Corilagin inhibits nigericin-induced chondrocyte pyroptosis by interfering glycolysis/ROS/NLRP3 signaling
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摘要:
目的 探讨柯里拉京（COR）对脂多糖（LPS）联合尼日利亚菌素（NIG）诱导的Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体激活和软骨细胞焦亡的调控作用。 方法 采用C57BL/6J小鼠的软骨细胞作为实验对象，将原代软骨细胞培养至第3代用于实验，实验分为对照组、LPS组、LPS+ NIG组及LPS+ NIG+ COR（低、中、高剂量）组。首先用LPS预致敏软骨细胞4 h，然后分别用不同浓度（10、20、40 μmol/L）的COR处理细胞30 min，最后加入NIG（10 μmol/L）刺激1 h；对照组细胞采用含1% FBS的DMEM/F-12培养基培养。采用CCK-8法检测不同浓度（10、20、40 μmol/L）的COR对软骨细胞活性的影响，采用PI和Hoechst 33342双染色和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒分析COR对LPS和NIG诱导的软骨细胞死亡的影响，采用蛋白质印迹法分析细胞上清中NLRP3炎症小体激活标志物caspase 1 p20的表达水平及细胞裂解液中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、caspase 1、IL-1β前体和细胞焦亡执行蛋白消皮素D（GSDMD）的表达，采用ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β的水平，采用荧光探针2’, 7’- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）染色观察COR对活性氧（ROS）产生的影响，采用蛋白质印迹法分析软骨细胞内糖酵解相关蛋白己糖激酶2（HK2）、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、LDHA的表达。 结果 浓度≤40 μmol/L的COR对软骨细胞的活性影响较小。10~40 μmol/L COR能够降低LPS和NIG刺激的PI阳性细胞比例（均P＜0.05）和LDH的释放（均P＜0.01），抑制软骨细胞内GSDMD蛋白氨基末端的表达，减少软骨细胞caspase 1 p20和IL-1β的释放（均P＜0.01）。40 μmol/L COR能够减少软骨细胞内ROS的产生（与对照组比较P＜0.01），并抑制糖酵解相关蛋白HK2、GLUT1、LDHA的表达（均P＜0.05）。 结论 COR通过抑制NIG诱导的糖酵解/ROS/NLRP3信号减少了NLRP3炎症小体激活和软骨细胞焦亡。 Abstract:Objective To explore the regulatory effect of corilagin (COR) on Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome activation and chondrocyte pyroptosis induced by lipopolysaccharide (LPS) combined with nigericin (NIG). Methods Primary chondrocytes isolated from C57BL/6J mice were cultured to passage 3 for experiments. Cells were divided into control group, LPS group, LPS+ NIG group, and LPS+ NIG+COR (low-, medium-, and high-dose) groups. The chondrocytes were pre-sensitized with LPS for 4 h. Then the cells were treated with COR at different concentrations (10, 20, and 40 μmol/L) for 30 min, and finally NIG (10 μmol/L) was supplemented for 1 h. Control cells were cultured in DMEM/F-12 medium supplemented with 1% FBS. Cell counting kit 8 (CCK-8) was used to detect the effect of COR at different concentrations (10, 20, 40 μmol/L) on chondrocyte viability. Propidium iodide (PI) and Hoechst 33342 staining and lactate dehydrogenase (LDH) release assay were used to analyze the effect of COR on chondrocyte death induced by LPS and NIG. Western blotting was used to detect the expression of the NLRP3 inflammasome activation marker cysteine aspartic acid specific protease 1 (caspase 1) p20 in the cell supernatant and NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein (ASC), caspase 1, interleukin-1β precursor (pro-IL-1β), and pyroptosis execution protein gasdermin D (GSDMD) in the cell lysate. