Aptamer-based biosensors: research progress
-
摘要: 生物传感器是一类以生物分子作为识别元件，将分析物与生物分子间的相互作用转化为可识别的光、电等信号的传感器设备。适配体是能够与靶分子高亲和力和高特异性结合的单链寡核苷酸序列，具有稳定性高、批次间差异小、易进行化学修饰的优点，在生物传感器中的应用越来越广泛。本文主要介绍了将适配体作为光学、电化学、压电生物传感器的识别元件用于检测小分子化合物、病毒、抗原等分析物的研究进展，并对适配体生物传感器的应用情况进行总结。Abstract: Biosensors are sensors that use biomolecules as recognition elements and convert the interaction between analytes and biomolecules into optical, electrical and other identifiable signals. Aptamers are single-stranded oligonucleotide sequences that can bind to target molecules with high affinity and specificity. They offer high stability, minimal batch-to-batch variation, and ease of chemical modification, and have therefore found increasingly widespread use in biosensor development. This review focuses on the research progress of optical, electrochemical and piezoelectric biosensor using aptamers as recognition elements in the detection of small molecular compounds, viruses, antigens and other analytes, and summarizes the application of aptamer-based biosensors.
-
Keywords:
- aptamer /
- biosensor /
- recognition elements /
- detection technology
-
生物传感器是指使用生物分子来检测具有生物学意义或生物活性物质的传感器，它的检测原理是将分析物和传感器之间相互作用产生的生化信息转化为可识别的分析信号，属于化学传感器中的一类[1]。生物传感器的操作简单，对操作人员技能要求不高，并且具有小型化、便携化的优势，已成为药物监测、农业和环境检测系统、食品工业和生物防御等领域中广泛使用的分析和诊断工具。生物传感器的核心元件是生物识别元件和换能元件。生物识别元件是识别和结合目标分析物产生可测量信号的生物实体，一般使用抗体、酶、适配体及分子印迹聚合物等；换能元件是将生物分子间的相互作用转化为可量化的信号转导元件，根据检测原理可以分为电化学、光学和压电生物传感器[2]。
适配体（aptamer）是一段较短的单链寡核苷酸序列（DNA或RNA），并且具有不同的三维结构，可以与细胞、蛋白质、小分子化合物等靶分子特异性结合[3]。适配体主要是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）产生[4]。SELEX方法是将靶分子与事先合成的含有1014~1016个随机单链寡核苷酸序列库一起孵育，分离与靶分子结合的寡核苷酸序列后通过PCR扩增形成新的次一级文库，用次一级文库重复孵育及扩增，对多次重复筛选后得到的高特异性和亲和力的序列进行富集和测序，并检测与靶分子的亲和作用[3]。
适配体与靶分子之间空间结构匹配的结合方式与抗体和抗原的结合方式类似，通过范德华力、氢键、静电吸附、形状互补性与靶分子高亲和力和高特异性地结合[5]。因此，适配体也被称为“化学抗体”，已被研究用于替代或补充抗体。抗体具有高特异性及高亲和力的优点，长期在生物实验中发挥关键作用，并且已经广泛应用于临床诊断和治疗中，但是抗体的批次间差异大、稳定性差、对运输和储存条件要求高，会直接影响实验结果的重现性[6-7]。与抗体相比，适配体不仅具有高特异性和高亲和力的优点，而且因为采用化学合成的方式生产筛选出的序列，批次间差异极小，在化学合成的过程中可以按实际需要在序列的不同部位加入化学修饰，稳定性好，对运输和储存的要求也不高[8-9]。基于以上优点，适配体已逐渐应用在生物传感器中，用于环境监测、食品安全、临床诊断等领域。
适配体生物传感器将生物分子之间的生物反应转化为信号变化通过2个步骤完成，即在识别元件上产生信号和由转换元件转变为可检测的信号。在识别元件上产生信号的原理可以分为4类：直接检测法、三明治法、竞争检测法、构象变化法。直接检测法是将适配体直接固定在识别元件表面，待测分子流过识别元件表面与适配体结合产生信号（图 1A）；三明治法是将第1种适配体固定于识别元件表面，流过待测分子与之结合后再流过第2种适配体，通过与待测分子再结合带来信号改变（图 1B）；竞争检测法是将已经结合的2条适配体固定于识别元件表面，待测分子与其中1条适配体竞争结合产生信号变化（图 1C）；构象变化法是将带有荧光标记的适配体直接固定于识别元件表面，流过待测分子与适配体结合后，适配体构象发生变化，导致荧光标记发出荧光的条件改变从而产生信号变化（图 1D）。之后，可以通过不同的转换器将识别元件上信号的改变转化为光信号、电信号，根据信号转换原理的不同将适配体生物传感器分为光学、电化学、压电生物传感器等3种[10]。本文对基于适配体的各类生物传感器在不同检测手段和检测范围的最新进展作一介绍。
图 1 适配体生物传感器识别原理示意图A: 直接检测法; B: 三明治法; C: 竞争检测法; D: 构象变化法.
