海军军医大学学报  2025, Vol. 46 Issue (3): 360-373 |
 PDF |
心力衰竭（以下简称心衰）是由多种心脏疾病引发心室舒缩功能障碍所导致的一组复杂临床综合征，它是各种心血管疾病的危重表现或终末阶段，是21世纪心血管领域的研究壁垒[1]。近10年来，全球在心衰的基础研究及临床治疗方面均取得了诸多进步，药物治疗策略已从纠正血流动力学异常转变为抑制神经内分泌异常激活，器械辅助装置也延长了部分患者的生存期，但心衰人群的总体再住院率和死亡率仍居高不下，且终末期治疗费用高、预后差[2]。全球心衰患者例数高达0.38亿，欧美发达国家成人的心衰患病率为1.0%~2.0%[3-4]。中国成年人心衰患病率为1.3%，约有1 370万例心衰患者，其中左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜50%的患病率为1%，即以LVEF值降低的心衰为主[5]。因此，目前临床上仍迫切需要寻找更多的心衰治疗新靶点。基础研究表明，神经内分泌介导的心肌重塑是心衰发生、发展的主要病理机制，而心肌细胞凋亡是其重要的病理基础，除肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）和交感神经系统激活外，利尿钠肽系统（natriuretic peptide system，NPS）的相对不足也是导致心衰进展的病理因素[2]。一直以来，干预心肌细胞凋亡是防治心衰的重要靶点和关键策略，因此，探究心肌细胞凋亡的分子调控机制具有重要的临床转化意义。
近10年来，全球在心衰治疗方面不断推出新型药物，如沙库巴曲（sacubitril，Sac）/缬沙坦（valsartan，Val）、达格列净、可溶性鸟苷酸环化酶等，其中Sac/Val的临床获益最大，循证医学证据最丰富。Sac/Val是一种具有双重抑制作用的新型钠盐晶体复合物，由脑啡肽酶（neprilysin，NEP）抑制剂Sac和血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT-1受体）拮抗剂Val以摩尔比1∶1结合而成。Sac/Val既可以通过Val高选择性拮抗AT-1受体抑制RAAS的活性，又能通过Sac抑制NEP活性，减少NPS、缓激肽等血管活性物质的降解，增加内源性NPS水平，促进利尿排钠，舒张血管，降低RAAS及交感神经系统活性，减轻心肌纤维化，逆转心室重构，从而改善心功能[6-7]。因此，Sac/Val已被欧美及中国心衰指南推荐为急慢性心衰的优选治疗药物[2, 8-9]，且列为ⅠA类证据推荐使用。目前Sac/Val的临床循证医学证据丰富，但其协同保护心肌、逆转心肌重塑的分子调控机制研究甚少。尽管现有研究已表明Sac/Val具有抑制心肌细胞凋亡、逆转心肌重塑、改善心功能的作用[10-11]，但其调控心肌细胞凋亡的分子机制仍不清楚。本研究利用多柔比星（doxorubicin，DOX）构建心衰兔模型，观察Sac/Val对心衰兔的心脏功能、心肌细胞凋亡及纤维化、NPS及RAAS的影响，并探究Sac/Val保护心肌的作用是否与活化利尿钠肽受体（natriuretic peptide receptor，NPR）-A/环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）/蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）信号通路和抑制RAAS有关，旨在为Sac/Val临床治疗心衰提供更多分子层面的基础研究依据。
1 材料和方法 1.1 实验动物与药物38只8~10周龄清洁级雄性新西兰兔，体重（2.5±0.5）kg，购自上海市松江区车墩实验动物良种场有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0003。本实验方案获得厦门大学附属东南医院伦理委员会审批（编号：DWLL202308）。Sac/Val、Val购自北京诺华制药股份有限公司，DOX购自浙江海正药业股份有限公司。
1.2 试剂与仪器苏木精和伊红染色液（北京益利精细化学品有限公司），TUNEL检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔氨基末端脑利尿钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）、兔血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）ELISA检测试剂盒（武汉科鹿生物科技有限公司），兔高敏心肌肌钙蛋白I（high-sensitivity cardiac troponin I，Hs-cTNI）ELISA检测试剂盒（美国Life Diagnostics公司），马松三色染色液、兔醛固酮（aldosterone，ALD）、兔心房利尿钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、兔脑利尿钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、兔cGMP、兔PKG等ELISA检测试剂盒（上海通蔚实业有限公司），两步法荧光定量PCR试剂盒、TRIzol试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（上海诺伦生物医药技术有限公司），PCR引物、ECL超敏发光液（上海艾博思生物科技有限公司），PVDF转移膜（美国Millipore公司），HRP标记的山羊抗兔IgG（美国Jackson公司），磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element-binding protein，p-CREB）、磷酸化Bcl-2相关死亡促进因子（phosphorylated Bcl-2 related death promoting factor，p-Bad）、Bcl-2、Bax、caspase 3等抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。iU22型心脏彩色多普勒超声仪（荷兰Philips公司，探头频率8 MHz），ST5020多功能染色封片一体机、RM2245切片机、DW4-B型生物显微镜（德国Leica公司），JEM-1220型透射电镜（日本Hitachi公司），Eclipse C1倒置荧光显微镜（日本Nikon公司），Mx3000P型荧光定量PCR仪（美国Agilent公司），DY-B1脱色摇床（上海青浦沪西仪器厂），VE-180垂直电泳槽（上海天能科技有限公司），PowerPacTM HC电泳仪、170-3940型半干转印槽、XR+凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司），Gel-Pro Analyzer分析软件（美国Media Cybernetics公司）。