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the level of IL-1β in cell culture supernatant. Reactive oxygen species (ROS) fluorescent probe 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) staining was used to observe the effect of COR on ROS production, and Western blotting was used to detect the expression of intracellular glycolysis-related proteins hexokinase 2 (HK2), glucose transporter 1 (GLUT1), and lactate dehydrogenase A (LDHA). Results COR exhibited slight effect on chondrocyte viability at the concentration ≤ 40 μmol/L. COR (10-40 μmol/L) reduced the proportion of PI-positive cells (all P < 0.05) and the release of LDH (all P < 0.01) stimulated by LPS and NIG, inhibited the expression of GSDMD N-terminus domain in chondrocytes, and reduced the release of caspase 1 p20 and IL-1β from chondrocytes (all P < 0.01). Furthermore, COR (40 μmol/L) reduced the production of ROS (compared with the control group, P < 0.01) and inhibited the expression of glycolysis-related proteins HK2, GLUT1, and LDHA (all P < 0.05). Conclusion COR can inhibit NIG-induced glycolysis/ROS/NLRP3 signaling, thereby preventing NLRP3 inflammasome activation and chondrocyte pyroptosis. -
Keywords:
- corilagin /
- glycolysis /
- NLRP3 inflammasome /
- chondrocytes /
- pyroptosis
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关节炎影响着全球数亿人的生活质量，关节感染和软骨损伤是关节炎的常见特征，与Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（Nod-like receptorfamily pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎症小体的激活密切相关[1]。NLRP3炎症小体的异常激活会导致软骨细胞焦亡（一种程序性细胞死亡形式），严重影响软骨的结构和功能[1-2]。因此，探寻能够调节这一过程的药物对治疗细菌性关节炎至关重要。NLRP3是先天免疫的重要组成部分[3]，NLRP3炎症小体是一种由受体蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associatedspeck-like protein，ASC）和caspase 1前体组成的胞质内多蛋白复合物。NLRP3炎症小体的经典激活途径包括启动和激活2个步骤：第1步为模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式，也可通过炎症细胞因子等诱导NF-κB或其他转录因子的活化，促进NLRP3和IL-1β前体的表达；第2步为传感器蛋白NLRP3发生寡聚化，并招募ASC形成一个大分子焦点（称为ASC斑点），组装的ASC进一步募集caspase 1前体，最终形成NLRP3-ASC-caspase 1复合物，即NLRP3炎症小体。激活的NLRP3炎症小体能够引发caspase 1切割，产生有活性的caspase 1 p10和p20 2种亚基，后者可以切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）获得其氨基末端结构域（gasdermin D-N-terminal domain，GSDMD-NT）。GSDMD-NT与细胞膜结合形成孔隙，介导IL-1β等炎症因子的释放，并诱导炎症细胞焦亡[4]。NLRP3炎症小体的激活不仅发生于巨噬细胞，在软骨细胞内也能检测到[5]。已有研究证实NLRP3炎症小体的异常激活会导致过度的炎症反应，进而加剧痛风、骨关节炎和关节细菌感染等疾病的发生、发展[6]。
糖酵解是一种细胞内的糖代谢过程，在调控细胞免疫应答和炎症过程中发挥重要作用。细胞外葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）被转运到细胞内[7-8]。己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是参与调控糖酵解过程的3个限速酶。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）A促进丙酮酸转化为乳酸。此外，糖酵解的代谢酶HK能够调控NLRP3炎症小体的激活[9]。GLUT1可促进NLRP3炎症小体的激活，而敲除GLUT1则能抑制糖酵解，进而阻止单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体诱导的ASC寡聚化和IL-1β分泌[10]，说明干预糖酵解过程可作为关节感染疾病的治疗策略。