下载:
全尺寸图片
1 适配体光学生物传感器
光学生物传感器通过光场与生物识别元件之间的相互作用，将识别元件上与待测物浓度成比例的化学信号转变为光信号，再用相应的检测设备将信号转化为可以读取的数值。目前常见的光学生物传感可以大致分为基于标记和无标记2种模式。基于标记的传感是在使用标记分子后通过比色、荧光或发光方法生成光信号，需要注意的是标记分子与分析物结合后可能会对分析物的性质产生影响，并影响最终的分析结果。在无标记模式下，检测到的信号是由分析物与换能器的相互作用直接产生的，比如表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器[11]。
1.1 比色传感器
比色传感器是一种利用传感器表面颜色变化进行检测的生物传感器，将传感器表面检测物的浓度变化转化为颜色变化，通过人眼或者简单的光学仪器即可得到结果。由于具有检测手段简单、设备便携、检测速度快的特点，比色传感器在商业化和实际应用中有很大优势，并且通过新技术的应用进一步提高了检测的灵敏度，包括在识别元件中使用金纳米粒子、磁性纳米粒子、氧化石墨烯和共轭聚合物[12]。
Mishra等[13]开发了一种基于纳米磁珠的适配体竞争检测法用于溶菌酶（lysozyme，Lys）定量检测。该检测法利用偶联了Lys的磁珠与游离Lys同生物素化适配体的竞争结合，碱性磷酸酯酶标记的链霉亲和素与生物素化适配体结合后根据光密度值计算Lys的结合百分比。实验结果表明，Lys的线性范围为5~140 nmol/L，检测限为10 nmol/L，具有良好的选择性和稳定性，用于检测葡萄酒样品中的Lys时回收率为99.00%~99.27%。
利用带正电荷的金纳米粒子[(+)gold nanoparticle，(+)AuNP]可以提高光学响应的灵敏度，如Qi等[14]用(+)AuNP构建了一种快速检测真实环境样品和农产品中啶虫脒的比色传感器。将(+)AuNP作为信号探针，不同构象的适配体以不同的方式与(+)AuNP相互作用会直接导致(+)AuNP颜色不同。(+)AuNP对目标的反应是直接和敏感的，不需要传统方法的盐诱导过程，并且适配体与靶标之间的亲和作用是在一个隔离优化的系统中进行的，不受外界干扰。该比色传感器灵敏度高，啶虫脒在低至75 nmol/L浓度时仍可于数分钟内引起(+)AuNP肉眼可观察到的颜色变化。该比色传感器的检测限为0.56 nmol/L，比带负电荷的金纳米粒子系统低约1个数量级，也远低于其他比色方法。此外，适配体识别的高特异性使该比色传感器对真实环境样品中单组分啶虫脒的检测具有高选择性，复杂真实样品中的单一啶虫脒可直接检测。与标准HPLC方法相比，比色分析的检测方法具有优良的准确性、可靠性，样品前处理简单，也不需要专业的色谱分离。
纳米粒子等新技术及适配体的应用提高了比色传感器的特异性和灵敏度，可以更准确地在实际应用时检出复杂基质中的目标分子，未来可以配合简单的检测仪器现场进行定量检测及对多种成分的同时检出。
1.2 荧光传感器
荧光传感器是将荧光物质以标记或非标记的方式与检测物结合后，通过检测识别元件上的荧光物质产生的荧光信号反映分析物浓度等信息，信号检测可以针对荧光强度、衰减率、光谱特性和荧光各向异性单一或多个方面进行，这类传感器具有简单快速、多目标、原位检测、灵敏度高等优势[15]。而荧光适配体传感器可以将荧光物质标记在适配体序列中，利用适配体与待测物结合后构象变化或者位移变化导致的荧光恢复或猝灭，实现对待测物浓度的检测。
Jia等[16]使用四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）标记的适配体构建了检测黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的新型荧光适配体传感器。TAMRA适配体通过范德华力吸附在金属有机框架（UiO-66-NH2）表面，在电荷由荧光染料TAMRA向UiO-66-NH2金属离子转移后荧光猝灭。将目标分子AFB1引入后，TAMRA适配体与AFB1结合形成内部环结构的复合物并从UiO-66-NH2表面脱离，吸附亲和力降低导致荧光恢复，可根据荧光信号的变化来分析AFB1的含量。该测定法对0~180 ng/mL AFB1表现出高灵敏度，在0~0.5 ng/mL和1.5~3.0 ng/mL的范围内线性关系良好，检测限低至0.35 ng/mL，对其他常见真菌毒素检测后证明特异性好。目前，该适配体/金属有机框架传感平台已用于检测玉米、大米和牛奶等真实食品样品中的AFB1含量。
Shirani等[17]设计了一种纳米探针用于监测人体血浆中小分子的荧光纳米适配体传感器。该传感器以石墨氮化碳纳米片为荧光探针，探针与适配体/金纳米粒子缀合物产生相互作用后荧光强度降低；加入分析物后，随着适配体与分析物的相互作用和盐造成的金纳米粒子聚集，石墨氮化碳纳米片的荧光恢复。在地高辛的浓度为10~500 ng/L范围内时，该传感器荧光信号与地高辛浓度呈线性关系，检测限为3.2 ng/L，并且成功用于真实血浆样品的检测。
Cui等[18]开发了一种基于氧化石墨烯和G-四链体/N-甲基间卟啉Ⅸ（N-methyl mesoporphyrin Ⅸ，NMM）的无标记、低背景荧光生物传感器，并完成了对牛奶样品中卡那霉素的检测。他们设计了一个包含卡那霉素适配体序列和富含鸟嘌呤（guanine，G）序列的集成探针，并将集成探针和NMM均吸附在氧化石墨烯上，使传感器处于低背景信号。NMM是一种对G-四链体结构具有选择性的荧光分子，其荧光信号在游离状态下较弱，但结合G-四链体后显著增强。在检测过程中，适配体序列先与卡那霉素结合，并发送构象转变，形成适配体-卡那霉素复合物。同时，在钾离子的作用下，富G序列折叠成G-四链体结构并与NMM特异性结合，形成G-四链体/NMM复合物。在两种复合物的协同效应下，产生了三维位阻效应，两种配合物的新型集成探针从氧化石墨烯表面释放，产生强荧光信号。该传感器对卡那霉素的检测范围为1~400 nmol/L，检测限为0.60 nmol/L，并成功应用于生牛奶样品的分析，回收率为98.33%~101.25%，并且对卡那霉素也有很高的选择性。