1.3 方法 1.3.1 心衰动物模型的建立参考既往研究[12]，38只清洁级雄性新西兰兔适应性喂养1周后，采用随机数字表法选取30只进行DOX诱导心衰造模，每次用配制好的1.0 mg/mL DOX溶液以1.25 mg/kg的剂量进行耳缘静脉注射，余下8只为空白组，予等量的生理盐水进行耳缘静脉注射；两组均每周注射2次，连续6周。造模组兔大部分表现为精神萎靡、少动、进食少、脱毛等，其中6只出现DOX注射侧耳内化脓、破溃（中耳炎可能），均采取局部消毒、排脓处理。造模6周后用超声心动图评估心功能并检测NT-proBNP水平，以LVEF＜45%、NT-proBNP水平显著升高判断心衰兔模型成功建立，最终成功制备心衰模型兔25只，死亡4只，未成模1只。
1.3.2 实验分组及干预将25只心衰模型兔随机分为3组：模型组（DOX组，9只）、Val干预组（DOX+Val组，8只）、Sac/Val干预组（DOX+Sac/Val组，8只）；参照文献方法[13]并根据人与动物间体表面积折算得出兔的等效剂量，DOX+Val组每次灌胃Val混悬液4.65 mg/kg，DOX+Sac/Val组每次灌胃Sac/Val混悬液9.3 mg/kg，空白组及DOX组每次灌胃等体积的蒸馏水，各组均每日灌胃2次，连续8周；在药物干预过程中，DOX组死亡3只，DOX+Val组和DOX+Sac/Val组各死亡1只。为了实验数据统一和利于统计分析，故最终空白组、DOX+Val组和DOX+Sac/Val组各随机选取6只实验兔。
1.3.3 超声心动图检查药物干预8周后，实验兔禁食不禁水12 h，称重后经耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mg/kg）麻醉，仰卧位固定，胸前脱毛，用8 MHz高频探头置于左胸骨旁，显示左心室长轴切面，获得M型超声心动图，测定左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVDD）和左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVSD），应用Teichholtz公式计算LVEF和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。连续记录3个心动周期的数据，取其平均值。
1.3.4 标本采集、心脏重量指数测定和组织病理学观察待实验兔心脏功能评估完成后，予腹主动脉采血20 mL，静置、离心，取血清，置于－20 ℃冰箱保存，以备后续ELISA检测相关指标。采血后立即处死兔，快速剪开胸腔并取出心脏，用冰盐水冲洗后于冰上剪除心包膜、血管等组织，滤纸拭干后称量全心重量，剪除左心房及右心后称量左心室重量（left ventricular mass，LVM），分别计算全心重量指数（heart mass index，HMI；HMI＝全心重量/体重）和左心室重量指数（left ventricular mass index，LVMI；LVMI＝左心室重量/体重）。
取兔左心室心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、浸蜡、包埋、切片后，行常规H-E和马松染色、封片，每个标本取5张切片，在光学显微镜下观察心肌组织形态及纤维化情况并采集图像。
1.3.5 透射电镜观察取兔左心室心肌组织，用2.5%戊二醛溶液固定，PBS漂洗3次，经1%锇酸固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋、超薄切片后，每个标本取5张切片，在透射电镜下观察心肌细胞超微结构并采集图像。
1.3.6 TUNEL检测观察取1.3.4项制作的兔左心室心肌组织石蜡切片，常规脱蜡至水后，用蛋白酶K工作液37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5 min×3次，加入破膜工作液常温下孵育25 min，PBS洗涤5 min×3次；参照TUNEL检测试剂盒说明书加入适量染色液，37 ℃孵育3~4 h，PBS洗涤5 min×3次，加入DAPI染液，避光室温孵育10 min，PBS洗涤5 min×3次，甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；在Eclipse C1倒置荧光显微镜下观察并采集图像，用ImageJ软件进行图片分析，计算心肌细胞凋亡率：心肌细胞凋亡率（%）＝TUNEL染色阳性细胞核数量/全部细胞核数量×100%。
1.3.7 ELISA检测取1.3.4项采集的兔血清，严格按照兔ELISA检测试剂盒说明书分别检测NT-proBNP、Hs-cTNI、AngⅡ、ALD、ANP、BNP、cGMP、PKG水平。
1.3.8 qPCR检测取兔左心室心肌组织100 mg，加入TRIzol裂解液研磨、匀浆，提取总RNA，测定RNA浓度、纯度，反转录合成cDNA，按照两步法荧光定量PCR（SYBR Green）试剂盒说明书，用荧光定量PCR仪进行扩增。引物序列：NPR-A正向引物5'-TCTGAACTACAACGGAACTT-3'，反向引物5'-AGACGATGAGAATGCTGAG-3'；cGMP特异性磷酸二酯酶5A[cGMP-specific phosphodiesterase 5A，PDE5A（cGMP）]正向引物5'-AAGCAGGCAAGATTCAGAACAAG-3'，反向引物5'-CTGGGCTGTTTAGAACCATCAA-3'；PKG正向引物5'-GGCTGTCAGAGAAGGAGGAGGAA-3'，反向引物5'-TGTCGCAGGTCGTGGAAGGA-3'；Bcl-2正向引物5'-GTGCGGCCTCTGTCAGACTTCT-3'，反向引物5'-CCGAGGGTGATGCAAGCTCCTA-3'；Bax正向引物5'-TTATGGGCTGGACGCTGGACTT-3'，反向引物5'-AGATGGTGAGTGAGGCGGTGAG-3'；caspase 3正向引物5'-GCCAGAAAATACCGGTTGAA-3'，反向引物5'-GTGGCATCAAGGGAATAGGA-3'；β-肌动蛋白（β-actin）正向引物5'-AGCACCATGAAGATCAAGAT-3'，反向引物5'-CCGACTCGTCATACTCCT-3'。以β-actin为内参，采用2－ΔΔCt法计算NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG、Bcl-2、Bax、caspase 3 mRNA的相对表达量。