柯里拉京（corilagin，COR）是一种天然多酚单宁酸类化合物，分子式为C27H22O18，分子量为634.46，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、DMSO等有机溶剂。COR属于逆没食子酸鞣质，是老鹳草和叶下珠等植物的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗菌等生物活性[11]。Li等[12]发现，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/ 尼日利亚菌素（nigericin，NIG）刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和小鼠肺上皮细胞MLE-12及NIG刺激的大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC6中，COR通过抑制NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡减轻小鼠肠道缺血再灌注诱导的肠肺损伤。本课题组前期研究发现，COR能抑制MSU晶体诱导的NLRP3炎症小体激活和巨噬细胞焦亡，减少炎症因子IL-1β的分泌，从而缓解MSU晶体诱导的关节炎症[13]。COR对软骨细胞内NLRP3炎症小体激活及软骨细胞焦亡的调控作用尚未见详细报道。
本实验采用LPS联合NIG刺激软骨细胞诱导NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡，并通过COR干预，分析COR对NLRP3炎症小体、糖酵解相关蛋白及活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影响，考察其是否通过糖酵解/ROS/NLRP3信号发挥保护作用，为应用COR治疗NLRP3相关的炎症疾病提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 试剂及抗体
COR（货号：B20672）购自上海源叶生物科技有限公司；Ⅱ型胶原蛋酶（货号：BS164）购自北京兰杰柯科技有限公司；PI（货号：P4170）、Hoechst 33342（货号：B2261）和FBS（货号：S8318）均购自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM/F-12培养基（货号：C11330500BT）、链霉素- 青霉素双抗（货号：15140122）均购自美国ThermoFisher公司；CCK-8试剂（货号：C005）购自上海陶素生化科技有限公司；LDH细胞毒性检测试剂盒（货号：C0017）、RIPA裂解液（强）（货号：P0013B）均购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（货号：FD2001）、一步法凝胶制备试剂盒（货号：FD341）均购自杭州弗德生物技术有限公司；超敏化学发光试剂（货号：P0100）购自苏州新赛美生物科技有限公司；小鼠IL-1β ELISA检测试剂盒（货号：EMCOO1b）购自深圳欣博盛生物科技有限公司；Alexa-Fluor 555山羊抗鼠IgG抗体（货号：4409）、NLRP3抗体（货号：15101）、ASC抗体（货号：67824）和GAPDH抗体（货号：2118S）均购自美国Cell SignalingTechnology公司；caspase 1 p20抗体（货号：AG-20B 0042）购自瑞士AdipoGen公司；caspase 1抗体（货号：NB100-56565）购自美国Novus Biologicals公司；HK2抗体（货号：66974-1-1g）、LDHA抗体（货号：66287-1-1g）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；GLUT1抗体（货号：HA601071）购自杭州华安生物技术有限公司；GSDMD抗体（货号：ab209845）、β- 肌动蛋白（β-actin）抗体（货号：ab8227）购自英国Abcam公司。
1.2 软骨组织的取材及处理
将8~10周龄雄性C57BL/6J小鼠[购自广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0085]颈椎脱臼处死，用75% 乙醇浸泡5 min，在无菌超净台内用手术刀将四肢皮肤切开，用剪刀剪下双侧的股骨和胫骨，剔除周围的肌肉、韧带和关节囊等软组织，剥离出股骨的两端（股骨头和股骨髁）及胫骨面的软骨组织。用PBS清洗软骨组织2次，洗去附着在软骨表面的血液及滑膜组织，然后用眼科手术剪将其剪切成约1 mm3的组织块。
1.3 软骨细胞的培养与鉴定
将大小适宜的软骨组织块转移至6 cm培养皿中，加入4 mL含0.1%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F-12培养基，然后置于37 ℃、5% CO2培养箱内消化4 h，其间每隔1 h取出用十字法摇晃混匀，使Ⅱ型胶原酶与软骨组织充分接触。消化结束后用70 μm细胞过滤器去除杂质，收集细胞悬液，200×g离心5 min。将原代软骨细胞重悬于含10% FBS和1% 链霉素- 青霉素双抗的DMEM/F-12完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每48 h更换1次培养基。培养7 d，待细胞融合率达90% 时，按照1 ∶ 3比例进行传代。显微镜下观察软骨细胞的生长情况，取第3代细胞用于实验。取第1代细胞进行阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定。
1.4 分组及给药
