肾癌是常见的肾脏恶性肿瘤之一。2005－2020年，中国肾癌相关的年龄标化死亡率和年龄标化寿命损失率均呈下降趋势^[1]。但仍有15%的肾癌患者在初次诊断时被发现有远处转移，20%的患者在治疗过程中发生了远处转移^[2]。改善这一现状需要完善肾癌的早期诊断和对患者的预后预测，有赖于肾癌诊断及预后预测技术的进一步发展。本文分析讨论了病理学、影像学和血液学3种传统技术以及组学分析、液体活检2种新兴技术在肾癌诊断及预后中的进展及应用。

1   传统技术

1.1   病理学

肾癌外科手术或穿刺活检所获得的病理结果是肾癌诊断的金标准。不同类型的肾癌具有相对特异的组织学和细胞学形态。以常见的肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳头状细胞癌（papillary renal cell carcinoma，pRCC）、嫌色细胞癌（chromophobe renal cell carcinoma，chRCC）为例，ccRCC细胞体积较大，胞质富含脂质和糖原；pRCC Ⅰ型细胞体积较小、胞质稀疏、细胞核分级低；chRCC细胞呈大多边形、胞质网状、胞膜清晰^[3]。通过免疫组织化学检查，病理医师可以对存在争议的病理切片做出进一步判断。使用Fuhrman或WHO/国际泌尿病理学会（International Society of Urological Pathology，ISUP）核分级系统，病理医师可以预测ccRCC和pRCC患者预后；使用嫌色肿瘤分级系统，则可以评估chRCC患者预后。一项对11家医院3 108例转移性肾癌患者的回顾性研究显示，高WHO/ISUP分级的患者总生存期较低^[4]。包括机器学习、深度学习在内的人工智能（artificial intelligence，AI）则有望提高患者预后预测的准确性。Chen等^[5]构建了基于机器学习的病理组学特征模型，Cox回归分析显示该模型是ccRCC的独立预后因素；ROC曲线分析表明，该模型与肿瘤分期、分级联用预测ccRCC患者1、3、5、10年无病生存率的AUC分别达到了0.895、0.900、0.885、0.859。综上所述，病理学是肾癌诊断的关键技术，使用分级系统或与AI结合可预测肾癌预后。

1.2   影像学

影像学检查在肾癌的早期筛查和诊断中发挥着重要作用。近年来随着影像学检查使用增多，偶然发现的肾脏小肿块（small renal mass，SRM）发病率迅速上升。SRM良恶性难以准确鉴别，使得患者可能接受过度治疗，如肾部分切除术（partial nephrectomy，PN）等。一项回顾性研究纳入18 060例接受PN的患者，结果显示30.9%的患者术后病理诊断为良性，提示影像学对肿瘤诊断存在局限性^[6]。分子影像学、影像组学等技术的发展有望改善这一现状。Parihar等^[7]研究显示^99m锝-甲氧基异丁基异腈（^99mTc-sestamibi）SPECT/CT诊断非侵袭性病变的灵敏度和特异度分别为66.7%、89.5%，增强CT分别为10%、75%，表明^99mTc-sestamibi SPECT/CT区分良恶性肿瘤的效果优于增强CT。Uhlig等^[8]对94例T1期（＜7 cm）肾肿瘤患者的CT影像运用机器学习算法进行良恶性鉴定，结果显示，随机森林算法在AUC、灵敏度和特异度上表现均优于放射科医师。由此可见，传统影像学对肾癌的诊断仍存在一定局限，分子影像学和影像组学技术分别在影像拍摄质量、影像判读准确性两方面对其有所改善，有助于克服其局限性。