1.3.9 蛋白质印迹法检测取兔左心室心肌组织150 mg，加入预冷的RIPA裂解液，匀浆、裂解、离心，提取组织总蛋白；每孔上样25 μg进行SDS-PAGE，电泳分离后，将蛋白质转移至PVDF膜、封闭；加入p-CREB、p-Bad、Bcl-2、Bax、caspase 3抗体（稀释比例均为1∶1 000），以β-actin作为内参照，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤10 min×3次；加入HRP标记的二抗（稀释比例为1∶1 000），37 ℃孵育90 min，TBST洗涤10 min×3次；用ECL超敏发光液处理后，暗室内曝光、显影、固定，用XR+凝胶成像分析系统拍照。用Gel-Pro Analyzer软件进行分析，计算p-CREB、p-Bad、Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值，作为其相对表达量。
1.4 统计学处理应用SPSS 28.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 各组兔心脏重量指数与空白组相比，DOX组兔的HMI、LVMI均升高（均P＜0.01）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔的HMI、LVMI均降低（均P＜0.01），其中DOX+Sac/Val组兔的上述指标又低于DOX+Val组（均P＜0.01）。见图 1。
|
图 1 各组兔的HMI和LVMI比较 Fig 1 Comparison of HMI and LVMI of rabbits in each group **P < 0.01. n＝6, x±s. HMI: Heart mass index; LVMI: Left ventricular mass index; DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
与空白组相比，DOX组兔的LVDD、LVSD均增大（均P＜0.01），LVEF、LVFS均降低（均P＜0.01）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔的LVDD、LVSD均减小（均P＜0.01），LVEF、LVFS均升高（均P＜0.01）；DOX+Sac/Val组兔的上述指标较DOX+Val组差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。见图 2。
|
图 2 各组兔超声心动图检查结果 Fig 2 Echocardiography results of rabbits in each group A: Changes of echocardiography; B-E: Changes of specific parameters of echocardiography. *P < 0.05, **P < 0.01. n＝6, x±s. DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril; LVDD: Left ventricular end-diastolic diameter; LVSD: Left ventricular end-systolic diameter; LVEF: Left ventricular ejection fraction; LVFS: Left ventricular fractional shortening. |
ELISA检测结果（图 3）显示，与空白组相比，DOX组兔血清NT-proBNP、Hs-cTNI水平均升高（均P＜0.01）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔血清NT-proBNP、Hs-cTNI水平均降低（均P＜0.01），其中DOX+Sac/Val组兔的上述指标又均低于DOX+Val组（均P＜0.01）。
|
图 3 各组兔血清NT-proBNP、Hs-cTNI水平比较 Fig 3 Comparison of serum NT-proBNP and Hs-cTNI levels of rabbits in each group **P < 0.01. n＝6, x±s. NT-proBNP: N-terminal brain natriuretic peptide; Hs-cTNI: High-sensitivity cardiac troponin I; DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
H-E染色结果（图 4）显示，空白组兔心肌细胞排列整齐，结构清楚，未见变性、坏死，间质无水肿。DOX组兔心肌细胞排列紊乱，部分坏死，细胞核丢失，肌纤维断裂，间质水肿。DOX+Val组兔心肌细胞排列稍紊乱，肥大、分离，肌纤维部分断裂，细胞核部分丢失，间质稍水肿。DOX+Sac/Val组兔心肌细胞排列相对较齐，结构尚清楚，肌纤维稍紊乱，间质无水肿。
|
图 4 各组兔心肌组织病理形态观察（H-E染色，400×） Fig 4 Pathological morphology of myocardial tissue of rabbits in each group (H-E staining, 400×) H-E: Hematoxylin-eosin; DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
马松染色结果（图 5）显示，空白组兔心肌组织排列整齐，见少量条索状蓝色胶原纤维。DOX组兔心肌组织排列紊乱，纤维化明显，可见大量片状蓝色胶原纤维增生。DOX+Val组兔心肌组织排列稍紊乱，纤维化较DOX组减轻，可见较多小片状蓝色胶原纤维增生。DOX+Sac/Val组兔心肌组织排列较齐，纤维化较DOX组明显减轻，可见散在小灶状或条索状蓝色胶原纤维增生。
|
图 5 各组兔心肌纤维化情况（马松染色，200×） Fig 5 Myocardial fibrosis of rabbits in each group (Masson staining, 200×) DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
