多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见的女性内分泌紊乱性疾病，可以导致育龄期女性月经不规则甚至不孕，并表现为多毛症、痤疮、肥胖、胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱等^[1]。PCOS的病因、病机尚不清晰，其发病受多种因素影响，包括环境毒物、压力、饮食等外来因素，以及胰岛素抵抗、高雄激素血症、炎症、氧化应激和肥胖等自身因素^[2]。肥胖是目前的研究热点，约有半数以上的PCOS患者伴有超重或肥胖，PCOS症状通常会随着体重减轻而改善^[3]。

中医古籍中并无“多囊卵巢综合征”一词，根据临床表现可将肥胖型PCOS归于“月经后期”“闭经”“不孕症”“癥瘕”等范畴。《丹溪心法》有云：“痰夹瘀血，遂成案囊”，又云：“若是肥盛妇人，禀受甚厚，恣于酒食之人，经血不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫，宜行湿燥痰”。对肥胖型PCOS的主要辨证为痰湿阻滞，其治疗多以健脾化痰祛湿为主^[4]。

化痰祛湿药种类繁多，有研究者对补肾化痰中药治疗多囊卵巢综合征的临床文献进行meta分析发现，治疗PCOS使用频次前8位的化痰药为半夏、胆南星、皂角刺、白芥子、浙贝母、昆布、竹茹和瓜蒌，祛湿药主要是茯苓、薏苡仁、泽泻、车前子、苍术与厚朴^[5]。为什么这些化痰祛湿药是治疗PCOS的常用药物，以及祛湿药和化痰药通过何种机制治疗肥胖型PCOS，目前还没有明确。本研究用生物信息学方法对化痰药和祛湿药治疗肥胖型PCOS的分子通路进行分析，并寻找其中关键天然化合物，期待为后续的实验研究与药物开发奠定初步基础。

1   资料和方法

1.1   祛湿药和化痰药的成分与靶点确定

HERB数据库（http://herb.ac.cn）通过整合高通量分析、文献检索、数据库挖掘、统计推断将12 933个靶点、28 212种疾病、7 263种草药及49 258种成分联系起来，形成结对关系，是目前最为完善的中医药成分靶点数据库之一^[6]。本研究通过HERB数据库对上文提及的8种化痰药和6种祛湿药进行成分及靶点收集。化痰药与祛湿药靶点与成分的交集部分利用在线维恩图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获取。

1.2   功能富集分析

利用欧易云平台进行基因本体（Gene Ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，获取生物过程、细胞成分、分子功能和关键信号通路。对富集结果中P≤0.05的功能注释作进一步分析，利用Cytoscape 3.8.0软件构建通路网络图。

1.3   潜在化合物筛选

利用HERB数据库及TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/）对化痰药和祛湿药共有的52种活性成分进行口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-likeness，DL）分析及靶点筛选。OB和DL是基于吸收、分布、代谢和排泄模型（absorption, distribution, metabolism, and excretion model）的用于鉴别和筛选中药活性成分的重要药代动力学参数^[7]，OB≥30%、DL≥0.18的活性成分被认为具有可靠的药理活性。利用GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）获取PCOS的疾病靶点，将52个化合物对应靶点与PCOS靶点取交集，筛选其中多靶点、高OB与DL的化合物。

1.4   PCOS差异基因分析及效度验证

对基因表达汇编（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库进行检索，选定GSE5850及GSE10946作为主要研究数据集，GSE5850数据集包括6例正常体重健康女性的MⅢ期停滞卵母细胞及6例肥胖型PCOS患者的MⅢ期停滞卵母细胞^[8]；GSE10946数据集包括6例正常体重健康女性的颗粒细胞及7例肥胖型PCOS患者的颗粒细胞^[9]。运用R 4.2.2软件获取各组间的差异表达基因，利用在线维恩图工具获得交集基因。

1.5   分子对接分析

将候选化合物与GEO数据库筛选的关键靶点进行分子对接，验证候选化合物对PCOS相关关键靶点的调控作用。从PubChem数据库获得槲皮素（PubChem CID：5280343）、β-谷甾醇（PubChem CID：222284）及豆甾醇（PubChem CID：5280794）的三维结构。运用ChemDraw软件画出化合物的二维结构，随后导入到Chem3D软件中，利用MM2模块进行能量最小化，获得能量最低的优势构象，并保存为mol2文件。从PDB数据库下载丘奇尔结构域蛋白1（Churchill domain-containing protein 1，CHURC1）（pdb号：2JOX）和肿瘤坏死因子配体超家族成员11（tumor necrosis factor ligand superfamily member 11，TNFSF11）（pdb号：3URF）的三维晶体结构，利用pyMOL软件分别进行可视化，然后用Mgtools 1.5.6软件进行去水、加氢、计算电荷、合并非极性氢等处理，再将配体与受体分别保存为pdbqt文件。使用AutoDock Vina 1.1.2软件将配体与受体进行对接，取得分较高的构象，并用pyMOL和Discovery Studio软件进行可视化^[10]。