荧光生物传感器需要将荧光标记加入适配体、探针或者待测物中，可能造成它们结构的改变，仍然需要研究能够降低荧光标记对被标记分子影响的检测方法。
1.3 SPR传感器
SPR是一种光学现象，当入射光以一定入射角和波长射入2种不同折射率的金属介质表面时，引起金属表面自由电子共振并吸收能量使反射光在一定角度内减弱，此时入射光的角度被称作SPR角。SPR角随着表面介质折射率的变化而改变，表面介质的折射率因为生物分子附着发生微小变化，通过检测反射光的变化就可以得到表面介质上生物分子的质量[19]。SPR传感器具有实时监测、高灵敏度和特异性、无需标记的特点。
Wang等[20]以四环素作为模型，结合适配体技术和DNA纳米结构开发了一种可以直接检测分析物浓度的SPR适配体传感器。将抗四环素适配体（Apt76）固定在具有“金字塔”结构的DNA四面体的顶部并将四面体底部固定在芯片表面，以实现Apt76的定向固定，减少了空间位阻对结合过程的影响，比单链Apt76更易与四环素发生相互作用，提高了SPR适配体传感器的灵敏度。该传感器已用于多个蜂蜜样品中四环素的检测，回收率为80.20%~114.3%，并且对四环素具有高特异性，其检测限（6.9 ng/kg）比使用单链Apt76固定在识别元件上的适配体传感器低10倍。
除了直接检测分析物的方法，基于SPR适配体生物传感器的间接检测法可以对禽流感H5Nx全病毒进行检测[21]。筛选发现适配体IF10和IF22能同时结合H5N1病毒，并证实它们结合在H5N1全病毒的不同位点。将IF10和IF22分别结合在金芯片和金纳米粒子上之后，通过三明治法进行H5N1全病毒的检测，该检测方法可快速、准确地检测H5N1全病毒感染的粪便样本，最低检测浓度为200 EID50/mL（EID50为半数鸡胚感染剂量，50% egg infective dose）。
SPR适配体传感器可以实现对小分子和大分子的检测，无需标记，样品处理简单，可以快速、准确地进行检测。
1.4 倏逝波光纤传感器
倏逝波是光在波导和折射率较低的周围介质界面发生全内反射时从界面延伸到较低折射率的介质中产生的电磁场，而倏逝波光纤传感器就是由光纤内产生的倏逝波激发光纤表面分子上的荧光标记发出信号，从而检测光纤表面分子的变化情况[22]。倏逝波光纤传感器具有易于小型化、高灵敏度及选择性、适用分析物范围广的特点。
Zhu等[23]开发了一种基于分离适配体（split aptamer，SPA）的倏逝波荧光生物传感器，利用三明治法检测链霉素（streptomycin，STR）。该传感器的STR标准校准曲线的检测限为33 nmol/L，线性范围为60~526 nmol/L，对STR的选择性高于另外5种常见抗生素，并且可重复使用至少100次。在对实际水样的测量中，STR的回收率为79.2%~96.8%。此外，该传感器操作简单，无需烦琐的预处理，单个样品的检测可在5 min内完成，同时也没有引入任何额外的寡核苷酸或辅助材料，在开发针对环境监测中其他小分子污染物的简单、灵敏和低成本的生物传感器方面具有潜力。
利用靶分子诱导的适配体构象变化也可以建立倏逝波光学生物传感平台，Tang等[24]利用适配体两步结构转换建立了用于可卡因检测的适配体传感器。可卡因适配体被分成2个片段（即荧光团探针和猝灭剂探针），其中荧光团探针与固定在光纤表面的寡核苷酸探针杂交并诱导光纤表面的倏逝波激活荧光，但可卡因会与这2个片段迅速形成三向连接，1个片段的荧光基团被另1个片段的猝灭基团有效猝灭，所检测到荧光信号的减少与可卡因浓度成一定比例。该传感器的检测周期约为450 s（孵育300 s，检测和再生150 s），并且至少可以完成40次循环检测，检测限为165.2 nmol/L，检测人血清样品时无需复杂的预处理，回收率、精密度和准确度均良好。
2 适配体电化学生物传感器
电化学传感器可以检测电极表面待测物反应产生的电信号，并将与待测物浓度成比例关系的电信号转化为电流、电压等信息，从检测技术来说主要包括电位、电流、阻抗传感器[25-26]。电化学传感器的优势在于将简单、廉价的电子设备进行集成，适合改造为便携的快速检测传感器设备[25]。
Jolly等[27]将适配体嵌入到分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）支架中，形成优于单一识别特性的混合受体，用于构建定量分析前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）的电化学传感器，用电化学阻抗谱测量PSA与混合受体重新结合所致电极/电解质界面处的电容变化。该传感器显示出高灵敏度和选择性，线性范围为0.1~100 ng/mL，检测限为1 pg/mL，表现出与同源蛋白（人激肽释放酶2）的低交叉反应性和对人血清白蛋白的低反应性，但是尚缺少临床样本的验证。Raouafi等[28]使用功能化石墨烯修饰的碳丝网印刷电极作为转导表面，利用适配体识别的PSA同与适配体杂交的DNA链之间的竞争过程，构建了一种用于检测PSA的一次性电位电流适配体传感器。该传感器在0.001~100 ng/mL范围内可以选择性和特异性检测PSA，检测限为0.064 pg/mL，并成功用于加标人血清样本的检测。
利用适配体构象可以通过靶分子诱导变化的特点，Wang等[29]将亚甲蓝标签标记在适配体特定位点上，构建了可以快速、无试剂、灵敏检测AFB1的适配体电化学传感器，可用于检测复杂样品中的AFB1。该传感器对金电极和亚甲蓝氧化还原标签之间电子转移效率的变化进行检测，加入AFB1后与固定化的适配体结合引起电子转移效率变化，而适配体中特定位点标记后会产生灵敏的信号响应。
Dabhade等[30]利用银纳米粒子放大信号，将适配体与银纳米粒子偶联后修饰在丝网印刷碳电极表面，开发了能够选择性检测大肠杆菌的电化学生物传感器。该生物传感器具有灵敏度高、重复性好、不需要预处理的特点，检测限为150 CFU/mL。由于适配体能够在较大范围的pH值和温度下保持稳定，并且丝网印刷碳电极使仪器体积更小，便于携带，所以该传感器更适合用于现场实时检测细菌。