1.3   血液学

血液包括血细胞、血浆两部分。血细胞包括红细胞、血小板等。肖若陶等^[9]证实手术前高血小板数量和低血小板分布宽度与局部进展期肾癌的不良预后相关。血浆标志物可以用于癌症的诊断和预后预测。在胰腺癌、肝癌等恶性肿瘤的临床诊疗中，均有经临床验证的常用肿瘤标志物可辅助疾病诊断、疗效评估及预后监测，而肾癌领域目前尚未确立具有普适性且临床价值明确的特异性肿瘤标志物。一项纳入190例肾癌患者和190名对照个体的前瞻性研究发现，血浆肾损伤因子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）浓度与5年内罹患肾癌的风险密切相关，肾癌患者诊断前的KIM-1浓度升高与较高的死亡风险相关，提示KIM-1是潜在的肾癌血浆标志物^[10]。预后方面，纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，MSKCC）评分和国际肾癌数据联盟（International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium，IMDC）评分是目前最常用的晚期肾癌预后风险评估标准，纳入了血清钙、血红蛋白等血液学指标为危险因素。Lee等^[11]基于血浆标志物构建了复合生物标志物评分（composite biomarker scores，CBS），CBS得分高的晚期肾癌患者在仑伐替尼和依维莫司联合治疗中获益更多。综上所述，血液学指标对肾癌诊断及预后预测有帮助，但仍缺乏直接有效的血液学指标，有待于进一步探索。

2   组学分析技术

2.1   基因组学

基因组是特定组织或细胞内全部基因的总和。通过基因组学鉴定出的基因突变与肾癌的分类和预后具有密切相关性。在分类方面，2022年版WHO肾肿瘤病理分类中将分子特征定义的肾细胞癌作为独立的肾癌亚型^[12]。其中SDH缺陷型肾细胞癌为既往分类；SMARCB1缺陷型肾髓质癌、TFE3重排肾细胞癌、TFEB改变肾细胞癌、延胡索酸水合酶缺陷型肾细胞癌是基于既往分类的调整；ELOC（之前的TCEB1）突变型肾细胞癌、ALK重排肾细胞癌是新增的病理亚型^[13]。将分子特征纳入肾癌的分类标准凸显了肾癌的遗传异质性，对改善肾癌治疗效果、推动肾癌精准医疗具有重要意义。在预后方面，Wei等^[14]构建了一个由6个单核苷酸多态性特征组成的分类器用于预测ccRCC患者的预后，与临床数据结合后，在训练集、验证集、TCGA队列中AUC分别为0.811、0.776、0.808，表现出了良好的预测性能。综上可见，基因组学特征是肾癌分类标准之一，与肾癌的预后也密切相关。

2.2   表观基因组学

表观基因组学研究的是基因表观修饰对基因表达调控造成的遗传性变化。基因表观修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰等。发生在增强子或启动子的DNA甲基化与基因沉默相关，影响患者预后。Long等^[15]发现JAK3启动子低甲基化与JAK3表达量升高、免疫抑制性肿瘤微环境形成、ccRCC患者预后不良有关。组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化等翻译后修饰通过改变染色质结构调控基因的表达。Schoenfeld等^[16]发现，PBRM1缺失导致组蛋白H3的第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）程度显著升高，促进ALDH1A1表达和肾癌细胞增殖。单细胞染色质转座酶可及性高通量测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，scATAC-seq）是单细胞测序技术在表观遗传组学中的应用。相较于单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），scATAC-seq在非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）、转录因子等的研究中具有优势。Yu等^[17]借助scATAC-seq发现4个在ccRCC细胞中可及性特异的lncRNA，并选择其中2个lncRNA进行体外实验，验证了其促进ccRCC细胞侵袭和迁移的能力。由此可见，表观基因组主要通过发挥基因调控作用来影响肾癌的发展和患者的预后。