1.6   分子动力学模拟

在本研究中，对于底物采用了通用AMBER力场，原子电荷通过Multwfn软件的RESP方法获得。利用AMBERTools中的parmchk工具生成配体缺失的参数。为了中和体系的总电荷，在蛋白质表面添加了Na⁺和Cl^－。最终，将所得体系置于一个矩形盒子中进行溶剂化，盒子内填充TIP3P（transferable interatomic potential with three points）水分子，并确保从蛋白质边界向外延伸至少1.5×10^－11 m的最小截断距离。在所有分子动力学模拟中，蛋白质均采用了AMBER ff14SB力场。初始结构通过结合最陡下降法和共轭梯度法进行了充分的最小化处理。随后，在正则系综下，体系从10 K缓慢升温至300 K，持续0.05 ns，并施加了1.5×10¹¹ kcal·mol^－1·m^－1（1 kcal＝4.184 kJ）的弱约束。接下来，在等温等压系综下，以300 K为目标温度、1.0 atm（1 atm＝1.0×10⁵ kPa）为目标压力，使用Langevin恒温器和Berendsen压力控制器进行了1 ns的密度平衡，其中碰撞频率为0.002 ns，压力松弛时间为0.001 ns。为了使温度和压力达到稳定，体系进一步平衡0.5 ns。经过适当的最小化和平衡后，对所有复合体系进行200 ns的生产性分子动力学模拟运行。所有分子动力学模拟均使用Gromacs 2022.4软件完成^[11]。

2   结果

2.1   化痰药与祛湿药的活性成分及靶点获取

通过HERB数据库获取化痰药活性成分561种、祛湿药活性成分528种，两者共有活性成分52种。化痰药成分对应靶点254个（图 1A），祛湿药对应靶点151个（图 1B），两者共有靶点81个。

图  1  化痰药（A）与祛湿药（B）靶点获取

Fig.  1  Obtaining targets of Huatan drugs (A) and Qushi drugs (B)

下载: 全尺寸图片

2.2   化痰药与祛湿药靶点的GO分析

化痰药的GO分析共获得1 101个明显富集的GO条目（P≤0.05），图 2A显示了其中前30个富集最明显的GO条目。祛湿药的GO分析共获得861个明显富集的GO条目（P≤0.05），图 2B显示了前30个富集最明显的GO条目。化痰药与祛湿药共有517个相同GO条目。GO分析中众多的基因被合并为一个基因组，多种基因组调节参与PCOS发生和发展的特定生物活动，化痰药与祛湿药可通过多种相同的基因组发挥肥胖型PCOS治疗作用，如细胞对胰岛素刺激的反应（GO: 0032869）、胰岛素分泌的调节（GO: 0048010）、脂肪酸代谢过程的正向调节（GO: 0045923）、对脂肪酸的反应（GO: 0070542）、卵巢卵泡发育（GO: 2000379）和对雌二醇的反应（GO: 0032355）等。

图  2  化痰药（A）与祛湿药（B）靶点的GO分析

Fig.  2  GO analysis of targets of Huatan drugs (A) and Qushi drugs (B)

GO: Gene Ontology; NIK: NF-κB-inducing kinase; NF-κB: Nuclear factor κB; miRNA: MicroRNA; MHC: Major histocompatibility complex.

下载: 全尺寸图片

2.3   化痰药与祛湿药靶点的KEGG分析

结果显示，化痰药靶点对应180条有统计学意义（P≤0.05）的通路，图 3A显示了前20个与PCOS关系最密切的富集通路。祛湿药靶点对应153条有统计学意义（P≤0.05）的通路，图 3B显示了前20个与PCOS关系最密切的富集通路。化痰药与祛湿药有65个相同的通路，化痰药特有通路36个，祛湿药特有通路12个（图 4）。化痰药、祛湿药共有通路提示两者对于PCOS的治疗作用均涉及脂质调控、胰岛素调节、激素调节、促进卵母细胞成熟等方面，包括脂肪细胞因子信号通路（path: hsa04920）、脂肪细胞中脂肪分解的调节（path: hsa04923）、胰岛素信号通路（path: hsa04910）、胰岛素抵抗（path: hsa04931）、雌激素信号通路（path: hsa04915）、血管内皮生长因子信号通路（path: hsa04370）、孕激素介导的卵母细胞成熟（path: hsa04914）等多条通路。

图  3  化痰药（A）与祛湿药（B）靶点的KEGG分析

Fig.  3  KEGG analysis of targets of Huatan drugs (A) and Qushi drugs (B)

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; TNF: Tumor necrosis factor; IL-17: Interleukin-17; NF-κB: Nuclear factor κB; VEGF: Vascular endothelial growth factor; GnRH: Gonadotropin-releasing hormone; TGF-β: Transforming growth factor-β.

