。

1.7   统计学处理

采用GraphPad Prism 10软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。检验水准（α）为0.05。

2   结果

2.1   组织工程皮肤支架合成及鉴定

基于静电纺丝技术成功制备了PLLA纳米纤维膜，所得膜质地柔软，表面均匀，支架形态规整；扫描电子显微镜观察到其纤维排列均匀、结构连续，无明显珠状缺陷，直径分布一致（图 1A）。使用1% HA溶液对PLLA膜表面进行浸涂改性处理，通过水接触角测试评估材料表面亲水性，结果显示PLLA膜表面接触角较大，表现为疏水性；经HA浸涂改性处理即刻和60 s的PLLA/HA膜接触角均变小（与PLLA膜相比，均P＜0.01），亲水性增强（图 1B）。结果表明HA浸涂处理能够有效改善PLLA膜的表面润湿性能，为后续细胞黏附与生长提供了更优微环境。

图  1  PLLA膜及PLLA/HA膜的形貌及表面性能表征

Fig.  1  Morphology and surface properties of PLLA and PLLA/HA membranes

A: Scanning electron microscopic images of PLLA membrane; B: Water contact angle measurement showing enhanced hydrophilicity of PLLA/HA membrane immediately and 60 s after HA dip-coating modification. ^**P < 0.01. n=3, x±s. PLLA: Poly(L-lactic acid); HA: Hyaluronic acid.

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2.2   组织工程皮肤支架生物相容性验证

将PLLA膜、PLLA/HA膜分别与含10% FBS的完全培养基孵育24、48和72 h后，取上清作为浸提液用于HDF的间接培养。培养24 h后进行活/死细胞双染色，结果显示用3个时间点浸提液培养的各组细胞均以绿色荧光为主，形态完整、密度均匀，红色荧光较少（图 2A）。定量分析结果表明，不同时间点浸提液培养的各组间细胞存活率差异均无统计学意义（均P＞0.05，图 2B）。结果提示无论PLLA膜还是PLLA/HA膜，在72 h内均不会释放明显对细胞有害的成分，整体表现出良好的生物安全性。

图  2  不同支架材料对HaCaT细胞和HDF生物相容性的影响

Fig.  2  Effects of different scaffold materials on biocompatibility of HaCaT cells and HDFs

A: Live/dead staining of HDFs cultured in extraction of PLLA or PLLA/HA membranes; B: Quantitative analysis of fluorescence intensity for live/dead staining; C: CCK-8 assay results of HaCaT cells. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01. n=3, x±s. HDF: Human dermal fibroblast; PLLA: Poly(L-lactic acid); HA: Hyaluronic acid; MFI: Mean fluorescence intensity; CCK-8: Cell counting kit 8.

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随后采用CCK-8法检测不同支架材料对细胞增殖活性的影响。将HaCaT细胞直接接种于PLLA膜、PLLA/HA膜及对照组中，分别于培养24、48、72 h后检测细胞增殖活性。结果显示，在24 h时，3组间细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05），提示短时间内2种支架材料对细胞增殖活性影响有限；在48 h时，PLLA/HA组细胞增殖活性较对照组略有升高（P＜0.05），而PLLA组与对照组、PLLA组与PLLA/HA组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）；至72 h时，3组细胞增殖活性差异进一步扩大，PLLA组和PLLA/HA组均高于对照组（P＜0.05、P＜0.01），且PLLA/HA组亦高于PLLA组（P＜0.05）（图 2C）。结果表明，随着培养时间的延长，PLLA与PLLA/HA支架均能促进HaCaT细胞增殖，其中经HA修饰后的PLLA/HA支架促进作用更为显著。

2.3   组织工程皮肤合成及培养

将HaCaT细胞与HDF分别接种于PLLA/HA膜的PLLA侧与HA侧，在12孔板中共培养。细胞接种后先静置孵育2~3 h待细胞黏附，随后加入完整培养基继续培养。培养第3天，通过鬼笔环肽细胞骨架染色观察组织工程皮肤中细胞的附着与铺展状态。结果显示，HaCaT细胞在PLLA侧铺展良好，细胞形态饱满、边界清晰，呈铺展状排列；HDF在HA侧也形成密集、规则的分布，呈梭形或放射状排列，F肌动蛋白细胞骨架呈红色荧光，结构清晰、连续（图 3A）。结果说明双细胞组织工程皮肤模型的PLLA、HA膜表面均有良好的细胞黏附并铺展，支架可同时支持不同来源细胞的黏附与扩张。

图  3  PLLA/HA支架上构建的组织工程皮肤形态及细胞黏附增殖情况

Fig.  3  Morphology and cell adhesion/proliferation of tissue-engineered skin constructed on PLLA/HA scaffold

A: Phalloidin cytoskeleton staining of HaCaT cells on PLLA side (HaCaT-PLLA) of PLLA/HA membrane and HDF on the HA side (HDF-HA); B: Live/dead staining showing cell growth on PLLA and PLLA/HA membranes. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01. n=3, x±s. PLLA: Poly(L-lactic acid); HA: Hyaluronic acid; HDF: Human dermal fibroblast; MFI: Mean fluorescence intensity.