Hamdi等[31]设计了一种以适配体为生物受体的混合MIP探针，使用金纳米粒子和碳纳米纤维包覆的共价有机骨架材料增加适配体的稳定性，提高了传感器的选择性和灵敏度，可用于具有超灵敏检测能力和定量分析的电化学传感器中检测肌氨酸。制备传感器的主要步骤如下：首先在玻碳电极上固定金纳米粒子，随后将金纳米粒子修饰的碳纳米纤维包覆的共价有机骨架材料涂层置于电极上，最后将肌氨酸适配体复合物连接在修饰电极表面，并在其表面电聚合多巴胺后去除肌氨酸，得到纳米杂化适配体。该生物传感器检测范围为0.5~50 pmol/L、50~350 pmol/L，检测限为0.166 pmol/L，并成功实现了对尿液样品的检测。
除了对单一样品检测以外，适配体电化学传感器也可以对混合样品同时检测。Liu等[32]开发了一种简单、廉价的方法来制作适配体修饰的多重纸基电化学传感器，用3种不同的适配体对传感器修饰后可以分别特异性识别出目标物乙酰芬太尼、3, 4-甲基二氧吡咯戊酮和腺苷，在所有方面都可与使用传统金盘电极开发的、基于适配体的电化学传感器相媲美，并且可以量化尿液和唾液等生物样品中的小分子混合物，电极之间没有测量到任何串扰，该传感器体积小、价格低，还可以在此基础上制造出更多的电极以实现复杂样品中多种成分的检测。
增强适配体和待测物之间的特异性结合可以提高在各种复杂基质中检测的灵敏度、准确度。通过适配体识别苯丙氨酸和铑基受体之间的超分子复合物，可以建立检测血液中苯丙氨酸水平的电化学传感器[33]，研究者将已有报道的DNA适配体序列截短，诱导结合待测物发生构象改变，将适配体固定到电极上并使用亚甲蓝氧化还原报告分子修饰3'端，从设计的3个截短方案中筛选出响应最强的结构用于电位传感器，该传感器的有效检测范围为0.09~7 μmol/L，对于稀释1 000倍的血液样品可在数分钟内准确测量其苯丙氨酸水平，无需校准。
电化学适配体生物传感器成本低、简单、便携、灵敏度高、检测范围广，已经可以实现对复杂样品的快速检测及多成分的同时检测。
3 适配体压电生物传感器
压电效应是指某种材料在受到机械挤压时能够产生电压，而以相反的方式将电压施加到压电材料表面则会引起机械挤压或振荡，各向异性晶体（即没有对称中心的晶体，如磷酸铝、氮化铝、氧化锌、石英、聚偏二氟乙烯等）是典型的具有压电性的材料[34]。压电传感器的原理就是由2个电极在晶体表面上施加交流电压，引起晶体的机械振荡，之后将晶体放入振荡电路检测振荡频率[35]。当生物分子结合在晶体上电极表面时，振荡频率的变化与质量的变化成比例，通过检测振荡频率变化得到晶体表面生物分子的质量变化[36]。
Yuan等[37]开发了一种用于检测亚砷酸盐的压电适配体传感器。首先在石英晶体微天平生物传感器的镀金石英晶体芯片上制备巯基乙胺的自组装单分子层（self-assembled monolayer，SAM），将亚砷酸盐适配体固定在金纳米粒子的表面形成适配体-金纳米粒子复合物。加入待测物亚砷酸盐时，亚砷酸盐首先与芯片表面上的SAM结合，之后再加入适配体-金纳米粒子复合物，形成SAM-亚砷酸盐-适配体的三明治结构，放大生物传感器的响应频率，提高对亚砷酸盐检测的特异性。该传感器可以检测8~1 000 nmol/L范围内的亚砷酸盐，检测限为4.4 nmol/L，并且可以用于实际样品的检测。Tian等[38]采用这种三明治检测方法，同样使用石英晶体微天平生物传感器得到冈田酸的线性检测范围为0.5~200 nmol/L，检测限为0.32 nmol/L，并成功检测了贻贝样品中的冈田酸。
压电适配体传感器也可以检测大分子，将磁珠/适配体/聚腺苷酸DNA的三明治型复合物与连接多通道串联压电石英晶体系统金叉指电极的检测平台相结合，建立了一种选择性检测铜绿假单胞菌的新方法[39]。磁珠是固定铜绿假单胞菌适配体的载体，聚腺苷酸化DNA延伸的DNA链与适配体部分互补结合，由于铜绿假单胞菌与其适配体之间的特异性相互作用，聚腺苷酸化DNA可被铜绿假单胞菌取代，溶液中的聚腺苷酸化DNA通过腺嘌呤和金叉指电极之间的强相互作用被吸附到金叉指电极表面，并导致多通道串联压电石英晶体传感器频移响应。该方法可以特异性检测铜绿假单胞菌，在缓冲液和模拟血液样本中的检测限分别为9和52 CFU/mL。
压电适配体传感器虽然响应灵敏、操作简便、成本低，但芯片材料选择有限，在实际应用中限制较大，提高检测灵敏度、准确度的研究较少。
不同类别生物传感器的检测方法对比见表 1。
表 1 适配体生物传感器检测方法对比类别 特征 检测方法 目标分子 检测范围 检测限 文献 光学传感器 比色传感器 仪器简单、反应快、成本低、灵敏度高、可视性 竞争法
直接检测法溶菌酶
啶虫脒5~140 nmol·L-1
8.7~920 nmol·L-110 nmol·L-1
0.56 nmol·L-1[13]
[14]荧光传感器 便携、灵敏度高、反应快、原位检测 TICC 黄曲霉毒素B1 0~0.5 ng·mL-1、1.5~3.0 ng·mL-1 0.35 ng·mL-1 [16] TID 地高辛 10~500 ng·L-1 3.2 ng·L-1 [17] TICC 卡那霉素 1~400 nmol·L-1 0.60 nmol·L-1 [18] SPR传感器 实时动态监测、高灵敏度、高特异性、无标签 直接检测法
三明治法四环素
H5N10.01~1 000 μg·kg－1
103~105 EID50·mL-16.9 ng·kg－1
200 EID50·mL-1[20]
[21]倏逝波光纤传感器 仪器简单、灵敏度高、分析物范围广 三明治法 链霉素 60~526 nmol·L-1 33 nmol·L-1 [23] TID 可卡因 0.2~200 μmol·L-1 165.2 nmol·L-1 [24] 电化学传感器 仪器简单、反应迅速、成本低、灵敏度高、可重复使用、实时分析 直接检测法
竞争法
TID前列腺特异性抗原
前列腺特异性抗原
黄曲霉毒素B10.1~100 ng·mL-1