实验分为6组：对照组、LPS组、LPS+ NIG组及LPS+ NIG+ COR（低、中、高剂量）组。用LPS预致敏软骨细胞4 h，然后分别用不同浓度（10、20、40 μmol/L）的COR处理细胞30 min，最后加入NIG（10 μmol/L）刺激1 h，对照组细胞仅使用含1% FBS的DMEM/F-12培养基于CO2培养箱中培养。
1.5 CCK-8法检测细胞活性
将原代软骨细胞悬液浓度调整为1×105/mL，每孔接种100 μL于96板，置于培养箱贴壁过夜。使用不同浓度（0、10、20、40、80、160 μmol/L）的COR处理软骨细胞24 h，之后每孔加入10 μL CCK-8工作液，充分混匀，操作过程中注意避免产生气泡，37 ℃孵育4 h，使用酶标仪在450 nm波长处测光密度（D）值。细胞存活率（%）＝[（实验组D值－空白组D值）/（对照组D值－空白组D值）] ×100%。
1.6 PI和Hoechst 33342双染色检测细胞死亡情况
各组细胞中加入PI（2 μg/mL）和Hoechst33342（5 μg/mL），在室温下避光染色10 min，然后立即用Bio-Rad ZOETM荧光细胞成像系统随机拍摄多个视野照片，计算PI阳性细胞百分比。
1.7 LDH细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性
收集上述细胞的培养上清，400×g离心5 min，取120 μL上清和60 μL配制好的LDH工作液加入96孔板，置于水平摇床上避光孵育30 min，使用酶标仪测量490 nm波长处的D值，按照说明书计算LDH释放量。
1.8 蛋白质印迹法检测蛋白表达
取2 mL软骨细胞悬液以每孔2×105/mL密度接种于6孔板，在培养箱中贴壁过夜，刺激和加药方法同1.4节。刺激完成后收集细胞上清，取800 μL细胞培养上清，加入与上清等体积的甲醇和1/4氯仿振荡混匀，用高速冰冻离心机4 ℃、16 000×g离心11 min，结束后弃上清，加入等体积甲醇进行二次离心，弃上清，将沉淀置于55 ℃金属浴中加热6 min使蛋白完全干燥，在每个样品中加入35 μL配制好的2×SDS-PAGE上样缓冲液，剧烈振荡使其充分溶解。此外，每孔加入120 μL细胞裂解液在冰上裂解30 min后，用刮刀轻轻刮下蛋白，收集细胞裂解液。用高速冰冻离心机16 000×g离心15 min，吸取上清。使用BCA蛋白试剂盒测定总蛋白浓度，计算上样体积。将上清浓缩蛋白或细胞裂解液分别与上样缓冲液混匀后在沸水中煮6 min使蛋白变性。随后对蛋白样品进行SDS-PAGE，然后将细胞蛋白样品转至PVDF膜（90 min），用5% 牛奶封闭膜60 min，按照说明书比例配制NLRP3、全长GSDMD、GSDMD-NT、caspase 1、ASC、IL-1β前体、caspase 1 p20、GLUT1、LDHA、HK2、β-actin和GAPDH抗体等一抗稀释液，4 ℃摇床孵育过夜。次日回收一抗，用TBST洗PVDF膜3次，每次5 min。室温水平摇床孵育二抗1 h，TBST洗膜4次，每次8 min，最后用上海天能全自动化学发光图像分析仪（型号：Tanon5200）拍照并保存显影结果。
1.9 ELISA法检测IL-1β水平
收集上述细胞的培养上清，400×g离心5 min，取100 μL上清或标准品加入到试剂盒的预包被酶标板条内，37 ℃孵育90 min，洗板5次后，离心30 s。加入100 μL提前配制好的1×生物素化抗体工作液，37 ℃避光孵育60 min，洗板5次后，离心30 s；加入100 μL提前配制好的1×酶结合物工作液，37 ℃避光孵育30 min，洗板5次后，离心30 s；每孔加入100 μL显色底物，37 ℃避光孵育15 min；最后向每孔加入100 μL反应终止液，混匀后用酶标仪在450 nm波长处测D值；绘制标准曲线后计算IL-1β水平。
1.10 免疫荧光分析2’, 7’- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA）标记的ROS
在细胞培养板内放置玻璃爬片，取0.5 mL软骨细胞以每孔2×105/mL密度接种于24孔板，按照1.4节的分组处理细胞。每孔加入10 μmol/L H2DCFDA染色30 min，之后加入4% 多聚甲醛溶液室温固定15 min，用PBS洗3次，每次5 min，然后用Hoechst 33342室温避光孵育细胞10 min，PBS洗3次，最后滴加抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片并用指甲油封片，使用德国Zeiss公司的激光共聚焦显微镜（型号：LSM 800with Airyscan）观察并拍照。
1.11 统计学处理
应用GraphPad Prism 9.4软件进行数据分析。计量资料以 x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准（α）为0.05。
2 结果
2.1 小鼠关节原代软骨细胞的形态学特征及鉴定
在显微镜下观察到小鼠的关节软骨细胞呈圆形，悬浮于培养基中，大小均一，具有强折光性。软骨细胞在12 h内逐渐贴壁，48 h内大部分细胞贴壁且呈三角形、多角形散在贴附在皿底；48 h后换液，细胞增殖速度明显加快，且细胞彼此间伸出伪足样突起相互连接；第5天出现复层生长的趋势；第7天细胞达到90% 融合率，胞体丰满，胞质均匀，核大而圆，细胞紧密排列，呈“铺路石”状外观，此时的软骨细胞为第1代。见图 1A。随着传代次数的增加，3代以后细胞逐渐分化为成纤维细胞，两端伸出数量不等的伪足，细胞形态不规则，生长速度下降。故本实验选用第3代细胞用于相关机制研究。
图 1 小鼠关节软骨细胞的形态观察及软骨标志物鉴定（100×）Fig. 1 Morphological observation of mouse articular chondrocytes and identification of cartilage marker (100×)A: Cell morphology maps of chondrocytes on day 3, 5 and 7 in vitro culture; B: Alcian blue stained chondrocyte matrix; C: Immunofluorescence staining of collagen Ⅱ.