透射电镜检查结果（图 6）显示，空白组兔心肌细胞线粒体排列整齐，结构完整，内嵴清晰，肌纤维明暗带清楚；DOX组兔心肌细胞线粒体排列紊乱、肿胀，结构不完整、部分溶解，内嵴严重溶解、断裂，肌纤维严重溶解，明暗带不清；DOX+Val组兔心肌细胞线粒体排列稍紊乱，部分内嵴溶解，肌纤维部分溶解，明暗带清楚；DOX+Sac/Val组兔心肌细胞线粒体排列较齐，无明显肿胀，结构尚完整，大部分内嵴清晰、极少溶解，肌纤维稍溶解，明暗带清楚。
|
图 6 各组兔心肌细胞超微结构（透射电镜，11 500×） Fig 6 Ultrastructure of cardiomyocytes of rabbits in each group (transmission electron microscope, 11 500×) DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
TUNEL检测结果（图 7）显示，与空白组相比，DOX组兔心肌细胞凋亡率升高（P＜0.01）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔心肌细胞凋亡率均降低（均P＜0.01），其中DOX+Sac/Val组兔心肌细胞凋亡率低于DOX+Val组（P＜0.01）。
|
图 7 各组兔心肌细胞凋亡情况 Fig 7 Apoptosis status of cardiomyocytes of rabbits in each group A: TUNEL images; B: The cardiomyocytes apoptosis rate. **P < 0.01. n＝6, x±s. DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril; TUNEL: Terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling; DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole. |
ELISA检测结果（图 8）显示，与空白组相比，DOX组兔血清AngⅡ、ALD、ANP、BNP、cGMP、PKG水平均升高（均P＜0.01）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔血清AngⅡ、ALD、ANP、BNP、cGMP、PKG水平均降低（均P＜0.01）；DOX+Sac/Val组兔血清AngⅡ、ALD水平较DOX+Val组均降低（均P＜0.01），而ANP、BNP、cGMP、PKG水平均升高（均P＜0.01）。
|
图 8 各组兔血清AngⅡ、ALD、ANP、BNP、cGMP、PKG水平比较 Fig 8 Comparison of serum AngⅡ, ALD, ANP, BNP, cGMP, and PKG levels of rabbits in each group **P < 0.01. n＝6, x±s. AngⅡ: AngiotensinⅡ; ALD: Aldosterone; ANP: Atrial natriuretic peptide; BNP: Brain natriuretic peptide; cGMP: Cyclic guanosine monophosphate; PKG: Protein kinase G; DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
qPCR检测结果（图 9）显示，与空白组相比，DOX组兔心肌组织NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG、Bax、caspase 3 mRNA表达均升高（均P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达降低（P＜0.01）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔心肌组织NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG、Bax、caspase 3 mRNA表达均降低（均P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达均升高（均P＜0.01）；DOX+Sac/Val组兔心肌组织Bax、caspase 3 mRNA表达较DOX+Val组均降低（均P＜0.01），而NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG、Bcl-2 mRNA表达均升高（均P＜0.01）。
|
图 9 qPCR检测各组兔心肌组织NPR-A、PDE5A (cGMP)、PKG、Bcl-2、Bax、caspase 3 mRNA的表达 Fig 9 Expression of NPR-A, PDE5A (cGMP), PKG, Bcl-2, Bax and caspase 3 mRNA in myocardial tissue of rabbits in each group detected by qPCR **P < 0.01. n＝6, x±s. qPCR: Quantitative polymerase chain reaction; NPR-A: Natriuretic peptide receptor A; PDE5A (cGMP): cGMP-specific phosphodiesterase 5A; PKG: Protein kinase G; Bcl-2: B-cell lymphoma 2; Bax: Bcl-2 associated X protein; caspase 3: Cysteine aspartate protease 3; DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
蛋白质印迹法检测结果（图 10）显示，与空白组相比，DOX组兔心肌组织p-CREB、Bax、caspase 3蛋白表达均升高（均P＜0.01），Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.01），p-Bad蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与DOX组相比，DOX+Sac/Val组和DOX+Val组兔心肌组织Bax、caspase 3蛋白表达均降低（均P＜0.01），Bcl-2蛋白表达均升高（均P＜0.01），DOX+Sac/Val组兔心肌组织p-CREB、p-Bad蛋白表达均升高（均P＜0.01），而DOX+Val组兔心肌组织p-CREB、p-Bad蛋白表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；与DOX+Val组相比，DOX+Sac/Val组兔心肌组织Bax、caspase 3蛋白表达均降低（均P＜0.01），而p-CREB、p-Bad、Bcl-2蛋白表达均升高（均P＜0.01）。
