Interference elimination and method establishment of chlorhexidine acetate irrigation based on bacterial endotoxin test
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摘要:
目的 建立微量鲎试剂凝胶检查法检查醋酸氯己定冲洗剂细菌内毒素限度的方法。 方法 依照《中国药典》2020年版四部1143细菌内毒素检查法和9251细菌内毒素检查法应用指导原则，找到消除醋酸氯己定冲洗剂凝胶法干扰因素的方法，并建立细菌内毒素的微量鲎试剂凝胶检查法。 结果 确认用镁离子缓冲液对醋酸氯己定冲洗剂稀释2倍，再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍，可消除其对鲎试剂凝集反应的干扰，细菌内毒素限值为0.5 EU/mL，用λ0.06 EU/mL的鲎试剂进行检测。 结论 本实验建立的微量鲎试剂凝胶检查法操作简单、准确性高、重复性好，适用于醋酸氯己定冲洗剂的细菌内毒素限度的检查，可以作为醋酸氯己定冲洗剂生物检查法部分的质量控制方法。 -
关键词:
- 内毒素 /
- 微量鲎试剂凝胶检查法 /
- 镁离子缓冲液 /
- 醋酸氯己定冲洗剂 /
- 干扰
Abstract:Objective To establish a micro-Limulus amebocyte lysate (micro-LAL) gel clot test for determining bacterial endotoxin limit of chlorhexidine acetate irrigation. Methods According to the application guidelines of 1143 bacterial endotoxin test and 9251 guidelines for the application of bacterial endotoxin test in the Part Ⅳ of the Chinese pharmacopoeia (2020), a method to eliminate the interference factors of chlorhexidine acetate irrigation was found, and a micro-LAL gel clot test for bacterial endotoxin was established. Results It was confirmed that the interference to the agglutination reaction of Limulus reagent could be eliminated by diluting chlorhexidine acetate irrigation twice with magnesium ion buffer and then diluting it to 8 times with water for bacterial endotoxin test. The bacterial endotoxin limit was 0.5 EU/mL, detected with λ0.06 EU/mL micro-LAL. Conclusion The micro-LAL gel clot test established in this study is of simplicity, accuracy and high repeatability. It is applicable for the examination of bacterial endotoxin limit of chlorhexidine acetate irrigation, and can be used as a quality control method for the biological test of chlorhexidine acetate irrigation. -
醋酸氯己定冲洗剂是医用消毒液的一种，具有消毒、防腐的作用，用于创面消毒和伤口的冲洗，为我院院内制剂，批准文号为海制字（2022）B011004，现收录于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》2015年版（第一册）[1]。其主要药效成分为醋酸氯己定，为阳离子型表面活性防腐剂，通过改变细胞膜的通透性、吸附在细菌胞浆膜使细胞内容物漏出，从而发挥抗菌作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有一定的抗菌活性[2]。外用可高效、安全抗菌，能杀灭金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白念珠菌[3]。因此，基于灭菌生产工艺，在我院临床上广泛应用于创面的冲洗。