0.001~100 ng·mL-1
0.008~3 μmol·L-11 pg·mL-1
0.064 pg·mL-1
6 pmol·L-1[27]
[28]
[29]直接检测法 大肠杆菌 NA 150 CFU·mL-1 [30] 直接检测法 肌氨酸 0.5~50 pmol·L-1、50~350 pmol·L-1 0.166 pmol·L-1 [31] 直接检测法 乙酰芬太尼；3, 4-甲基二氧吡咯戊酮；腺苷 0.5~15 μmol·L-1；0.1~10 μmol·L-1；1~200 μmol·L-1 0.5 μmol·L-1；0.1 μmol·L-1；1 μmol·L-1 [32] TID 苯丙氨酸 0.09~7 μmol·L-1 NA [33] 压电传感器 灵敏度高、操作简单、成本低 三明治法
三明治法亚砷酸盐
冈田酸8~1 000 nmol·L-1
0.5~200 nmol·L-14.4 nmol·L-1
0.32 nmol·L-1[37]
[38]三明治法 铜绿假单胞菌 81~8.1×105 CFU·mL-1 9 CFU·mL-1(缓冲液中)、52 CFU·mL-1
(模拟血液样本中)[39] NA：原文未提供. SPR：表面等离子共振；TICC：目标分子诱导的适配体构象改变法；TID：目标分子诱导的适配体位移法；EID50：半数鸡胚感染剂量；CFU：菌落形成单位. 4 结语
随着石墨烯、纳米材料等新型材料的不断出现和技术的发展，生物传感器作为一类灵敏、操作简单、检测时间相对较短并且具有小型化优势的检测元件，在环境监测、食品安全、临床诊断等领域已有较多的研究和应用。适配体和靶分子的结合过程与抗体和抗原的结合过程类似，并且具有稳定性好、批次间差异小、容易进行化学修饰的优点，在生物传感器的识别元件中有补充或逐步取代抗体的趋势。对本文中提及的不同类别生物传感器的检测方法进行对比（表 1）后发现，虽然光学、电化学、压电生物传感器的检测原理不同，但是最终信号都是由芯片上的化学信号转变而来，因此在增强信号的方法上有相通之处，目前采用了扩大芯片与适配体的接触面积、通过框架固定适配体的方向、将适配体与分子量更大的物质结合等手段增强检测信号，提高了检测的灵敏度和特异性，从而实现复杂样品中目标分子的检测。其中电化学和光学生物传感器由于操作简单、易小型化、灵敏、高效的优势应用较为广泛，压电传感器由于芯片材料选择较少、发展尚未成熟目前应用较少。随着对适配体的结构和功能研究的深入，将出现更多针对不同靶分子的适配体并实现大规模生产，以适配体为识别分子的生物传感器应用将更为广泛。
-
图 1 适配体生物传感器识别原理示意图
A: 直接检测法; B: 三明治法; C: 竞争检测法; D: 构象变化法.
下载:
全尺寸图片
表 1 适配体生物传感器检测方法对比
类别 特征 检测方法 目标分子 检测范围 检测限 文献 光学传感器 比色传感器 仪器简单、反应快、成本低、灵敏度高、可视性 竞争法
直接检测法溶菌酶
啶虫脒5~140 nmol·L-1
8.7~920 nmol·L-110 nmol·L-1
0.56 nmol·L-1[13]
[14]荧光传感器 便携、灵敏度高、反应快、原位检测 TICC 黄曲霉毒素B1 0~0.5 ng·mL-1、1.5~3.0 ng·mL-1 0.35 ng·mL-1 [16] TID 地高辛 10~500 ng·L-1 3.2 ng·L-1 [17] TICC 卡那霉素 1~400 nmol·L-1 0.60 nmol·L-1 [18] SPR传感器 实时动态监测、高灵敏度、高特异性、无标签 直接检测法
三明治法四环素
H5N10.01~1 000 μg·kg－1
103~105 EID50·mL-16.9 ng·kg－1
200 EID50·mL-1[20]
[21]倏逝波光纤传感器 仪器简单、灵敏度高、分析物范围广 三明治法 链霉素 60~526 nmol·L-1 33 nmol·L-1 [23] TID 可卡因 0.2~200 μmol·L-1 165.2 nmol·L-1 [24] 电化学传感器 仪器简单、反应迅速、成本低、灵敏度高、可重复使用、实时分析 直接检测法
竞争法
TID前列腺特异性抗原
前列腺特异性抗原
黄曲霉毒素B10.1~100 ng·mL-1
0.001~100 ng·mL-1
0.008~3 μmol·L-11 pg·mL-1
0.064 pg·mL-1
6 pmol·L-1[27]
[28]
[29]直接检测法 大肠杆菌 NA 150 CFU·mL-1 [30] 直接检测法 肌氨酸 0.5~50 pmol·L-1、50~350 pmol·L-1 0.166 pmol·L-1 [31] 直接检测法 乙酰芬太尼；3, 4-甲基二氧吡咯戊酮；腺苷 0.5~15 μmol·L-1；0.1~10 μmol·L-1；1~200 μmol·L-1 0.5 μmol·L-1；0.1 μmol·L-1；1 μmol·L-1 [32] TID 苯丙氨酸 0.09~7 μmol·L-1 NA [33] 压电传感器 灵敏度高、操作简单、成本低 三明治法
三明治法亚砷酸盐
冈田酸8~1 000 nmol·L-1
0.5~200 nmol·L-14.4 nmol·L-1
0.32 nmol·L-1[37]
[38]三明治法 铜绿假单胞菌 81~8.1×105 CFU·mL-1 9 CFU·mL-1(缓冲液中)、52 CFU·mL-1
(模拟血液样本中)[39] NA：原文未提供. SPR：表面等离子共振；TICC：目标分子诱导的适配体构象改变法；TID：目标分子诱导的适配体位移法；EID50：半数鸡胚感染剂量；CFU：菌落形成单位. -