|
图 10 蛋白质印迹法检测各组兔心肌组织p-CREB、p-Bad、Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白的表达 Fig 10 Expression of p-CREB, p-Bad, Bcl-2, Bax, and caspase 3 proteins in myocardial tissue of rabbits in each group detected by Western blotting **P < 0.01. n＝6, x±s. p-CREB: Phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein; p-Bad: Phosphorylated Bcl-2 related death promoting factor; Bcl-2: B-cell lymphoma 2; Bax: Bcl-2 associated X protein; caspase 3: Cysteine aspartate protease 3; DOX: Doxorubicin; Val: Valsartan; Sac: Sacubitril. |
心衰的发生、发展机制一直是全球心血管领域的研究热点与难点。目前研究认为，以神经内分泌系统异常激活介导的心肌重塑是心衰的主要病理生理机制，而心肌细胞凋亡是其重要的病理基础，是心肌细胞丢失的主要原因，也是心功能走向失代偿的关键环节[2]。凋亡的心肌细胞被大量心肌成纤维细胞及胶原纤维所取代，引起心肌重塑，最终导致心衰，是多种心血管疾病的共同病理改变[14]。探究心肌细胞凋亡的分子调控机制有助于发现关键的靶点并研发干预靶点的有效药物，从而抑制心肌细胞凋亡，为临床改善心功能、延缓心衰进展的治疗提供新方法。
NT-proBNP是目前各国心衰防治指南推荐的重要生物学标志物，为心衰的诊断、病情及临床疗效评估提供了重要的实验室依据，其升高程度与心衰的严重程度呈正相关[15]。Hs-cTnI是特异性的心肌肌钙蛋白，可作为心衰患者的病因诊断和预后评估指标，与心衰病情显著相关，其动态变化是心衰患者预后不良的重要体现[16]。本研究对实验兔进行了心肌组织H-E染色、马松染色及TUNEL检测，观察心肌组织病理形态、纤维化程度及心肌细胞凋亡情况，通过超声心动图检测心脏功能（LVEF、LVFS），并检测NT-proBNP、Hs-cTnI、NPS、RAAS水平及凋亡相关基因和蛋白的表达情况。结果显示，与空白组相比，DOX组兔的血清NT-proBNP、Hs-cTnI水平及心肌细胞凋亡率明显升高，LVEF、LVFS却明显降低，提示心衰病程中存在显著的心肌细胞凋亡，引起心肌细胞大量丢失，加重心肌纤维化，导致心肌重塑，最终引起心脏功能显著下降及心肌损伤，这一结果符合心衰的病理生理改变。与DOX组相比，经Val和Sac/Val（含有同等剂量Val）干预后心衰兔的心肌细胞凋亡率明显降低，且血清NT-proBNP、Hs-cTnI水平也明显下降，而LVEF、LVFS却明显升高，其中DOX+Sac/Val组效果更显著，提示心衰时心肌细胞凋亡程度与心功能存在负相关关系，Sac/Val可有效抑制心衰兔的心肌细胞凋亡、减少心肌细胞丢失，进而减轻心肌纤维化，改善心脏功能，这与相关研究[17-18]结果大致相符。
既往研究表明，RAAS的激活在心衰的心肌重塑中发挥着关键作用，RAAS激活后使AngⅠ转化为AngⅡ并激活ALD[19-20]。AngⅡ是目前公认诱导心肌细胞凋亡的主要效应物质，其主要机制如下：（1）AngⅡ可直接作用于AT-1受体，激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶，促发心肌细胞凋亡；（2）AngⅡ可通过刺激血管平滑肌细胞分泌血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和内皮素等，进而影响凋亡相关基因如同型半胱氨酸诱导基因2、p21、p27、p38、p53等的表达而促进心肌细胞凋亡；（3）AngⅡ与AT-1受体相结合后还促使线粒体Bax的表达增多，Bcl-2表达减少且功能下降，Bax/Bcl-2比值增高，促进心肌细胞凋亡[21]。ALD引起心肌重塑的一个重要机制也是诱发心肌细胞凋亡。研究表明，ALD可诱导心肌细胞Ca2+内流增加，激活钙蛋白酶，进而活化Bid，引起细胞色素C从线粒体释放，从而诱导caspase 3活化，最终导致心肌细胞凋亡[22]；ALD还可上调心肌氧化应激水平，过多活性氧可上调Bax表达，下调Bcl-2表达，促进线粒体通路介导的心肌细胞凋亡[23-24]。本研究结果显示，DOX组兔AngⅡ、ALD水平和Bax、caspase 3的表达均较空白组明显升高，Bcl-2的表达明显降低，其心肌细胞凋亡也明显加重，提示心衰进程中存在RAAS的激活，促进AngⅡ、ALD分泌增多，诱导心肌细胞凋亡；而经Val和Sac/Val干预的心衰兔的AngⅡ、ALD水平和Bax、caspase 3的表达均较DOX组明显降低，Bcl-2的表达明显升高，心肌细胞凋亡也明显减少，其中DOX+Sac/Val组的效果更显著。上述结果提示Val通过阻断AT-1受体降低AngⅡ、ALD水平，进而降低Bax、caspase 3的表达，上调Bcl-2的表达，从而减少心肌细胞凋亡，与既往研究[25-26]结果相似。至于DOX+Sac/Val组减少心肌细胞凋亡的效果明显优于DOX+Val组，与其含有的另一成分Sac通过抑制NEP活性减少NPS降解、升高内源性NPS浓度有关。