2.3   转录组学

转录组是特定组织或细胞在某一特定时期内全部转录本的总和。广义的转录组学包括编码RNA和ncRNA两部分，两者均在肾癌预后中发挥作用。Morgan等^[18]验证了细胞周期评分在预测局限性肾癌患者的疾病特异性死亡率方面的作用，并结合Karakiewicz评分构建了新的综合性评分，综合性评分为低风险和高风险的患者5年肿瘤特异性生存率分别为99%、84%。miRNA-532-5p^[19]、miRNA-452-5p^[20]、lncRNA-URRCC^[21]等ncRNA也与肾癌预后密切相关。scRNA-seq是单细胞测序技术在组学上的首个应用。相较于批量细胞RNA测序（bulk RNA-seq），scRNA-seq避免了细胞混杂所导致的均质化，更加精确地刻画了细胞间的异质性，提高了研究的特异度和灵敏度。Zhang等^[22]对ccRCC患者7个肿瘤组织和5个配对正常组织的scRNA-seq数据分析后，发现IRX3和6个细胞亚群与患者预后相关。空间转录组学在获取基因表达数据的同时保留了空间位置信息，进一步还原了细胞内基因表达的真实情况。Cao等^[23]基于5例肾癌患者的肿瘤核心和前沿区域的8个组织样品，使用Decoder-seq解析了肾癌的空间异质性，并构建了由27个基因组成的dEMT（dynamic epithelial-mesenchymal transition）评分，进一步研究发现dEMT评分高的患者预后差。综上所述，转录组学广泛应用于肾癌的预后预测，近年发展起来的scRNA-seq和空间转录组学改善了其细胞混杂性、空间信息缺失等问题，有助于提升预后预测模型的准确性。

2.4   蛋白质组学

蛋白质是一切生命的物质基础。由于存在蛋白质降解、翻译后修饰等情况，转录组学对蛋白质表达水平的预测能力有限。蛋白质组学可以更精准地刻画肾癌组织中蛋白质水平的变化。肾脏黏液样小管状和梭形细胞癌（mucinous tubular and spindle cell carcinoma，MTSCC）与1型pRCC在病理、免疫组织化学上十分类似。Xu等^[24]构建了一个由3种蛋白质（MZB1、VCAN和SOSTDC1）组成的分类器，该分类器对MTSCC与1型pRCC的鉴别诊断效果十分出色，AUC、灵敏度、特异度分别达到了0.984、100.0%、86.1%。在空间多组学时代，空间蛋白质组学应运而生。Schneider等^[25]使用空间多靶标分析系统发现颗粒酶B在ccRCC肿瘤外周表达量显著高于肿瘤中心，且肿瘤外周表达显著增高的患者预后更差，体现了其在肾癌内的空间异质性。综上所述，蛋白质组学揭露了不同的肾癌亚型、肾癌内部的蛋白质表达差异，有助于肾癌诊断和研究的进一步发展。

2.5   代谢组学

代谢组学是对特定时期组织、细胞内小分子量的代谢产物的表征和定量。作为基因组学等的最下游，代谢组学研究的内容与生物体表型更为接近，能够为上游组学的研究结果提供补充。Wang等^[26]对47例肾癌患者和50名健康对照个体的血清、尿液代谢物进行差异分析后，鉴定出4种潜在的血清代谢标志物（乳酸、甘油酸、尿酸、葡萄糖）和5种潜在的尿液代谢标志物（琥珀半醛、吡啶酸、焦谷氨酸、肌酸、马尿酸），9种代谢标志物区分肾癌患者和健康对照个体的AUC、准确度、灵敏度、特异度分别为0.996、96.7%、100%、93.3%，表现出了良好的性能。空间代谢组学是代谢组学与质谱成像技术的结合，为传统代谢组学补充了空间位置信息。Zhang等^[27]基于解吸电喷雾电离-质谱成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，DESI-MSI）谱图构建的模型区分正常样本、肾嗜酸细胞腺瘤、肾癌的准确度为100%，区分ccRCC、pRCC、chRCC的准确度为87.18%。由此可见，代谢组学可以用于肾癌诊断及预后预测标志物的探索，具有很大的应用前景。