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阿利新蓝染色结果显示，碱性染料能与大部分软骨细胞中的酸性黏多糖结合呈蓝绿色（图 1B）。细胞免疫荧光染色结果显示，软骨标志物Ⅱ型胶原蛋白表达阳性（图 1C）。以上结果表明分离培养的细胞为软骨细胞。
2.2 COR能够减少NIG刺激的软骨细胞死亡
CCK-8法检测结果显示，浓度≤40 μmol/L的COR对细胞的活性影响较小（图 2A），因此选择10、20、40 μmol/L的COR用于体外实验。用PI和Hoechst33342双染色检测COR对细胞死亡的影响，结果（图 2B、图 2C）显示NIG能够刺激软骨细胞死亡，10、20、40 μmol/L COR均能降低PI阳性细胞百分比（均P＜0.05）。此外10、20、40 μmol/LCOR能减少软骨细胞培养上清中LDH的释放量（均P＜0.01、图 2D）。以上结果表明COR能够减少NIG刺激的软骨细胞死亡。
图 2 COR减少NIG刺激的软骨细胞死亡Fig. 2 COR reduces NIG-stimulated chondrocyte deathA: Cell viability was detected by CCK-8 (n＝ 3, x±s); B: Cell nuclei stained with PI and Hoechst 33342 (100×); C: The percentage of PI-positive cells (death cells) relative to total cells (*P＜0.05, **P＜0.01. n＝ 5, x±s); D: Cell culture supernatant was taken to detect the release rate of LDH (**P＜0.01. n＝ 3, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; LPS: Lipopolysaccharide; COR10: 10 μmol/L COR; COR20: 20 μmol/L COR; COR40: 40 μmol/L COR; LDH: Lactate dehydrogenase; CCK-8: Cell counting kit 8; PI: Propidium iodide.下载:
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2.3 COR能够抑制NIG刺激的NLRP3炎症小体激活和软骨细胞焦亡
采用ELISA试剂盒检测细胞培养上清，结果显示与LPS+ NIG组比较，10、20、40 μmol/L COR能降低细胞上清中IL-1β的水平（均P＜0.01，图 3A）。
图 3 COR抑制NIG刺激的NLRP3炎症小体激活和软骨细胞焦亡Fig. 3 COR inhibits NIG-stimulated NLRP3 inflammasome activation and chondrocyte pyroptosisA: The level of IL-1β in the supernatant of cell culture was detected by ELISA (**P＜0.01. n＝ 3, x±s); B: Western blotting of the expression of related proteins in cell supernatant and cell lysate; C: Histogram of grayscale analysis of blot bands (*P＜0.05, **P＜0.01. n＝ 3, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; NLRP3: Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3; IL-1β: Interleukin 1β; LPS: Lipopolysaccharide; caspase 1: Cysteine aspartic acid specific protease 1; GSDMD-FL: Gasdermin D-full-length protein; GSDMD-NT: Gasdermin D-N-terminal domain; pro-IL-1β: IL-1β precursor; ASC: Apoptosis-associated specklike protein; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; COR10: 10 μmol/L COR; COR20: 20 μmol/L COR; COR40: 40 μmol/L COR; ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay.下载:
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此外，用蛋白质印迹法检测细胞培养上清浓缩液中NLRP3炎症小体激活标志物caspase 1 p20以及细胞裂解液中NLRP3炎症小体组分蛋白和细胞焦亡执行蛋白GSDMD的表达，结果显示10、20、40 μmol/L COR能抑制LPS+ NIG处理的软骨细胞上清中caspase 1 p20的表达及细胞裂解液中GSDMD-NT、NLRP3的表达（图 3B、3C）。以上结果表明COR能抑制NIG刺激的NLRP3炎症小体激活和软骨细胞焦亡。
2.4 COR能够减少NIG刺激的软骨细胞ROS产生
采用荧光探针H2DCFDA染色观察COR对ROS生成的影响，结果显示NIG可刺激LPS预致敏的软骨细胞产生ROS，而COR能减少NIG刺激的软骨细胞内ROS生成（均P＜0.01，图 4）。结果表明COR对NIG刺激的软骨细胞氧化应激有抑制作用。
