冠心病是冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血、缺氧或坏死而出现胸痛、胸闷等不适的一类心脏病，是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一^[1]。我国冠心病死亡率近年来呈上升趋势，其中急性心肌梗死死亡率从2005年开始呈快速上升趋势，并且城乡居民相关住院费用持续增加^[2]，给社会和家庭带来了沉重的负担。在中医学中，冠心病与“胸痹”“心痛”“真心痛”等关系紧密，也是属于严重危害人类健康的多发病^[3]。目前该病的发病机制尚未完全阐明，致病因素较多。鉴于这些情况，开发一种缓解冠心病的有效药物至关重要。

脉通君安汤(Maitong Jun’an decoction，MTJA)是孙永宁教授基于临床经验而创立的方剂，在冠心病治疗的临床实践中显示出一定优势^[4]。MTJA由11味中药组成，黄芪与当归相配为君药，党参、瓜蒌、赤芍、川芎为臣药，白术、桃仁、红花、地龙为佐药，生甘草为使药。该方剂融合了中医经典补阳还五汤和瓜蒌薤白半夏汤的精髓，并经过加减优化而成。其中，补阳还五汤注重益气活血、化瘀通络，瓜蒌薤白半夏汤则擅长理气宽胸、通阳泄浊，这两个方剂的结合既能补益气血、增强心功能，又能化瘀通络、改善血液循环，从而达到治疗冠心病的目的。

现代药理学研究证实，黄芪中的黄芪甲苷能够改善内皮细胞功能，减轻大鼠的心肌损伤，降低心肌细胞凋亡率，对心脏有保护作用^[5-6]。基础研究表明，补阳还五汤能够增加糖尿病下肢动脉硬化闭塞症大鼠缺血下肢内皮祖细胞的数量，促进缺血下肢的血管生成^[7]，还可降低炎症因子的表达，影响IL-17信号通路，抑制心肌纤维化^[8];瓜蒌薤白半夏汤能够改善缺血性心肌损伤大鼠心功能，减轻心肌病理损伤，改善内皮细胞功能，促进心肌微血管生成^[9]，改善高脂血症大鼠的脂质积聚^[10]。

由于中药药物成分复杂、靶点多、疗效信号途径宽等特质，对中药的深入研究具有较大的挑战性。网络药理学是基于系统生物学理论、生物系统网络分析、多靶点药物分子设计的一门新兴学科，中药方剂的特点与网络药理学的完整性、系统性、全面性相契合，通过网络药理学能很好地进行中药方剂药理机制的研究^[11-12]。因此，本研究拟借助网络药理学、分子对接技术和动物实验探索MTJA治疗冠心病的相关靶点、通路和作用机制，以期为后续研究及临床应用提供参考。

1   材料和方法

1.1   网络药理学研究

1.1.1   药材成分靶点收集

通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP;https://www.tcmsp-e.com/)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和药物相似性(drug likeness，DL)≥0.18作为筛选条件，筛选出生黄芪、当归、党参、白术、川芎、桃仁、红花、赤芍、全瓜蒌、生甘草的活性成分，收集靶蛋白，并经UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)校正;结合参考文献筛选地龙的活性成分^[13-14]，并采用化合物靶点预测平台(SwissTargetPrediction，http://www.swisstargetprediction.ch/)预测其活性成分的靶点，选择可能性大于0的靶点作为其活性成分的作用靶点。将从上述数据库收集的靶蛋白合并后删除重复项，获得药物活性成分可能的作用靶点。

1.1.2   疾病基因获取

以“myocardial infarction”和“heart failure”为关键词在以下数据库搜集冠心病疾病中的心肌梗死和心力衰竭相关基因。(1)DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)，筛选标准：score_gda＞0.1。(2)GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，筛选标准：relevance score＞10。(3)人类孟德尔遗传联机系统(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库(https://omim.org/)。将上述数据库收集的基因合并后删除重复项获得疾病相关基因。

1.1.3   药材-成分-靶点-疾病网络构建

将疾病靶点和药物活性成分靶点取交集获得药物活性成分治疗疾病的交集基因。从药物的数据中选取对应的数据，得到数据关系网络，导入Cytoscape 3.7.2软件得出网络图。