NPS是神经内分泌系统的另一重要成员，主要包括ANP、BNP、C型利尿钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）和3种对应受体NPR-A、NPR-B和NPR-C，ANP、BNP主要由心房和心室的心肌细胞分泌，CNP主要由血管内皮细胞分泌，循环中的CNP浓度非常低[27]。研究发现，ANP、BNP均可有效结合NPR-A催化鸟苷三磷酸形成cGMP，而cGMP是细胞内重要的第二信使，其信号转导的主要介质是PKG，PKG可使下游多种细胞内蛋白质磷酸化而发挥多种心血管保护作用[28]。NPS主要是被NEP降解，NEP抑制剂通过抑制NEP减少对NPS的降解从而增加内源性NPS浓度，升高的ANP、BNP与NPR-A有效结合后通过鸟苷酸环化酶促进cGMP的生成，进一步激活cGMP/PKG通路；cGMP/PKG信号通路广泛存在于心肌细胞内，其参与心衰的重要机制之一是抑制心肌细胞凋亡，细胞内PKG升高后可进一步磷酸化CREB和Bad，p-CREB使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加，而p-Bad降低细胞色素C的释放，最终两者一起降低caspase 3的表达从而抑制心肌细胞凋亡[29]。本研究结果显示，DOX组兔的ANP、BNP、cGMP、PKG水平及NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG、p-CREB的表达均较空白组升高，这与心衰时左心负荷增加导致左心房和左心室心肌细胞分泌的ANP、BNP增多有关，但其Bax、caspase 3的表达和心肌细胞凋亡程度非但没有降低却反而明显升高，Bcl-2的表达明显降低，这可能与心衰时NPS病理性升高的程度远远不足以抵抗RAAS的激活有关；而经Val干预的心衰兔虽然p-CREB、p-Bad的表达与DOX组比较无明显差异，但Bax、caspase 3的表达和心肌细胞凋亡程度却有明显降低，Bcl-2的表达也明显升高，这可能与Val通过阻断AT-1受体降低AngⅡ及ALD水平起到抑制RASS激活，进而下调Bax、caspase 3的表达，上调Bcl-2的表达，从而减轻心肌细胞凋亡、改善心功能有关，而心功能的改善又反馈性降低心衰兔的ANP、BNP、cGMP、PKG水平及NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG的表达；经Sac/Val干预后心衰兔的p-CREB、p-Bad、Bcl-2的表达均较DOX组明显升高，Bax、caspase 3的表达和心肌细胞凋亡程度均明显降低，该效果明显优于DOX+Val组，而ANP、BNP、cGMP、PKG水平及NPR-A、PDE5A（cGMP）、PKG的表达均较DOX+Val组明显升高，其原因可能是Sac/Val中另一成分Sac可抑制NEP活性，减少NPS降解、升高血清ANP和BNP浓度，而ANP、BNP与NPR-A结合后激活cGMP/PKG通路，进而抑制线粒体凋亡通路、减少心肌细胞凋亡，这一结果与相关文献报道[30-31]相似。
综上所述，本研究通过构建DOX诱导的心衰兔模型，观察了Sac/Val对心衰兔的心脏功能、心肌细胞凋亡、RAAS、NPS及NPR-A/cGMP/PKG通路的影响，结果提示Sac/Val中Sac和Val这2种成分协同作用，在阻断RAAS的同时上调NPS，从而双重抑制心肌细胞凋亡：Sac可通过抑制NEP活性减少NPS的降解，而增多的内源性ANP、BNP进一步激活NPR-A/cGMP/PKG信号通路，上调p-CREB、p-Bad的表达，从而降低Bax、caspase 3的表达，上调Bcl-2的表达；Val可通过高选择性阻断AT-1受体，抑制AngⅡ生成及AngⅡ依赖性ALD的释放，从而降低Bax、caspase 3的表达，上调Bcl-2的表达。Sac和Val两者协同抑制线粒体凋亡通路的表达，减少心肌细胞凋亡，从而减轻心肌纤维化，最终逆转心肌重塑、改善心脏功能。
本研究存在一定的局限性：（1）未进一步行NPR-A/cGMP/PKG分子通路抑制剂的干预；（2）心肌重塑是一个复杂的过程，未进一步探讨心肌纤维化的相关机制；（3）采用DOX建模，未在DOX导致心脏毒性的常见机制——氧化应激方面做相关探讨。未来课题组拟进一步完善分子通路抑制剂的干预及纤维化机制研究，拟从氧化应激方面进一步探究Sac/Val与心肌细胞凋亡的相关性。
| [1] |
AMBROSY A P, FONAROW G C, BUTLER J, et al. The global health and economic burden of hospitalizations for heart failure: lessons learned from hospitalized heart failure registries[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(12): 1123-1133. DOI:10.1016/j.jacc.2013.11.053 |
| [2] |
MCDONAGH T A, METRA M, ADAMO M, et al. 2021 ESC guidelines for the diagnosis and treatment of years acute and chronic heart failure[J]. Eur Heart J, 2021, 42(36): 3599-3726. DOI:10.1093/eurheartj/ehab368 |
| [3] |
GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet, 2018, 392(10159): 1789-1858. DOI:10.1016/S0140-6736(18)32279-7 |
| [4] |
VIRANI S S, ALONSO A, BENJAMIN E J, et al. Heart disease and stroke statistics－2020 update: a report from the American Heart Association[J]. Circulation, 2020, 141(9): e139-e596. DOI:10.1161/CIR.0000000000000757 |
| [5] |
HAO G, WANG X, CHEN Z, et al. Prevalence of heart failure and left ventricular dysfunction in China: the China Hypertension Survey, 2012-2015[J]. Eur J Heart Fail, 2019, 21(11): 1329-1337. DOI:10.1002/ejhf.1629 |
| [6] |
VOLPE M, BAUERSACHS J, BAYÉS-GENÍS A, et al. Sacubitril/valsartan for the management of heart failure: a perspective viewpoint on current evidence[J]. Int J Cardiol, 2021, 327: 138-145. DOI:10.1016/j.ijcard.2020.11.071 |
| [7] |