下载: 全尺寸图片

图  4  化痰药与祛湿药KEGG分析共有通路与特有通路

Fig.  4  Common pathways and specific pathways in KEGG analysis of Huatan drugs and Qushi drugs

The green triangle on the left side represents the specific pathways of Huatan drugs, the light blue rhombus in the middle represents the common pathways of Huatan drugs and Qushi drugs, and the red concave quadrilateral on the right side represents the specific pathways of Qushi drugs. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

下载: 全尺寸图片

2.4   潜在天然化合物分析

从化痰药及祛湿药共有的52种活性成分中，以OB≥30%、DL≥0.18为标准筛选出8个候选活性成分，如表 1所示。其中豆甾醇的DL最高，达到0.76；而槲皮素的OB最高，达到46.43%。对各个成分靶点进行汇总，其中chrysanthemaxanthin与gallic acid-3-O-(6’-O-galloyl)-glucoside在数据库中无对应靶点，因而去除不予纳入。将其余成分靶点与GeneCards数据库来源的PCOS靶点取交集，发现槲皮素与PCOS的交集靶点最多，其次为β-谷甾醇及豆甾醇（图 5）。

图  5  各成分与PCOS相关靶点

Fig.  5  Each compound and PCOS-related targets

PCOS: Polycystic ovary syndrome.

下载: 全尺寸图片

2.5   GEO数据集分析PCOS关键靶点

所纳入的2项GEO数据集均进行数据标准化调整，根据P＜0.05、|log₂(FC)|≥1（FC为差异倍数）的标准，在GSE5850数据集（MⅢ期停滞卵母细胞）共计获得1 129个差异表达基因，GSE10946数据集（颗粒细胞）共计获得31个差异表达基因。MⅢ期停滞卵母细胞与颗粒细胞交集差异表达基因共4个，见表 2。其中只有Ⅻ型胶原蛋白α1链（collagen type Ⅻ α 1 chain，COL12A1）在肥胖型PCOS患者的MⅢ期停滞卵母细胞（下调）及颗粒细胞（上调）中表达存在差异，而三肽重复结构域蛋白32（tetratricopeptide repeat domain 32，TTC32）、TNFSF11在肥胖型PCOS患者的MⅢ期停滞卵母细胞及颗粒细胞中均上调，CHURC1则均下调。

2.6   化合物单体与关键靶点的分子对接

因TTC32缺乏pdb号，本研究只纳入TNFSF11及CHURC1进行分析。具体结合状态见图 6，所有对接结合能均低于－5 kJ/mol，β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇与CHURC1的结合能分别为－6.2、－6.4、－6.4 kJ/mol，与TNFSF11的结合能分别为－8.1、－6.8、－8.4 kJ/mol，说明化合物单体与肥胖型PCOS关键靶点之间具有较好的结合活性，其中豆甾醇与TNFSF11及CHURC1的结合能均为最低值，值得进一步研究。

图  6  化合物单体与肥胖型PCOS关键靶点的分子对接模式图

Fig.  6  Schematic diagram of molecular docking between compound monomers and key targets related to obesity-PCOS

PCOS: Polycystic ovary syndrome; CHURC1: Churchill domain-containing protein 1; TNFSF11: Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11.

下载: 全尺寸图片

2.7   分子动力学模拟实验结果

槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇与TNFSF11对接所需结合能均少于CHURC1，因而选定TNFSF11进行分子动力学模拟实验。实验结果（图 7）显示3个候选化合物单体中，β-谷甾醇与TNFSF11结合的整体稳定性最强。均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）分析显示，β-谷甾醇复合物蛋白质Cα原子的RMSD曲线在0.1 ns后趋于平稳，最终稳定在0.6 nm左右，表明体系在模拟过程中达到了平衡状态，整体结构稳定（图 7A）；而豆甾醇、槲皮素都出现明显陡峰（图 7C、7E）。均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）分析显示，β-谷甾醇复合物在氨基酸残基220~240和240~260的波动值较高，表明这些区域具有较高的柔性，可能是蛋白质的柔性环或连接区域；氨基酸残基180~220的RMSF值较低，表明这些区域在模拟过程中较为稳定，可能是蛋白质的二级结构区域（图 7B）；豆甾醇的RMSF图显示其有多个波动峰，槲皮素则在氨基酸残基240~260有个极值波峰（图 7D、7F）。

图  7  β-谷甾醇（A、B）、豆甾醇（C、D）、槲皮素（E、F）与TNFSF11的分子动力学模拟实验结果

Fig.  7  Molecular dynamics simulation results of β-sitosterol (A, B), stigmasterol (C, D), and quercetin (E, F) with TNFSF11

A, C, E: Root mean square deviation (RMSD) analysis results; B, D, F: Root mean square fluctuation (RMSF) analysis results. TNFSF11: Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11.