1.1.4   蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建

将交集靶点数据集导入STRING数据库(https://string-db.org/)，选择物种为Homo sapiens，设置minimum required interaction score为0.4，将获得的数据文件导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络可视化，利用CytoNCA插件进行网络拓扑结构分析。

1.1.5   基因和通路富集分析

使用R 4.3.3软件中的ClusterProfiler和org.Hs.eg.Db包进行交集靶点的基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。

1.2   分子对接

从PubChem数据库下载配体的三维结构。通过SYBYL-X 2.0软件进行分子优化，在优化过程中，采用Tripos力场和Gasteiger-Hückel电荷计算方法，将最大迭代次数设置为10 000，能量梯度收敛阈值设为0.05 kcal·mol^－1·nm^－1(1 kcal＝4.184 kJ)。对于未明确指出的参数，采用软件的默认值。从RCSB蛋白质结构数据库(RCSB Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/)获取受体的三维结构。为了确保分子对接结果的准确性，使用mgltools_win32_1.5.6软件对受体进行修复和预处理，包括去除水分子、金属离子等非必要组分。在对接过程中，使用AutoDock Vina 1.1.2软件评估配体与受体之间的亲和力。利用Pymol软件生成分子对接数据的可视化图形。

1.3   动物实验

1.3.1   动物与药材

SPF级健康雄性大鼠30只，5~6周龄，体重100~200 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2022-0009]。所有大鼠均在SPF级环境饲养，温度18~25 ℃，相对湿度40%~45%。在实验期间，大鼠自由摄食、饮水。所有动物实验均严格遵照上海中医药大学动物保护与伦理委员会批准的动物使用规程操作(伦理审查批准号：PZSHUTCM2308080004)。

MTJA所需药材黄芪60 g(批号：20231008-2)、当归6 g(批号：20230819-1)、党参12 g(批号：20230907-1)、炒白术9 g(批号：20230920-1)、炒瓜蒌子6 g(批号：20230823-1)、炒瓜蒌皮6 g(批号：20230830-1)、桃仁6 g(批号：20230913-1)、红花3 g(批号：20230728-1)、川芎6 g(批号：20230810-1)、赤芍6 g(批号：20230908-1)、地龙6 g(批号：20230901-2)、甘草3 g(批号：20230729-2)均购于上海万仕诚药业有限公司，将药材用水浸泡1 h，加水煎煮3次，每次6倍量水，武火煮沸后改成文火煮60 min，合并煎液，过滤取汁，浓缩至含生药2.3 g/mL，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.2   大鼠心肌梗死模型构建

大鼠适应性喂养7 d后，采用抽签法随机分为假手术组、模型组和MTJA组，每组10只。将模型组和MTJA组大鼠的冠状动脉左前降支进行结扎(术前禁食12 h)，以制备大鼠心肌梗死模型;假手术组大鼠只穿线不结扎。大鼠全身麻醉状态下，仰卧位固定于鼠板上，脱毛备皮，行气管插管术，以小动物呼吸机维持呼吸，随后用手术剪在心前区位置处剪开皮肤(长约3 cm)，用镊子钝性分离皮下肌肉，拉钩扩大手术视野，暴露心脏，在左心耳下方用6-0可吸收性外科缝合线对冠状动脉左前降支进行结扎。成模标准为结扎部位以下心肌即刻变白、心脏搏动减弱且心电图表现为ST段弓背抬高。术后连续3 d肌内注射0.2 mL青霉素钠溶液抗感染。各组大鼠造模成功后第2天开始进行药物干预。参考《医学实验动物学》^[15]计算治疗剂量，MTJA组给予生药量23 g•kg^－1•d^－1，每日灌胃1次，连续灌胃给药28 d;模型组、假手术组灌胃等体积生理盐水。最后一次给药结束后将大鼠安乐死，取心肌组织保存待测。