图 4 COR减少NIG刺激的软骨细胞ROS产生Fig. 4 COR reduces NIG-stimulated ROS production in chondrocytesA: H2DCFDA-labeled intracellular ROS (20×); B: Quantitative analysis of fluorescence intensity (**P＜0.01. n＝ 5, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; ROS: Reactive oxygen species; H2DCFDA: 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate; LPS: Lipopolysaccharide; COR40: 40 μmol/L COR.下载:
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2.5 COR能够抑制NIG刺激的软骨细胞内糖酵解过程
采用蛋白质印迹法检测糖酵解途径的关键酶HK2、GLUT1和LDHA的表达，结果显示，COR可减少软骨细胞内HK2、GLUT1和LDHA的表达水平（均P＜0.05，图 5）。结果表明COR能抑制NIG对软骨细胞内糖酵解的刺激作用。
图 5 COR抑制NIG刺激的软骨细胞中糖酵解相关信号Fig. 5 COR inhibits NIG-stimulated glycolytic signal in chondrocytesA: Expression of HK2, GLUT1 and LDHA proteins in cell lysate detected by Western blotting; B: Quantitative analysis of the grayscale value of the blot bands (*P＜0.05, **P＜0.01. n＝ 3, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; LPS: Lipopolysaccharide; HK2: Hexokinase 2; GLUT1: Glucose transporter 1; LDHA: Lactate dehydrogenase A; COR10: 10 μmol/L COR; COR20: 20 μmol/L COR; COR40: 40 μmol/L COR.下载:
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3 讨论
COR作为一种鞣质、多酚类化合物，具有良好的抗炎和抗氧化等生物活性[11]。本研究以LPS联合NIG刺激的软骨细胞为体外模型，研究COR对软骨细胞内NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡的影响，结果发现COR能通过抑制糖酵解过程、减少ROS的生成阻止NLRP3炎症小体激活和软骨细胞焦亡，减少炎症因子IL-1β的分泌，提示在关节感染模型中COR有抗炎潜能。
NLRP3炎症小体的激活受多种途径的调控，常见机制包括离子通量改变、线粒体功能障碍、ROS生成及溶酶体损伤等[14]。应用抗氧化剂（如N-乙酰半胱氨酸）的实验表明，ROS是NLRP3炎症小体激活的关键介质，NLRP3炎症小体通过ROS依赖的转录因子NF-κB和LPS介导的NLRP3去泛素化；此外，NLRP3炎症小体激活可诱导炎症反应，并促进免疫细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）聚集，而这些免疫细胞本身也会产生ROS，进一步加剧炎症反应[15]。Ding等[16]研究发现，二氢槲皮素可抑制高糖肾细胞的细胞增殖和ROS的过度生成，减轻高糖肾细胞NLRP3炎症小体的激活和肾纤维化相关蛋白的表达。本研究也发现COR可以抑制ROS的生成及NLRP3炎症小体的激活和软骨细胞焦亡。
糖代谢对维持体内环境稳态具有重要作用。近年来，越来越多的研究表明，肥胖、酒精肝、痛风等代谢性疾病常伴有炎症水平的升高，且炎症反应是推动这些代谢性疾病发展的关键因素[17]。然而，炎症反应与代谢性疾病之间的关系并不明确。随着对先天免疫研究的不断深入，人们发现NLRP3炎症小体与人类自身炎症性疾病和免疫性疾病有关[18]。有研究显示，糖代谢与NLRP3炎症小体的激活关系密切[19]。Zhao等[20]发现用天冬氨酸转氨酶抑制剂氨基氧乙酸处理巨噬细胞可抑制糖酵解途径，同时降低NLRP3炎症小体的激活水平。而使用糖酵解抑制剂2- 脱氧葡萄糖能明显减轻LPS诱导的小鼠肺组织病理损伤、中性粒细胞积累、氧化应激反应和促炎因子的表达，以及减弱NLRP3炎症小体的激活[21]。Rong等[22]发现通过抑制黄嘌呤氧化酶下调低氧诱导因子1α介导的LDHA和NLRP3信号通路，可以缓解胰腺坏死并防止严重急性胰腺炎的进展。Baik等[23]的研究表明，线粒体HK的分离会促进电压依赖性阴离子通道发生寡聚化，从而推动NLRP3炎症小体的组装与激活。本研究也发现COR能抑制软骨细胞内的糖酵解过程，减少ROS生成，从而阻止NLRP3炎症小体的激活。
本研究结果显示，COR具备成为一种有效抗炎药物的潜力，可用于控制NLRP3炎症小体相关炎症性疾病。其作用机制在于，COR能够通过抑制糖酵解过程及相关氧化应激反应，减缓或逆转关节炎的病情进展。本研究揭示了调控细胞焦亡的一种新途径，这一发现对于理解软骨细胞应对炎症压力的机制具有重要意义。然而，本研究也存在一定局限性。尽管在体外模型中观察到COR的积极效果，但其在体内环境的实际效果仍有待进一步验证。此外，COR的生物利用度和稳定性问题一直是制约其临床应用的关键因素，因此开发出高效且稳定的药物制剂将成为未来研究的重要方向。
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图 1 小鼠关节软骨细胞的形态观察及软骨标志物鉴定（100×）
Fig. 1 Morphological observation of mouse articular chondrocytes and identification of cartilage marker (100×)
A: Cell morphology maps of chondrocytes on day 3, 5 and 7 in vitro culture; B: Alcian blue stained chondrocyte matrix; C: Immunofluorescence staining of collagen Ⅱ.