2.6   微生物组学

人体皮肤表面及内部组织和体液中存在着大量的微生物。虽然微生物很少直接导致癌症的发生，但可能通过与宿主免疫系统的相互作用促进肿瘤的发生发展。泌尿系统中的微生物组近年来才得到发现和证实。Wang等^[28]研究发现，肾癌组织中的细菌多样性明显低于正常组织，微生物种群组成也发生了显著的变化；其中叶绿体纲（Chloroplast）和链藻目（Streptophyta）在肾癌组织中的相对丰度显著降低，对肾癌和正常组织有很好的区分作用，AUC分别达到了0.91、0.89。此外，其他部位菌群也与肾癌有关。Chen等^[29]比较了51例ccRCC患者和40名健康个体的肠道微生物组成，发现ccRCC患者中经黏液真杆菌属（Blautia）、链球菌属（Streptococcus）、扭链瘤胃球菌属（Ruminococcus torques）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）、霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）5个菌属相对丰度显著增加，预测ccRCC的AUC达到了0.933。Chen等^[29]还从粪便标本中分离出了巴黎链球菌（Streptococcus lutetiensis），通过体外实验证明其可以促进ccRCC细胞的增殖、迁移和侵袭。由此可见，微生物组学揭露了肾癌与多部位微生物间的相互作用关系，借此可以辅助肾癌的诊断及预后预测。

2.7   多组学

2.7.1   多组学用于组学特征描绘

2013年，TCGA数据库团队对超过400例ccRCC样本进行了多组学分析，首次描绘了ccRCC的多组学特征：最常见的体细胞拷贝数变化是3号染色体短臂（3p）丢失；显著突变的基因有19个，包括VHL、PBRM1等；广泛的DNA低甲基化与SETD2突变有关；PI3K/Akt通路多处变异；包括磷酸戊糖途径上调在内的代谢变化等特征^[30]。Long等^[31]整合了scRNA-seq和scATAC-seq数据，描述了ccRCC转录组和表观基因组特征。Qu等^[32]描绘了中国人群ccRCC蛋白质基因组特征。其他研究还分析了ccRCC的免疫微环境特征^[33]、肿瘤进展相关的基因组和免疫微环境特征^[34]、肿瘤异质性^[35-36]、延胡索酸水合酶缺陷型肾细胞癌^[37]、VHL综合征相关的ccRCC^[38]、MiT家族易位肾细胞癌^[39]等其他肾癌亚型的组学特征。组学特征描绘是多组学在肾癌诊断及预后预测中应用的基础，有助于人们建立起对肾癌分子层面的基本认识，为后续肾癌亚型分类、预后模型构建等研究提供了前提条件。

2.7.2   多组学用于肾癌亚型分类

单独使用血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）和联合使用免疫检查点阻断剂（immune checkpoint blockade，ICB）、血管内皮生长因子抑制剂是肾癌患者的两种治疗方案。Motzer等^[40]通过对823例接受舒尼替尼治疗和阿替利珠单抗与贝伐珠单抗联合治疗（atezolizumab+bevacizumab，A+B）的肾癌患者bulk RNA-seq数据使用无监督聚类方法处理，定义了7种肾癌亚型。7种肾癌亚型具有各自特异的血管生成、免疫、细胞周期、代谢、基质特征，并且与舒尼替尼和A+B两种治疗方法的临床疗效相关。其中高血管生成亚型患者接受两种方法治疗后预后均良好，高免疫、细胞周期亚型患者接受A+B治疗效果更好。多组学分析显示，PBRM1和KDM5C的体细胞突变与血管生成、AMPK/脂肪酸氧化基因表达升高等相关，而CDKN2A/B和TP53基因改变与细胞周期、代谢相关基因表达量增加相关。包含肉瘤成分的肾癌表现出低血管生成、高免疫表达等特征，为其在A+B治疗中展现出良好疗效提供了可能的生物学解释。此外，基于胰岛素样生长因子轴调节基因^[41]、N7-甲基鸟苷调节基因^[42]、免疫相关基因^[43-46]、肿瘤血管生成特征基因^[47]等定义的肾癌亚型，也表现出了良好的肾癌预后预测能力。