[1] STETTER J R, PENROSE W R, YAO S. Sensors, chemical sensors, electrochemical sensors, and ECS[J]. J Electrochem Soc, 2003, 150(2):S11. DOI: 10.1149/1.1539051. [2] CHADHA U, BHARDWAJ P, AGARWAL R, et al. Recent progress and growth in biosensors technology: a critical review[J]. J Ind Eng Chem, 2022, 109: 21-51. DOI: 10.1016/j.jiec.2022.02.010. [3] ZHANG Y, LAI B S, JUHAS M. Recent advances in aptamer discovery and applications[J]. Molecules, 2019, 24(5): 941. DOI: 10.3390/molecules24050941. [4] RÖTHLISBERGER P, HOLLENSTEIN M. Aptamer chemistry[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2018, 134: 3-21. DOI: 10.1016/j.addr.2018.04.007. [5] SUN H, ZU Y. A highlight of recent advances in aptamer technology and its application[J]. Molecules, 2015, 20(7): 11959-11980. DOI: 10.3390/molecules200711959. [6] BAKER M. Reproducibility crisis: blame it on the antibodies[J]. Nature, 2015, 521(7552): 274-276. DOI: 10.1038/521274a. [7] WELLER M G. Quality issues of research antibodies[J]. Anal Chem Insights, 2016, 11: 21-27. DOI: 10.4137/ACI.S31614. [8] BAUER M, STROM M, HAMMOND D S, et al. Anything you can do, I can do better: can aptamers replace antibodies in clinical diagnostic applications?[J]. Molecules, 2019, 24(23): 4377. DOI: 10.3390/molecules24234377. [9] WANG T, CHEN C, LARCHER L M, et al. Three decades of nucleic acid aptamer technologies: lessons learned, progress and opportunities on aptamer development[J]. Biotechnol Adv, 2019, 37(1): 28-50. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2018.11.001. [10] JUSTINO C I L, DUARTE A C, ROCHA-SANTOS T A P. Critical overview on the application of sensors and biosensors for clinical analysis[J]. Trends Analyt Chem, 2016, 85: 36-60. DOI: 10.1016/j.trac.2016.04.004. [11] DAMBORSKÝ P, ŠVITEL J, KATRLÍK J. Optical biosensors[J]. Essays Biochem, 2016, 60(1): 91-100. DOI: 10.1042/ebc20150010. [12] SONG Y, WEI W, QU X. Colorimetric biosensing using smart materials[J]. Adv Mater, 2011, 23(37): 4215-4236. DOI: 10.1002/adma.201101853. [13] MISHRA R K, HAYAT A, MISHRA G K, et al. A novel colorimetric competitive aptamer assay for lysozyme detection based on superparamagnetic nanobeads[J]. Talanta, 2017, 165: 436-441. DOI: 10.1016/j.talanta.2016.12.083. [14] QI Y, CHEN Y, XIU F R, et al. An aptamer-based colorimetric sensing of acetamiprid in environmental samples: convenience, sensitivity and practicability[J]. Sens Actuat B Chem, 2020, 304: 127359. DOI: 10.1016/j.snb.2019.127359. [15] HONG L, PAN M, XIE X, et al. Aptamer-based fluorescent biosensor for the rapid and sensitive detection of allergens in food matrices[J]. Foods, 2021, 10(11): 2598. DOI: 10.3390/foods10112598. [16] JIA Y, ZHOU G, WANG X, et al. A metal-organic framework/aptamer system as a fluorescent