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图 2 COR减少NIG刺激的软骨细胞死亡
Fig. 2 COR reduces NIG-stimulated chondrocyte death
A: Cell viability was detected by CCK-8 (n＝ 3, x±s); B: Cell nuclei stained with PI and Hoechst 33342 (100×); C: The percentage of PI-positive cells (death cells) relative to total cells (*P＜0.05, **P＜0.01. n＝ 5, x±s); D: Cell culture supernatant was taken to detect the release rate of LDH (**P＜0.01. n＝ 3, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; LPS: Lipopolysaccharide; COR10: 10 μmol/L COR; COR20: 20 μmol/L COR; COR40: 40 μmol/L COR; LDH: Lactate dehydrogenase; CCK-8: Cell counting kit 8; PI: Propidium iodide.
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图 3 COR抑制NIG刺激的NLRP3炎症小体激活和软骨细胞焦亡
Fig. 3 COR inhibits NIG-stimulated NLRP3 inflammasome activation and chondrocyte pyroptosis
A: The level of IL-1β in the supernatant of cell culture was detected by ELISA (**P＜0.01. n＝ 3, x±s); B: Western blotting of the expression of related proteins in cell supernatant and cell lysate; C: Histogram of grayscale analysis of blot bands (*P＜0.05, **P＜0.01. n＝ 3, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; NLRP3: Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3; IL-1β: Interleukin 1β; LPS: Lipopolysaccharide; caspase 1: Cysteine aspartic acid specific protease 1; GSDMD-FL: Gasdermin D-full-length protein; GSDMD-NT: Gasdermin D-N-terminal domain; pro-IL-1β: IL-1β precursor; ASC: Apoptosis-associated specklike protein; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; COR10: 10 μmol/L COR; COR20: 20 μmol/L COR; COR40: 40 μmol/L COR; ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay.
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图 4 COR减少NIG刺激的软骨细胞ROS产生
Fig. 4 COR reduces NIG-stimulated ROS production in chondrocytes
A: H2DCFDA-labeled intracellular ROS (20×); B: Quantitative analysis of fluorescence intensity (**P＜0.01. n＝ 5, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; ROS: Reactive oxygen species; H2DCFDA: 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate; LPS: Lipopolysaccharide; COR40: 40 μmol/L COR.
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图 5 COR抑制NIG刺激的软骨细胞中糖酵解相关信号
Fig. 5 COR inhibits NIG-stimulated glycolytic signal in chondrocytes
A: Expression of HK2, GLUT1 and LDHA proteins in cell lysate detected by Western blotting; B: Quantitative analysis of the grayscale value of the blot bands (*P＜0.05, **P＜0.01. n＝ 3, x±s). COR: Corilagin; NIG: Nigericin; LPS: Lipopolysaccharide; HK2: Hexokinase 2; GLUT1: Glucose transporter 1; LDHA: Lactate dehydrogenase A; COR10: 10 μmol/L COR; COR20: 20 μmol/L COR; COR40: 40 μmol/L COR.
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