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为进一步验证HA引入是否促进细胞生长，将HaCaT细胞和HDF分别接种于PLLA膜和PLLA/HA膜的HA侧，培养至第3天后进行活/死细胞双染色。结果显示，PLLA/HA膜组接种HaCaT细胞与HDF后绿色荧光信号强，细胞密度高，状态饱满；而在PLLA膜组中，绿色荧光信号明显弱于PLLA/HA膜组（均P＜0.05，图 3B）。结果表明，HA的引入有助于改善支架表面生物环境，从而显著提升不同类型皮肤细胞的活性与增殖能力。

2.4   组织工程皮肤体外愈合效果分析

采用HaCaT细胞划痕实验模拟皮肤损伤模型，以评估不同条件对皮肤损伤修复的体外促进作用。结果显示，空白对照组划痕区域细胞迁移有限，间隙明显；PLLA/HA膜对照组中，划痕宽度缩小，表明PLLA/HA膜能够促进细胞向划痕区域迁移；组织工程皮肤模型组则表现出显著的促细胞生长作用，划痕区域接近闭合，边缘细胞排列紧密并呈拉伸状态（图 4A）。定量分析结果（图 4B）显示，PLLA/HA膜和组织工程皮肤模型均可促进划痕愈合，愈合率均高于空白对照组（P＜0.05、P＜0.01），并且组织工程皮肤模型组愈合率高于PLLA/HA膜对照组（P＜0.01）。结果提示，PLLA/HA膜本身可有效促进皮肤细胞迁移和划痕愈合，而PLLA/HA组织工程皮肤模型在划痕修复能力上表现更为优越。

图  4  PLLA/HA膜和TES模型对HaCaT细胞划痕愈合的促进作用

Fig.  4  Promotion effects of PLLA/HA membrane and TES model on HaCaT cell wound healing

A: Microscopic images of scratch wounds at 0 h and 24 h; B: Quantitative analysis of cell migration rate. ^*P < 0.05, ^**P < 0.01. n=3, x±s. PLLA: Poly(L-lactic acid); HA: Hyaluronic acid; TES: Tissue-engineered skin.

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3   讨论

新型生物材料在创面修复领域展现出广阔前景^[12]。PLLA因其良好的生物可降解性能被广泛应用于支架材料的制备，但其本身存在亲水性差、细胞黏附性和生物活性不足等局限性，影响其在复杂创面微环境中的进一步应用^[10]。本研究通过静电纺丝技术制备出结构均一的PLLA膜，并以HA浸涂对其进行改性处理，显著改善了其表面亲水性和细胞相容性，为后续组织工程皮肤构建提供了理想支架基础。

使用孵育24、48及72 h的PLLA/HA膜浸提液培养细胞，通过活/死细胞双染色实验发现，HaCaT细胞和HDF在PLLA/HA膜浸提液中形态完整、存活率高，与空白对照组相当，表明PLLA/HA膜对HaCaT细胞和HDF具有良好的生物相容性。这提示在短期及中期培养条件下，PLLA/HA膜不会释放对细胞有害的物质，整体生物相容性良好。直接接触培养及CCK-8实验结果进一步显示，随着培养时间延长，PLLA/HA膜对HaCaT细胞增殖的促进作用逐渐显现，在培养72 h时显著高于PLLA膜及对照组，而PLLA膜虽然也能促进细胞增殖，但促增殖作用低于PLLA/HA膜。上述结果表明，引入HA不仅改善了PLLA材料的表面性质和细胞附着环境，还能够在一定程度上增强其促进细胞生长的能力，从而为构建组织工程皮肤提供了更有利的材料基础。本研究结果与既往关于HA促进表皮细胞黏附和成纤维细胞增殖的报道^[13]一致，进一步印证了HA在构建功能性创面支架中的重要作用。

本研究利用PLLA/HA支架构建双细胞共培养组织工程皮肤模型，实现了HaCaT细胞与HDF分别在PLLA侧与HA侧的稳定贴壁及有序分布。鬼笔环肽细胞骨架染色结果显示，2种细胞均呈良好铺展状态，说明该结构设计具有良好的组织引导性及空间组织能力。同时，通过进一步比较单纯PLLA膜与PLLA/HA膜对细胞增殖的影响，发现HA改性处理的PLLA膜可显著增强细胞增殖活性，提示该支架对构建多层组织结构具有潜力。

值得关注的是，PLLA/HA组织工程皮肤在体外创面模型中的促愈合效果得到了验证。划痕实验显示，与空白对照组相比，PLLA/HA膜能够一定程度上促进HaCaT细胞向划痕区域迁移，而PLLA/HA组织工程皮肤的促进作用最为显著，不仅显著优于空白对照组，也明显高于PLLA/HA膜对照组。这一结果提示，基于复合支架构建的PLLA/HA组织工程皮肤不仅保持了良好的生物活性，还能够部分模拟真皮-表皮组织的协同修复功能，促进表皮细胞迁移和划痕闭合，为创面早期愈合提供了有利条件。

综上所述，本研究提出了一种表皮-真皮双层组织工程皮肤构建方案，验证了基于静电纺丝技术的PLLA/HA支架在组织工程皮肤构建中的可行性，并初步证实其在促进细胞黏附、生长及体外迁移修复中的潜力。后续研究中可进一步拓展该组织工程皮肤在复杂创面模型中的应用，例如模拟慢性溃疡、糖尿病足等难愈创面，并探讨其在免疫调控、血管生成等方面的生物学效应，为发展更高效、更智能的个体化皮肤修复策略奠定基础。