2.7.3   多组学用于预后模型构建

预后模型是对多组学特征的进一步整合，或是对肾癌亚型的进一步差异分析，可以简便地预测患者预后。Zhang等^[48]对115例接受过舒尼替尼治疗的ccRCC患者的样本进行多组学测序，并综合临床特征、蛋白质组学特征、突变特征、拷贝数改变特征、转录组特征构建了用于预测TKI治疗疗效的多组学分类器。多组学分类器在训练集和测试集中AUC分别达到了0.86、0.98，而单组学分类器在训练集和测试集中AUC均为0.85，表明多组学分类器明显优于单组学分类器。Gui等^[49]分析了缺氧和免疫相关基因的多组学差异，使用LASSO回归和Cox回归构建了多组学分类器。Singh等^[50]整合转录组和基因组甲基化数据构建了pRCC分期预测模型。此外，在PRMTScore（protein arginine methylation-related prognostic signature）^[51]、glyScore（glycolysis score）^[52]、PGES（polyamine gene expression score）^[53]等预后模型的构建过程中，多组学分析也发挥了重要作用。

2.7.4   多组学用于标志物鉴定

Wu等^[54]对25例ccRCC患者进行scRNA-seq、scATAC-seq、bulk RNA-seq和蛋白质组学测序联合分析，发现了20个特异性标志物，其中铜蓝蛋白酶（ceruloplasmin，CP）与肿瘤分级、总生存期明显相关，具有重要的诊断和预后价值；空间转录组学和CP敲低细胞系实验表明CP与基质透明化有关，scATAC-seq和Krüppel样因子（Krüppel-like factor，KLF）9敲低细胞系实验显示KLF9是CP的转录调控因子。借助scRNA-seq，Tan等^[55]观察到ccRCC细胞中脂肪生成相关基因上调，进一步通过bulk RNA-seq发现趋化素（chemerin）是ccRCC生物学中关键的候选脂肪因子，并且较高的趋化素与ccRCC患者不良预后相关。通过联合scRNA-seq、bulk RNA-seq、体外实验等方法，Tan等^[55]发现VHL突变导致低氧诱导因子2α、KLF6失调并影响趋化素表达，趋化素抑制脂肪酸氧化，进而阻碍铁死亡发生并维持肿瘤细胞增殖。此外，多项研究通过多组学分析还发现了SERPINE2^[56]、NDUFA4L^[57]、PDHB^[58]、PTEN^[59]、RBCK1^[60]、PFKFB4^[61]等基因对肾癌具有预后价值，是潜在的肾癌预后标志物。

2.7.5   多组学用于分子机制探索

Zheng等^[62]整合分析了来自不同研究团队的ccRCC患者和正常对照个体的scRNA-seq、scATAC-seq、bulk RNA-seq、空间转录组数据，发现在bulk RNA-seq中两者的激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）表达量没有明显差异，而在scRNA-seq中肾脏近端小管（proximal tubule，PT）细胞中AP-1表达明显缺失，这可能与bulk RNA-seq的混杂效应相关；空间转录组学分析表明，与ccRCC标志物碳酸酐酶Ⅸ相比，AP-1的表达范围更广；scATAC-seq结果中，包括PT细胞在内的各类细胞均可以观察到AP-1的染色质可及性，表明AP-1在PT细胞中的转录降低可能受后续转录修饰的影响。此外，也有研究报道了SETD2^[63-64]、VHL^[65-66]、SLC7A11^[67]、CXCL14^[68]等在肾癌中的预后价值和分子机制。