作为冲洗剂，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）规定“除另有规定外，冲洗剂应进行装量、无菌、细菌内毒素或热原检查”[4]。其中内毒素为革兰氏阴性菌细胞外壁的主要成分，可用来指示细菌的污染[5]。对此，我们已进行了方法学验证，并建立了完善的细菌内毒素凝胶检查法。内毒素凝胶检查法所用的鲎试剂因鲎资源日渐减少（2020年起升级为国家二级保护动物[6]），相关检测方法亟待改良。微量鲎试剂法[7-8]在确保凝胶法快速、有效特性和减少鲎试剂用量之间找到平衡点，相对容易开展工作。本研究针对醋酸氯己定冲洗剂在细菌内毒素检查中用稀释法消除干扰超出《中国药典》最高灵敏度限值的问题[9]，采用镁离子缓冲液稀释样品以消除干扰[10-12]，建立了符合《中国药典》规定的醋酸氯己定冲洗剂细菌内毒素微量鲎试剂凝胶检查法。
1 材料
1.1 仪器
ZH-2漩涡混合器（天津药典标准仪器厂），HWS12恒温水浴箱（上海一恒科学仪器有限公司），DHG-9247A电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），PN可调节移液枪[吉尔森实验仪器（上海）有限公司]，无内毒素试管（湛江安度斯生物有限公司）。
1.2 试剂和药品
醋酸氯己定冲洗剂，500 mL/袋，海军军医大学第二附属医院药剂科自制，批号为220727、220927、221116。鲎试剂（灵敏度λ为0.03 EU/mL、0.1 mL/支、批号2104012，λ为0.06 EU/mL、0.65 mL/支、批号2204202，湛江安度斯生物有限公司），鲎试剂（λ为0.06 EU/mL，0.1 mL/支，批号2105252，湛江博康海洋生物有限公司）。内毒素工作标准品（10 EU/支、批号2203020）、镁离子缓冲液（4 mL/支、批号2208030）、细菌内毒素检查用水（2 mL/支、批号2104080）为湛江安度斯生物有限公司产品，75%乙醇棉球为本实验室自制。
2 方法和结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核
2.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备
取内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%乙醇棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。用10 mL细菌内毒素检查用水分次溶解，逐步转移至试管中，用封口膜将瓶口严封，置旋涡混合器上混合15 min，制成1 EU/mL的内毒素标准液。然后用细菌内毒素检查用水逐级稀释，分别制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ共4个浓度的内毒素标准溶液，每步稀释的混匀时间为30 s。
2.1.2 待复核鲎试剂的准备
取λ为0.06 EU/mL、0.65 mL/支的鲎试剂2支，开启方法同2.1.1节，按标示装量加入细菌内毒素检查用水，使内容物充分溶解，避免产生气泡。取18支本试剂配套的8 mm×50 mm反应试管，排成5列，其中4列4支、1列2支，置于专用试管架上。其中的4列4支用不含内毒素配套枪头的移液枪加入0.05 mL已溶解的鲎试剂，每列各支分别加入0.05 mL 2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的内毒素标准溶液；另1列2支加入0.1 mL内毒素检查用水作为阴性对照（negative control，NC）。用封口膜封闭各管管口，轻轻振动混匀，连同试管架垂直放入（37±1）℃水浴锅中，保温（60±2）min。
分别取λ为0.06 EU/mL、0.1 mL/支的鲎试剂和λ为0.03 EU/mL、0.1 mL/支的鲎试剂各18支放在试管架上，开启方法同2.1.1节。每支加入0.1 mL细菌内毒素检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。后续操作方法同上。
2.1.3 实验结果
将试管架从水浴中轻轻取出，将每支试管缓缓倒转180°时管内凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。结果显示，鲎试剂灵敏度λc在0.25λ~2λ范围内，该批鲎试剂的灵敏度符合规定。
$$ \begin{aligned} & \;\;\;\;\;\;\;\;\lambda_{\mathrm{c}}=\lg ^{-1}\left(\sum X / 4\right)=\lg ^{-1}[(\lg 0.03+\lg 0.03+\lg 0.03+ \\ & \lg 0.03) / 4]=0.03\; \mathrm{EU} / \mathrm{mL} \end{aligned} $$ $$ \begin{aligned} & \;\;\;\;\;\;\;\;\lambda_{\mathrm{c}}=\lg ^{-1}\left(\sum X / 4\right)=\lg ^{-1}[(\lg 0.06+\lg 0.06+\lg 0.06+ \\ & \lg 0.06) / 4]=0.06 \;\mathrm{EU} / \mathrm{mL} \end{aligned} $$ 其中X为反应终点浓度的对数值（反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的溶液浓度）。