下载: 全尺寸图片

3   讨论

中医学通过长期的临床实践，在PCOS领域积累了大量的临床经验。中医学认为痰湿内阻是肥胖型PCOS最关键的病理生理机制之一，在临床上应注重祛湿化痰^[12]。肥胖及胰岛素抵抗也是PCOS的重要特征，痰湿体质又与以胰岛素抵抗为代表的代谢综合征密切相关^[13]，在肥胖型PCOS的治疗中化痰祛湿尤为重要。

本研究通过网络药理学分析发现，化痰药及祛湿药的共有通路包括脂质调控、胰岛素调节、激素调节、促进卵母细胞成熟等多个方面，与PCOS的病理机制契合。其中脂质调节涉及脂肪细胞因子信号通路与脂肪细胞中脂肪分解的调节。功能失调的脂肪细胞在PCOS患者的代谢及内分泌紊乱中起着重要作用^[14-15]。一方面，脂肪细胞分泌的脂肪因子可以参与下丘脑-垂体-肾上腺和卵巢轴的调节，促进类固醇生成，增加醛固酮、皮质醇及脱氢表雄酮水平，并且参与卵泡膜和颗粒细胞之间双向连接的调节，进而影响卵巢功能^[16]。另一方面，脂肪细胞还参与胰岛素抵抗的形成。研究发现，脂肪组织在巨噬细胞侵入后其胰岛素敏感性及葡萄糖耐量均受损^[17-18]。同时，化痰药还有36个特有通路，包括卵巢类固醇生成、类固醇激素生物合成、促性腺激素分泌、促性腺激素释放激素信号通路及胰腺分泌等，可以发现化痰药在激素调控通路方面远优于祛湿药通路，提示在患者激素紊乱较为严重时可能应多考虑使用化痰药。祛湿药则有12个特有通路，包括叶酸生物合成、维生素的消化和吸收及花生四烯酸代谢等，可以发现祛湿药在维生素合成与代谢及抗炎方面具备一定优势。

在潜在化合物筛选中，槲皮素、豆甾醇及β-谷甾醇表现优异。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，其药理作用包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤及抗菌等^[19]，在PCOS领域已经有较多研究报道，其可通过抗炎、改善氧化应激状态、抗凋亡及抗胰岛素抵抗作用改善PCOS患者的高雄激素血症和高胰岛素血症^[20]。豆甾醇与β-谷甾醇都属于植物甾醇，两者具有高度相似的甾醇骨架，仅在侧链部分存在差异，两者都可以降低胆固醇水平，发挥降低血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节作用^[21-22]。目前关于豆甾醇与β-谷甾醇的研究并不多，仅有研究报道β-谷甾醇能调节肠道菌群结构和组成，协调性激素平衡，改善PCOS子宫内膜容受性^[23]，但对于PCOS疾病本身效果如何并没有报道。

PCOS患者排卵不稳定且卵泡发育过程受到抑制，颗粒细胞及卵母细胞均受到了极大的影响，生物信息学分析表明TTC32、TNFSF11及CHURC1在颗粒细胞和卵母细胞中同时受到调控，或许在PCOS疾病发生、发展过程中发挥重要作用。在分子对接中，豆甾醇与TNFSF11、CHURC1的结合能均最为突出，TNFSF11又名核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL），参与卵泡发育和卵巢功能的调节^[24]。RANKL和核因子κB受体活化因子系统的失调与排卵障碍、PCOS和卵巢癌有关^[25-26]。目前关于CHURC1在PCOS领域的研究较少，但有研究报道CHURC1是肥胖依赖性调节的重要基因，参与代谢及炎症过程^[27]；定量性状位点分析提示CHURC1是2型糖尿病最为显著的位点之一，深度参与2型糖尿病的发病过程^[28-29]。由此可见CHURC1在肥胖和糖尿病的发生、发展过程中有重要作用。

综上所述，本研究通过生物信息学挖掘发现了化痰药与祛湿药通过调控脂肪细胞和胰岛素功能、调节激素水平、促进卵母细胞成熟等发挥治疗PCOS的作用。化痰药在调节激素及胰岛素功能方面作用更为突出，而祛湿药则在维生素代谢及抗炎方面效果更为优异。在有效化合物单体筛选中，槲皮素、豆甾醇和β-谷甾醇表现突出，均可与TNFSF11、CHURC1有效结合，可能通过参与卵母细胞成熟、肥胖调控及胰岛素代谢等多个机制治疗PCOS，值得进一步探析，以便为PCOS的临床治疗提供新的药物选择。