1.3.3   H-E染色法观察大鼠心脏组织学变化

使用10%多聚甲醛溶液将心肌组织块4 ℃固定72 h，常规石蜡包埋并制成厚5 μm的组织切片。切片经过二甲苯、梯度乙醇脱蜡后用苏木精染色10 min，蒸馏水消掉浮色后用1%盐酸乙醇分化30 s，温水冲洗后用伊红复染5 min。后梯度乙醇脱水、二甲苯透明及中性树脂封片，在光学显微镜下观察。

1.3.4   蛋白质印迹法检测IL-6和IL-1β蛋白表达水平

将各组大鼠心尖组织从液氮中取出，经裂解、研磨、离心取上清液进行蛋白浓度测定，然后经电泳、转膜、封闭、孵育一抗和二抗、显色等步骤后，使用凝胶成像分析系统进行曝光、拍照，用ImageJ软件对图像进行灰度分析。所用试剂和抗体均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.4   统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s描述，组间比较使用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。检验水准(α)为0.05。

2   结果

2.1   药材-成分-靶点-疾病网络

在TCMSP数据库中以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件筛选获得10种中药材的165个成分和278个靶点;结合文献，检索到地龙成分5个、靶点94个。合并上述数据后，共获得MTJA的170个成分和362个靶点。通过DisGeNET数据库检索并筛选出与心肌梗死相关的基因472个，利用GeneCards数据库检索并筛选到与心肌梗死相关的基因374个，从OMIM数据库获取了与心肌梗死相关的基因16个，将上述数据合并，剔除重复项后得到与心肌梗死相关的基因673个。通过DisGeNET数据库检索并筛选出与心力衰竭相关的基因312个，利用GeneCards数据库检索并筛选出与心力衰竭相关的基因1 391个，从OMIM数据库中获取了与心力衰竭相关的基因182个，将上述数据合并，剔除重复项后得到与心力衰竭相关的基因1 559个。将获得的成分靶点映射至疾病基因中获得了83个交集基因。将疾病相关基因以及药材的成分靶点导入软件，构建了药材-成分-靶点-疾病网络，结果显示该网络有264个节点、1 193条相互关系，依照度值排名得到关键成分为槲皮素(quercetin，MOL000098)、山柰酚(kaempferol，MOL000422)、木犀草素(luteolin，MOL000006)等(图 1)。

图  1  脉通君安汤治疗冠心病的药材-成分-靶点-疾病网络

Fig.  1  "Medicine-composition-target-disease" network of Maitong Jun'an decoction in treating coronary heart disease

The concave quadrilaterals represent traditional Chinese medicine, the hexagons represent the corresponding components of each traditional Chinese medicine, and the circles represent the intersection of targets of traditional Chinese medicine components and disease targets. GC: Gancao (Glycyrrhiza); DL: Dilong (Pheretima aspergillum); DG: Danggui (Angelicae sinensis radix); BZ: Baizhu (Largehead atractylodes rhizoma); DS: Dangshen (Codonopsis radix); TR: Taoren (Semen persicae); HH: Honghua (Carthami flos); GL: Gualou (Fructus trichosanthis); HQ: Huangqi (Astragali radix); CX: Chuanxiong (Chuanxiong rhizoma); CS: Chishao (Paeoniae radix rubra).

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2.2   PPI网络构建

将共同靶点数据集导入STRING数据库构建PPI网络，该网络有83个相关靶点、1 513条相互关系。依照度值排序，识别出网络中最为关键的3个靶点，分别为IL-6、IL-1β和Akt1。这些靶点在网络中有较高的度值，意味着它们与其他靶点之间存在较多的相互作用(图 2)。

图  2  脉通君安汤治疗冠心病相关靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络

Fig.  2  Protein-protein interaction network of Maitong Jun'an decoction in treating coronary heart disease

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2.3   GO和KEGG富集分析

GO富集分析揭示了2 320种生物过程，包括细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应、对营养水平的反应、活性氧代谢过程、对氧气水平的反应等;95种细胞成分，包括膜筏、膜微区、膜区域、小窝、质膜筏等;143种分子功能，包括蛋白酶结合、细胞因子活性、磷酸酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合等(图 3A)。KEGG通路富集分析得到154条重要通路，显著通路包括脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product，AGE)-晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、弓形虫病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等(图 3B)。

图  3  脉通君安汤治疗冠心病相关靶点的GO(A)和KEGG(B)富集分析

Fig.  3  GO (A) and KEGG (B) enrichment analyses for targets of Maitong Jun'an decoction in treating coronary heart disease

GO: Gene Ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; BP: Biological process; CC: Cellular component; MF: Molecular function; AGE: Advanced glycation end product; RAGE: Receptor for advanced glycation end product; IL: Interleukin; TNF: Tumor necrosis factor.