2.2 干扰实验预实验
2.2.1 供试品最大有效稀释倍数（maximum valid dilute double，MVD）
根据《中国药典》通则0128冲洗剂[4]，醋酸氯己定冲洗液的细菌内毒素理论限值（L）为0.5 EU/mL。MVD＝cL/λ（c为供试品浓度，λ为鲎试剂灵敏度），选用λ为0.03、0.06 EU/mL的鲎试剂，其对应的有效稀释倍数分别为0~16倍和0~8倍。
2.2.2 干扰预试验1
鲎试剂准备过程同2.1.2节。取2支加入细菌内毒素检查用水作为NC，2支加入2λ的内毒素标准溶液作为阳性对照（positive control，PC）。另每一稀释倍数下做2支供试品阴性对照（negative product control，NPC）和2支供试品阳性对照（positive product control，PPC），即用该浓度供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品制成2λ溶液。保温（60±2）min，观察并记录结果。
结果初步表明，用λ为0.03 EU/mL鲎试剂检测、醋酸氯己定冲洗剂用细菌内毒素检查用水进行16倍稀释时，对鲎试剂凝集反应无抑制作用（即无干扰），其他浓度均有抑制作用（存在干扰）。而用λ为0.06 EU/mL鲎试剂检测时，以细菌内毒素检查用水稀释2~8倍均无法排除干扰。
2.2.3 干扰预试验2
根据《中国药典》通则9251细菌内毒素检查法应用指导原则[9]：“若无法排除供试品对细菌内毒素检查的干扰作用，或只能使用最高灵敏度鲎试剂（凝胶法为0.03 EU/mL）才能排除干扰，则该品种不宜建立细菌内毒素检查项。”但是，醋酸氯己定冲洗剂的制剂批件剂型为“冲洗剂”，根据《中国药典》通则0128冲洗剂[4]，需要进行内毒素或热源检查，细菌内毒素检查凝胶法因其经济、高效的特点，成为无菌制剂内毒素检查的首选方法。《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法[13]中提到“可通过对供试品其他适宜方法（过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰”，本实验参考文献[10-11]尝试用镁离子缓冲液对供试品进行处理后再开展细菌内毒素检查。
实验准备过程同2.2.2节，选用λ为0.06 EU/mL、0.1 mL/支的鲎试剂，其对应的有效稀释倍数为2~8倍。结果初步表明，醋酸氯己定冲洗剂用镁离子缓冲液稀释2倍，再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍，对鲎试剂凝集反应无抑制作用（即无干扰）。
2.3 正式干扰试验（鲎试剂λ为0.06 EU/mL）
2.3.1 制备内毒素标准对照溶液（PC）
用细菌内毒素检查用水将内毒素工作标准品稀释成0.125、0.06、0.03、0.015 EU/mL共4个浓度的标准对照溶液。
2.3.2 制备含内毒素的PPC溶液
用镁离子缓冲液稀释2倍、再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍的醋酸氯己定冲洗剂，分别将内毒素工作标准品稀释成4个浓度（0.125、0.06、0.03、0.015 EU/mL）含内毒素的PPC溶液。
2.3.3 鲎试剂的准备
取λ为0.06 EU/mL、0.65 mL/支的鲎试剂4支。开启方法同2.1.1节，按标示装量加入细菌内毒素检查用水使内容物充分溶解，避免产生气泡。
2.3.4 加样
取18支本试剂配套的8 mm×50 mm反应试管，排成5列，其中4列4支、1列2支，置于专用试管架上。加样方法同2.1.2节，其中的4列4支每列各支分别加入0.05 mL 0.125、0.06、0.03、0.015 EU/mL的PC溶液，另1列2支加入0.05 mL内毒素检查用水作为NC。
另取18支配套试管放在试管架上，方法同上。其中的4列4支每列各支分别加入0.05 mL含0.125、0.06、0.03、0.015 EU/mL内毒素的PPC溶液，另1列2支加入0.05 mL的NPC溶液。
加样结束后用封口膜封闭各管管口，轻轻振动混匀，连同试管架垂直放入（37±1）℃水浴锅中，保温（60±2）min，观察并记录结果。结果显示，醋酸氯己定冲洗剂使用镁离子缓冲液稀释2倍，再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍后，对鲎试剂凝集反应无抑制作用（即无干扰）。
2.4 结果判断
$$ \begin{aligned} & \;\;\;\;\;\;\;\;E_s =\lg ^{-1}\left(\sum X_s / 4\right)=\lg ^{-1}[(\lg 0.06+\lg 0.06+\lg 0.06+ \\ & \lg 0.06) / 4] =0.06 \;\mathrm{EU} / \mathrm{mL} \end{aligned} $$ $$ \begin{aligned} & \;\;\;\;\;\;\;\;E_t=\lg ^{-1}\left(\sum X_t / 4\right)=\lg ^{-1}[(\lg 0.06+\lg 0.06+\lg 0.06+ \\ & \lg 0.06) / 4]=0.06 \;\mathrm{EU} / \mathrm{mL} \end{aligned} $$ 其中Es为细菌内毒素检查用水为溶媒组各反应终点浓度的对数值（E为内毒素浓度，s为标准液），Et为供试品溶液为溶媒组各反应终点浓度的对数值（t为测试液）。