biosensor for determination of aflatoxin B1 in food samples[J]. Talanta, 2020, 219: 121342. DOI: 10.1016/j.talanta.2020.121342. [17] SHIRANI M, KALANTARI H, KHODAYAR M J, et al. A novel strategy for detection of small molecules based on aptamer/gold nanoparticles/graphitic carbon nitride nanosheets as fluorescent biosensor[J]. Talanta, 2020, 219: 121235. DOI: 10.1016/j.talanta.2020.121235. [18] CUI W, HU C, ZHU R, et al. Low-background fluorescent biosensor based on graphene oxide and aptamer biorecognition for sensitive detection of kanamycin[J]. J Food Compos Anal, 2024, 131: 106261. DOI: 10.1016/j.jfca.2024.106261. [19] NGUYEN H H, PARK J, KANG S, et al. Surface plasmon resonance: a versatile technique for biosensor applications[J]. Sensors, 2015, 15(5): 10481-10510. DOI: 10.3390/s150510481. [20] WANG S, DONG Y, LIANG X. Development of a SPR aptasensor containing oriented aptamer for direct capture and detection of tetracycline in multiple honey samples[J]. Biosens Bioelectron, 2018, 109: 1-7. DOI: 10.1016/j.bios.2018.02.051. [21] NGUYEN V T, SEO H B, KIM B C, et al. Highly sensitive sandwich-type SPR based detection of whole H5Nx viruses using a pair of aptamers[J]. Biosens Bioelectron, 2016, 86: 293-300. DOI: 10.1016/j.bios.2016.06.064. [22] TAITT C R, ANDERSON G P, LIGLER F S. Evanescent wave fluorescence biosensors: advances of the last decade[J]. Biosens Bioelectron, 2016, 76: 103-112. DOI: 10.1016/j.bios.2015.07.040. [23] ZHU Q, LIU L, WANG R, et al. A split aptamer (SPA)-based sandwich-type biosensor for facile and rapid detection of streptomycin[J]. J Hazard Mater, 2021, 403: 123941. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2020.123941. [24] TANG Y, LONG F, GU C, et al. Reusable split-aptamer-based biosensor for rapid detection of cocaine in serum by using an all-fiber evanescent wave optical biosensing platform[J]. Anal Chim Acta, 2016, 933: 182-188. DOI: 10.1016/j.aca.2016.05.021. [25] HAMMOND J L, FORMISANO N, ESTRELA P, et al. Electrochemical biosensors and nanobiosensors[J]. Essays Biochem, 2016, 60(1): 69-80. DOI: 10.1042/EBC20150008. [26] KIMMEL D W, LEBLANC G, MESCHIEVITZ M E, et al. Electrochemical sensors and biosensors[J]. Anal Chem, 2012, 84(2): 685-707. DOI: 10.1021/ac202878q. [27] JOLLY P, TAMBOLI V, HARNIMAN R L, et al. Aptamer-MIP hybrid receptor for highly sensitive electrochemical detection of prostate specific antigen[J]. Biosens Bioelectron, 2016, 75: 188-195. DOI: 10.1016/j.bios.2015.08.043. [28] RAOUAFI A, SÁNCHEZ A, RAOUAFI N, et al. Electrochemical aptamer-based bioplatform for ultrasensitive