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2.4   分子对接结果

分子对接结果显示，关键靶点IL-6、IL-1β和Akt1与MTJA主要活性成分槲皮素和山柰酚结合较好，结合能均小于－5 kcal/mol(图 4)。

图  4  脉通君安汤治疗冠心病的药物靶点与作用蛋白对接模式图(整体图与对接细节图)

Fig.  4  Docking mode diagram of drug target and acting protein (overall diagram and docking detail diagram) of Maitong Jun'an decoction in treating coronary heart disease

IL: Interleukin; Akt1: Protein kinase B 1.

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2.5   大鼠心脏组织学变化及相关蛋白表达

H-E染色结果显示，假手术组大鼠心脏组织结构完整，心肌细胞排列规则均匀，无明显炎症细胞浸润和坏死;与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织受损，细胞结构紊乱，排列不规整，心肌间炎症渗出明显增多;与模型组比较，MTJA组大鼠心肌细胞的形态较为规则，部分心肌细胞水肿，染色变浅，心肌间炎症细胞浸润较少，受损程度较模型组有所减轻(图 5)。

图  5  各组大鼠心肌组织病理学表现(苏木精-伊红染色，200×)

Fig.  5  Myocardial histopathological images of rats in each group (hematoxylin-eosin staining, 200×)

MI: Myocardial infarct; MTJA: Maitong Jun'an decoction.

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蛋白质印迹法分析结果显示，模型组大鼠心尖组织IL-1β和IL-6表达水平与假手术组相比升高(均P＜0.01)，而MTJA组大鼠心尖组织IL-1β和IL-6蛋白表达水平与模型组相比降低(均P＜0.05)，见图 6。结合H-E染色结果，提示MTJA可能通过作用于IL-1β和IL-6等靶点发挥治疗冠心病的作用。

图  6  各组大鼠心尖组织IL-1β和IL-6蛋白的表达情况

Fig.  6  Expression of IL-1β and IL-6 proteins in apical tissues of rats in each group

The expression of proteins was detected by Western blotting. ^*P<0.05, ^**P<0.01. n＝4, x±s. IL: Interleukin; MI: Myocardial infarct; MTJA: Maitong Jun'an decoction; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

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3   讨论

从中医角度看，MTJA中黄芪用量最大，黄芪作为补益元气的良药，其目的在于通过气旺来促进血液的流畅，进而达到化瘀通络的效果;当归以活血通络的特性著称，且能通络而不伤血，与黄芪相互配伍，共同作为方剂中的君药，发挥主要治疗作用;党参补益脾气、肺气及中焦之气，兼具养血生津之功;瓜蒌则能理气宽胸，通阳泄浊，既补气又行气，气行则血行，有助于血液的畅通;赤芍与川芎协同当归发挥活血祛瘀的作用，共同作为方剂中的臣药，辅助君药发挥疗效;白术具有健脾燥湿的功效，能够增强益气助运的力量;桃仁、红花、地龙均能通经活络，其药效专而善走，能够周行全身，协助药力的发挥，因此作为方剂中的佐药;甘草则具有调和诸药的作用，作为方剂中的使药，使整个方剂的药效更加协调平和。