BOZKURT B, NAIR A P, MISRA A, et al. Neprilysin inhibitors in heart failure: the science, mechanism of action, clinical studies, and unanswered questions[J]. JACC Basic Transl Sci, 2022, 8(1): 88-105. DOI:10.1016/j.jacbts.2022.05.010.Cardiology |
| [8] |
HEIDENREICH P A, BOZKURT B, AGUILAR D, et al. 2022 AHA/ACC/HFSA guideline for the management of heart failure: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on clinical practice guidelines[J]. Circulation, 2022, 145(18): e895-e1032. DOI:10.1161/CIR.0000000000001063 |
| [9] |
中华医学会心血管病学分会, 中国医师协会心血管内科医师分会, 中国医师协会心力衰竭专业委员会, 等. 中国心力衰竭诊断和治疗指南2024[J]. 中华心血管病杂志, 2024, 52(3): 235-275. DOI:10.3760/cma.j.cn112148-20231101-00405 |
| [10] |
BURKE R M, LIGHTHOUSE J K, MICKELSEN D M, et al. Sacubitril/valsartan decreases cardiac fibrosis in left ventricle pressure overload by restoring PKG signaling in cardiac fibroblasts[J]. Circ Heart Fail, 2019, 12(4): e005565. DOI:10.1161/CIRCHEARTFAILURE.118.005565 |
| [11] |
VON LUEDER T G, WANG B H, KOMPA A R, et al. Angiotensin receptor neprilysin inhibitor LCZ696 attenuates cardiac remodeling and dysfunction after myocardial infarction by reducing cardiac fibrosis and hypertrophy[J]. Circ Heart Fail, 2015, 8(1): 71-78. DOI:10.1161/CIRCHEARTFAILURE.114.001785 |
| [12] |
CHEN X, CAI H, CHEN Q, et al. Effects of Wenyangzhenshuai granule on ERK1/2 and ERK5 activity in the myocardial tissue in a rabbit model of adriamycin-induced chronic heart failure[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(11): 20732-20741. |
| [13] |
TORRADO J, CAIN C, MAURO A G, et al. Sacubitril/valsartan averts adverse post-infarction ventricular remodeling and preserves systolic function in rabbits[J]. J Am Coll Cardiol, 2018, 72(19): 2342-2356. DOI:10.1016/j.jacc.2018.07.102 |
| [14] |
STRATTON M S, MCKINSEY T A. Epigenetic regulation of cardiac fibrosis[J]. J Mol Cell Cardiol, 2016, 92: 206-213. DOI:10.1016/j.yjmcc.2016.02.011 |
| [15] |
BOOTH R A, HILL S A, DON-WAUCHOPE A, et al. Performance of BNP and NT-proBNP for diagnosis of heart failure in primary care patients: a systematic review[J]. Heart Fail Rev, 2014, 19(4): 439-451. DOI:10.1007/s10741-014-9445-8 |
| [16] |
DE BOER R A, PINTO Y M, VAN VELDHUISEN D J. The imbalance between oxygen demand and supply as a potential mechanism in the pathophysiology of heart failure: the role of microvascular growth and abnormalities[J]. Microcirculation, 2003, 10(2): 113-126. DOI:10.1038/sj.mn.7800188 |
| [17] |
GE Q, ZHAO L, REN X M, et al. LCZ696, an angiotensin receptor-neprilysin inhibitor, ameliorates diabetic cardiomyopathy by inhibiting inflammation, oxidative stress and apoptosis[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2019, 244(12): 1028-1039. DOI:10.1177/1535370219861283 |
| [18] |
KIM B S, PARK I H, LEE H, et al. Sacubitril/valsartan reduces endoplasmic reticulum stress in a rat model of doxorubicin-induced cardiotoxicity[J]. Arch Toxicol, 2022, 96(4): 1065-1074. DOI:10.1007/s00204-022-03241-1 |
| [19] |