Et在0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）范围内，说明醋酸氯己定冲洗剂使用镁离子缓冲液稀释2倍，再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍后不干扰实验，可用来进行细菌内毒素检查。
2.5 样品测定
取3批醋酸氯己定冲洗剂，按《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法[13]，采用2个厂家的鲎试剂（λ均为0.06 EU/mL）进行检测。
供试品溶液的制备：供试品为使用镁离子缓冲液稀释2倍，再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍的供试液。取与鲎试剂溶液等体积的供试品溶液加入鲎试剂的反应试管中，轻轻混匀，用封口膜封闭管口。
含内毒素的PPC溶液制备：取0.25 EU/mL的内毒素标准品溶液0.5 mL，加等体积使用镁离子缓冲液稀释2倍、再用细菌内毒素检查用水稀释4倍的醋酸氯己定冲洗剂稀释，混匀。取与鲎试剂溶液等体积的含内毒素的PPC溶液加入鲎试剂的反应管中，轻轻混匀，用封口膜封闭管口。
PC溶液的制备：取与鲎试剂溶液等体积的0.125 EU/mL内毒素标准品溶液，加入鲎试剂的反应管中，轻轻混匀，用封口膜封闭管口。
NC溶液的制备：取与鲎试剂溶液等体积的细菌内毒素检查用水，加入鲎试剂的反应试管中，轻轻混匀，用封口膜封闭管口。
加样结束，连同试管架垂直放入（37±1）℃水浴锅中，保温（60±2）min，观察并记录结果，结果见表 1。
表 1 样品测定试验结果批号 浓度/(EU·mL－1) 生产公司 醋酸氯己定冲洗剂 细菌内毒素检查 批号 稀释倍数 供试品1 供试品2 PC PPC NC 结果 2204202 0.06 湛江安度斯生物有限公司 220727 8 － － + + － 合格 220927 8 － － + + － 合格 221116 8 － － + + － 合格 2105252 0.06 湛江博康海洋生物有限公司 220727 8 － － + + － 合格 220927 8 － － + + － 合格 221116 8 － － + + － 合格 “－”：阴性；“＋”：阳性. PC：阳性对照；PPC：供试品阳性对照；NC：阴性对照. 3 讨论
细菌内毒素检查法是一种二价阳离子酶反应体系的检测方法，利用鲎试剂来检测灭菌制剂中革兰氏阴性菌产生的内毒素，凝胶法在检测结果判断中起主导作用。根据制剂剂型的不同，《中国药典》2020年版也作出了相应的限度要求。在内毒素检测方法学建立的过程中，供试品本身的干扰试验是排除假阴性结果的重要手段。在供试品本身不存在干扰的情况下，可以选择相应限值灵敏度或更高级灵敏度鲎试剂的方法直接进行实验。但通过预实验可知，本研究中的醋酸氯己定溶液对凝胶实验存在干扰。
干扰内毒素凝胶法检测结果的条件因素有pH、温度和孵育时间等[14]。在相对成熟的检测方法条件下，供试品本身的干扰需要通过一定的手段进行排除，供试品排除干扰的手段有倍比稀释、过滤、中和、透析、加热处理等[13]。最普遍采用、最便捷的方法是倍比稀释法。因为醋酸根离子与鲎试剂中保持鲎试剂灵敏度的必须物质单价离子和二价离子发生反应[15]，干扰了鲎试剂与内毒素的反应能力，而镁离子缓冲液中含有的离子可以饱和干扰物质的螯合反应，起到消除供试品干扰作用的目的。
根据本实验结果，醋酸氯己定冲洗剂细菌内毒素检查可用镁离子缓冲液稀释2倍、再用细菌内毒素检查用水稀释至8倍的稀释液，并用λ0.06 EU/mL的鲎试剂来进行。
本研究所建立的方法适用于我院自有制剂醋酸氯己定冲洗剂的细菌内毒素限度检查，可以作为其生物检查法部分的质量控制方法。本实验建立的微量鲎试剂凝胶检查法在消除供试品干扰因素的基础上，确保了检测方法操作简单、准确性高、重复性好，更达到了《中国药典》[9]的要求，为内毒素检查法中仅通过稀释法无法去除干扰的制剂而选用中和法消除干扰提供了参考。
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表 1 样品测定试验结果
批号 浓度/(EU·mL－1) 生产公司 醋酸氯己定冲洗剂 细菌内毒素检查 批号 稀释倍数 供试品1 供试品2 PC PPC NC 结果 2204202 0.06 湛江安度斯生物有限公司 220727 8 － － + + － 合格 220927 8 － － + + － 合格 221116 8 － － + + － 合格 2105252 0.06 湛江博康海洋生物有限公司 220727 8 － － + + － 合格 220927 8 － － + + － 合格 221116 8 － － + + － 合格 “－”：阴性；“＋”：阳性. PC：阳性对照；PPC：供试品阳性对照；NC：阴性对照. -
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