本研究通过网络药理学的药材-成分-靶点-疾病网络对药材中的成分进行分析，依照度值排名得到关键活性成分为槲皮素、山柰酚和木犀草素，均归类于黄酮类化合物^[16]。研究表明，黄酮类化合物的生物和药物活性包括细胞毒性、抗癌、抗炎、抗菌、心脏保护等^[17-18]。黄酮类化合物能够通过多种靶向途径抑制炎症过程，包括抑制参与炎症及其进展的转录因子和调节酶的活性^[19];炎症期间的细胞活化涉及各种激酶，如酪蛋白激酶2、酪氨酸激酶等，它们负责通过蛋白质或脂质磷酸化转导信号，而黄酮类化合物能够通过影响这些激酶的活动调节炎症过程^[20]。有研究构建了动脉粥样硬化细胞模型和小鼠模型，发现槲皮素通过抑制Piezo1介导的NF-κB/IL-1β和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)/caspase 1/IL-1β轴来抑制炎症，从而减缓动脉粥样硬化的形成^[21]。山柰酚同样具有抗氧化、抗炎和心脏保护活性，在动脉粥样硬化的预防和治疗中展现出潜力^[22]。木犀草素通过调节沉默信息调节因子1(sirtuin 1，SIRT1)/C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)信号通路促进自噬和抑制血管钙化，并可能被开发为治疗血管钙化和动脉粥样硬化的新药物^[23]。上述研究表明，MTJA中的主要活性成分具有广泛的药理活性，可通过多种机制抗动脉粥样硬化、保护心脏。

本研究通过PPI网络进一步揭示了MTJA中的主要活性成分能够靶向多个与冠心病相关的蛋白质和信号通路，如IL-6、IL-1β和Akt1等。IL-6、IL-1β属于促炎性细胞因子，具有明显的促动脉粥样硬化作用。有研究证明，心肌梗死后血浆IL-6升高，IL-6不仅参与了心肌梗死的发病过程，还可能影响疾病的进展和预后^[24]。IL-1β可直接影响心肌细胞，导致收缩功能障碍，并放大炎症反应，从而扩大梗死区域^[25-26]。针对这些靶点的药物开发是近年来的热点研究方向^[27-28]。Akt1信号通路调控心血管系统中多种细胞的功能，具有血管保护作用。研究发现，利钠肽受体C缺失引起cAMP/蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)通路激活，导致下游Akt1通路上调和NF-κB通路下调，从而发挥抗炎和抗动脉粥样硬化作用^[29]。

根据GO和KEGG通路富集分析结果，推测MTJA改善心肌损伤的机制可能与IL-17、TNF等信号通路有关。这些信号通路在冠心病的发生和发展中扮演着重要角色，它们能够调节炎症因子的产生和作用，进而影响心肌细胞的损伤和修复过程^[30]。MTJA中的主要活性成分可能通过作用于这些信号通路的关键节点抑制炎症因子的产生和功能，从而发挥治疗冠心病的作用。值得一提的是，尽管IL-17介导的mRNA稳定所导致的炎症反应增强在病原体清除过程中是有益的，但该途径的抑制对于预防严重炎症至关重要^[31]。在炎症性关节炎患者中，TNF-α拮抗剂可能对预防亚临床动脉粥样硬化和动脉僵硬度的进展具有有益作用，但目前尚不清楚这是TNF-α拮抗剂的直接作用还是与更好地控制炎症有关^[32]。

本研究基于网络药理学的结果以及分子对接中关键靶点与化合物的良好结合，合理推测MTJA对冠心病的治疗作用机制涉及IL-17、TNF-α等信号通路及IL-6、IL-1β等炎症因子。随后选择冠状动脉左前降支结扎心肌梗死模型进行动物实验，结果显示MTJA能显著改善心肌梗死模型大鼠的心肌损伤程度，降低大鼠心尖组织中IL-1β和IL-6蛋白的表达水平。这进一步验证了网络药理学对MTJA治疗冠心病相关机制的预测结果，具体来说，MTJA能有效减轻模型大鼠的症状，主要是通过抑制促炎因子IL-6和IL-1β的表达来实现的。这2种促炎因子在炎症反应中扮演着重要角色，它们的过度表达会导致心肌损伤加重，而MTJA通过抑制这些促炎因子的表达有效减轻了心肌炎症反应，从而改善了心肌功能，对冠心病的治疗具有积极作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法、分子对接技术和动物体内实验初步探究了MTJA在冠心病治疗中的作用机制，并证实了其通过抑制促炎因子IL-6和IL-1β的表达改善冠心病心肌损伤。