综上，多组学分析已在肾癌诊断及预后预测的多个层次中得到了广泛应用。与单组学分析相比，多组学分析的优势体现在以下三个方面：其一，基于多组学分析构建的模型性能更好，例如Zhang等^[48]构建的多组学分类器性能显著优于单组学分类器；其二，多组学能够基于单组学结果进一步展开分析，例如Motzer等^[40]分析了由转录组学差异定义的7种肾癌亚型间的其他组学差异；其三，通过多组学分析得到的结论可靠程度更高，例如Zheng等^[62]的研究中采用多组学规避了单一组学可能对AP-1造成的错误认识。充分挖掘并发挥多组学维度覆盖与数据整合方面的优势，有助于肾癌诊断及预后预测技术的进一步发展。

3   液体活检技术

液体活检技术指的是对患者血液、尿液、脑脊液等体液进行分子检测，检测的分子可以分为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和外泌体（exosome）3种。ctDNA是起源于肿瘤细胞的游离于细胞外的DNA（cell-free DNA，cf-DNA）。Lasseter等^[69]分析了40例转移性肾癌患者血液cfDNA变异情况，在11例患者的cfDNA中鉴定出已知的肾癌突变基因，进一步研究显示cfDNA变异频率与治疗反应相关。CTC是原发灶或转移灶肿瘤细胞被动脱落或经内渗进入血液中的肿瘤细胞。Bootsma等^[70]收集了104例患者的457份血液样本，研究发现，CTC计数处于四分位数最高部分的患者总生存期明显下降；接受ICB治疗的患者HP比值（人类白细胞抗原Ⅰ表达量与程序性死亡配体1表达量的比值）随时间下降，借此可判断ICB的疗效，若患者经ICB治疗后HP比值没有下降，则说明疗效较差。外泌体是细胞外囊泡的一种，参与肿瘤血管生成、免疫微环境等环节。外泌体的双层膜结构保护了其内mRNA、miRNA的稳定性，使其成为潜在的标志物。Xue等^[71]研究发现，相较于局灶性ccRCC患者，进展期ccRCC患者血清中细胞外囊泡来源的hsa-miRNA-320d明显升高，提示该标志物有助于识别ccRCC的复发和转移。表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技术是一种基于局域等离子增强效应的光谱分析技术，可以通过比较不同样品分子中化学键振动峰值鉴别样品分子的组成差异。Qian等^[72]基于血清中细胞外囊泡的SERS特征峰差异，构建了RCC诊断模型，该模型的准确度、灵敏度、特异度分别为78.7%、77.0%、80.5%。综上所述，作为一种非侵入性检测技术，液体活检技术可以辅助肾癌的诊断及预后预测，进一步开展大规模的临床研究有望挖掘出更有价值的标志物。

4   局限性和展望

以转录组学为代表的组学分析技术和液体活检技术作为新的肾癌诊断及预后预测技术，近年来得到了广泛的关注和研究。与传统肾癌诊断及预后预测技术相比，新技术尚存在一定的局限性，未能在临床中广泛应用。首先，一些研究存在原始队列样本量较小、缺乏分子实验和动物实验验证等情况，导致研究结论的普适性、可信度较低。其次，包括空间组学等在内的技术成熟度较低，影像组学也存在泛化能力差、可重复性低、可解释性差等问题。最后，包含生物标志物的预后模型应用到临床中条件十分严格，需要确保足够高的灵敏度和特异度，并通过多中心的独立验证达成专家共识。现有技术的组合在一定程度上可以改善当前困境，例如术前多种影像技术的联合使用有助于提高SRM的良性鉴定率、多组学整合分析有助于提高模型的性能。但肾癌诊断及预后预测技术的进一步发展是解决问题的关键。未来随着技术的发展和研究质量的提高，肾癌诊断及预后预测相关的研究成果有望更多地应用于临床实践中，进而助力实现更早期的肾癌诊断与更精准的预后评估。