BARAUNA V G, MAGALHAES F C, KRIEGER J E, et al. AT1 receptor participates in the cardiac hypertrophy induced by resistance training in rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2008, 295(2): R381-R387. DOI:10.1152/ajpregu.00933.2007 |
| [20] |
国家卫生计生委合理用药专家委员会, 中国药师协会. 心力衰竭合理用药指南(第2版)[J]. 中国医学前沿杂志(电子版), 2019, 11(7): 1-78. DOI:10.12037/YXQY.2019.07-01 |
| [21] |
RE R N. Role of intracellular angiotensin Ⅱ[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2018, 314(4): H766-H771. DOI:10.1152/ajpheart.00632.2017 |
| [22] |
PARRA V, MORAGA F, KUZMICIC J, et al. Calcium and mitochondrial metabolism in ceramide-induced cardiomyocyte death[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1832(8): 1334-1344. DOI:10.1016/j.bbadis.2013.04.009 |
| [23] |
DIKALOVA A E, PANDEY A, XIAO L, et al. Mitochondrial deacetylase Sirt3 reduces vascular dysfunction and hypertension while Sirt3 depletion in essential hypertension is linked to vascular inflammation and oxidative stress[J]. Circ Res, 2020, 126(4): 439-452. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.119.315767 |
| [24] |
YAN F, ZHU H, HE Y, et al. Combination of tolvaptan and valsartan improves cardiac and renal functions in doxorubicin-induced heart failure in mice[J]. Eur J Histochem, 2022, 66(4): 3563. DOI:10.4081/ejh.2022.3563 |
| [25] |
郑博宇, 俸艳英, 阳志军. 缬沙坦对阿霉素所致心肌损伤保护作用的相关机制研究[J]. 广西医科大学学报, 2019, 36(4): 533-537. DOI:10.16190/i.cnki.45-1211/r.2019.04.009 |
| [26] |
SAKR H F, ABBAS A M, ELSAMANOUDY A Z. Effect of valsartan on cardiac senescence and apoptosis in a rat model of cardiotoxicity[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2016, 94(6): 588-598. DOI:10.1139/cjpp-2015-0461 |
| [27] |
TSUTSUI H, ALBERT N M, COATS A J S, et al. Natriuretic peptides: role in the diagnosis and management of heart failure: a scientific statement from the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology, Heart Failure Society of America and Japanese Heart Failure Society[J]. Eur J Heart Fail, 2023, 25(5): 616-631. DOI:10.1002/ejhf.2848 |
| [28] |
NUMATA G, TAKIMOTO E. Cyclic GMP and PKG signaling in heart failure[J]. Front Pharmacol, 2022, 13: 792798. DOI:10.3389/fphar.2022.792798 |
| [29] |
SARZANI R, ALLEVI M, DI PENTIMA C, et al. Role of cardiac natriuretic peptides in heart structure and function[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(22): 14415. DOI:10.3390/ijms232214415 |
| [30] |
HU F, YAN S, LIN L, et al. Sacubitril/valsartan attenuated myocardial inflammation, fibrosis, apoptosis and promoted autophagy in doxorubicin-induced cardiotoxicity mice via regulating the AMPKα-mTORC1 signaling pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2025, 480(3): 1891-1908. DOI:10.1007/s11010-024-05117-7 |
| [31] |
MIYOSHI T, NAKAMURA K, AMIOKA N, et al. LCZ696 ameliorates doxorubicin-induced cardiomyocyte toxicity in rats[J]. Sci Rep, 2022, 12(1): 4930. DOI:10.1038/s41598-022-09094-z |