detection of prostate specific antigen[J]. Sens Actuat B Chem, 2019, 297: 126762. DOI: 10.1016/j.snb.2019.126762. [29] WANG C, ZHAO Q. A reagentless electrochemical sensor for aflatoxin B1 with sensitive signal-on responses using aptamer with methylene blue label at specific internal thymine[J]. Biosens Bioelectron, 2020, 167: 112478. DOI: 10.1016/j.bios.2020.112478. [30] DABHADE A H, VERMA R P, PARAMASIVAN B, et al. Development of silver nanoparticles and aptamer conjugated biosensor for rapid detection of E. coli in a water sample[J]. 3 Biotech, 2023, 13(7): 244. DOI: 10.1007/s13205-023-03663-3. [31] HAMDI F, ROUSHANI M, HOSEINI S J. Novel biosensor for sarcosine detection in prostate cancer: combining molecular imprinted polymer and aptamer strategies[J]. Microchem J, 2025, 208: 112429. DOI: 10.1016/j.microc.2024.112429. [32] LIU Y, ALKHAMIS O, LIU X, et al. Aptamer-integrated multianalyte-detecting paper electrochemical device[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2021, 13(15): 17330-17339. DOI: 10.1021/acsami.1c01822. [33] IDILI A, PAROLO C, ORTEGA G, et al. Calibration-free measurement of phenylalanine levels in the blood using an electrochemical aptamer-based sensor suitable for point-of-care applications[J]. ACS Sens, 2019, 4(12): 3227-3233. DOI: 10.1021/acssensors.9b01703. [34] POHANKA M. Overview of piezoelectric biosensors, immunosensors and DNA sensors and their applications[J]. Materials (Basel), 2018, 11(3): 448. DOI: 10.3390/ma11030448. [35] GARCÍA-MARTINEZ G, BUSTABAD E A, PERROT H, et al. Development of a mass sensitive quartz crystal microbalance (QCM)-based DNA biosensor using a 50 MHz electronic oscillator circuit[J]. Sensors, 2011, 11(8): 7656-7664. DOI: 10.3390/s110807656. [36] POHANKA M. The piezoelectric biosensors: principles and applications, a review[J]. Int J Electrochem Sci, 2017, 12(1): 496-506. DOI: 10.20964/2017.01.44. [37] YUAN M, ZHANG Q, SONG Z, et al. Piezoelectric arsenite aptasensor based on the use of a self-assembled mercaptoethylamine monolayer and gold nanoparticles[J]. Mikrochim Acta, 2019, 186(5): 268. DOI: 10.1007/s00604-019-3373-1. [38] TIAN Y, ZHU P, CHEN Y, et al. Piezoelectric aptasensor with gold nanoparticle amplification for the label-free detection of okadaic acid[J]. Sens Actuat B Chem, 2021, 346: 130446. DOI: 10.1016/j.snb.2021.130446. [39] SHI X, ZHANG J, HE F. A new aptamer/polyadenylated DNA interdigitated gold electrode piezoelectric sensor for rapid detection of Pseudomonas aeruginosa[J]. Biosens Bioelectron, 2019, 132: 224-229. DOI: 10.1016/j.bios.2019.02.053.
