2025, Vol. 46
表 1
(Tab 1)
连续低强度脉冲式超声联合微泡空化治疗促进小鼠缺血骨骼肌微循环灌注效果的初步评价
引用本文
刘奕佳, 汤晓轶, 李尚泽, 赵佳琦. 连续低强度脉冲式超声联合微泡空化治疗促进小鼠缺血骨骼肌微循环灌注效果的初步评价[J]. 海军军医大学学报, 2025, 46(3): 336-343 
LIU Yijia, TANG Xiaoyi, LI Shangze, ZHAO Jiaqi. Continuous low-intensity pulsed ultrasound combined with microbubble cavitation therapy promoting microcirculatory perfusion in ischemic skeletal muscle of mice: a preliminary result[J]. Academic Journal of Naval Medical University, 2025, 46(3): 336-343 (in Chinese with English abstract)
连续低强度脉冲式超声联合微泡空化治疗促进小鼠缺血骨骼肌微循环灌注效果的初步评价
1. 海军军医大学(第二军医大学)第二附属医院超声诊断科, 上海 200003;
2. 同济大学附属上海市第四人民医院超声医学科, 上海 200434;
3. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院常州医疗区骨科, 常州 213000
2. 同济大学附属上海市第四人民医院超声医学科, 上海 200434;
3. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院常州医疗区骨科, 常州 213000
摘要: 目的 评价连续低强度脉冲式超声（LIPUS）联合微泡（MB）的空化治疗（以下简称超声空化治疗）促进小鼠缺血后肢微循环灌注的效果，初步探讨该治疗方式对肢体动脉缺血性损伤的无创治疗潜力。方法 构建小鼠左后肢缺血模型，按照不同治疗方法将小鼠随机分为4组（每组16只）：模型组、MB组、LIPUS组和超声空化治疗组（LIPUS+MB组）。模型组小鼠经尾静脉注射0.1 mL生理盐水，MB组小鼠经尾静脉注射0.1 mL MB，LIPUS组小鼠在经尾静脉注射0.1 mL生理盐水的同时采用LIPUS对缺血后肢进行治疗，LIPUS+MB组小鼠在经尾静脉注射0.1 mL MB的同时采用LIPUS对缺血后肢进行治疗；各组均每天注射1次，共7 d。在治疗的第1、4、7天，通过超声造影评价小鼠缺血后肢的微循环灌注情况，并结合小鼠后肢腓肠肌组织H-E染色和CD31免疫组织化学染色，评估不同治疗对小鼠缺血后肢微循环灌注的促进效果。结果 小鼠左后肢缺血模型构建成功，所有的模型小鼠均表现出明显的缺血微循环灌注障碍，模型稳定性良好。治疗第7天结束后，LIPUS+MB组小鼠缺血后肢微循环灌注水平升高，其缺血侧与非缺血侧微血管流量比值高于LIPUS组[（94.33±4.51）% vs（70.33±2.09）%，P＜0.05]；H-E染色结果显示，LIPUS+MB组腓肠肌组织新生毛细血管和肌成纤维细胞数量增加，肌肉结构修复优于LIPUS组，而模型组和MB组则表现为肌细胞坏死、肌束排列紊乱及毛细血管稀疏；CD31免疫组织化学分析进一步证实，超声空化治疗在促进缺血骨骼肌微循环灌注、微血管新生和组织修复方面显著优于单纯LIPUS治疗（CD31相对表达水平5.03±0.33 vs 3.57±0.21，P＜0.01）。结论 与单纯LIPUS治疗相比，连续超声空化治疗在促进小鼠缺血后肢的微循环灌注方面表现出更加显著的效果，为外周动脉缺血性疾病所致肢体骨骼肌微循环灌注障碍提供了新的治疗策略。
关键词:
微泡空化治疗 低强度脉冲式超声波治疗 超声造影 微循环灌注 外周动脉疾病
Continuous low-intensity pulsed ultrasound combined with microbubble cavitation therapy promoting microcirculatory perfusion in ischemic skeletal muscle of mice: a preliminary result
1. Department of Ultrasound, The Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200003, China;
2. Department of Ultrasound, Shanghai Fourth People's Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200434, China;
3. Department of Orthopedics, Changzhou Medical Branch, No. 904 Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA, Changzhou 213000, Jiangsu, China
2. Department of Ultrasound, Shanghai Fourth People's Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai 200434, China;
3. Department of Orthopedics, Changzhou Medical Branch, No. 904 Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA, Changzhou 213000, Jiangsu, China
Abstract: Objective To evaluate the promoting effect of continuous low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) combined with microbubble (MB) cavitation therapy (hereinafter referred to as ultrasound cavitation therapy) on microcirculatory perfusion in the ischemic hindlimbs of mice, and to explore the non-invasive therapeutic potential of this treatment for limb arterial ischemic injury. Methods A mouse model of left hindlimb ischemia was established, and the mice were randomly assigned to 4 groups (16 mice per group) according to different treatment methods: model group, ultrasound contrast microbubble group (MB group), LIPUS treatment group (LIPUS group), and ultrasound cavitation therapy group (LIPUS+MB group). Mice in the model group were injected with 0.1 mL of normal saline via the tail vein, those in the MB group were injected with 0.1 mL of MB via the tail vein, those in the LIPUS group were treated with LIPUS on the ischemic hindlimb after injection of 0.1 mL of normal saline via the tail vein, and those in the LIPUS+ MB group were treated with LIPUS on the ischemic hindlimb after injection of 0.1 mL of MB via the tail vein; each group was injected once a day for a total of 7 d. On the 1st, 4th and 7th days after treatment, the microcirculatory perfusion in the ischemic hindlimbs of mice was evaluated using contrast-enhanced ultrasound. The effects of different treatments on promoting microcirculatory perfusion in the ischemic hindlimbs of mice were assessed by combining hematoxylin-eosin (H-E) staining and CD31 immunohistochemical staining of the gastrocnemius muscle tissue in the hindlimbs. Results The left hindlimb ischemia model was successfully constructed, and all model mice showed obvious ischemic microcirculation perfusion disorders with good model stability. After the 7th day of treatment, the LIPUS+MB group showed a increase in microcirculation perfusion in the ischemic hindlimb, with the ratio of microvascular flow on the ischemic to non-ischemic sides higher than that of the LIPUS group ([94.33±4.51]% vs[70.33±2.09]%, P < 0.05). H-E staining results showed that the LIPUS+MB group had more newly formed capillaries and myofibroblasts in the gastrocnemius muscle, with better muscle structure repair compared to the LIPUS group, while the model group and MB group showed muscle cell necrosis, disorganized arrangement of muscle bundles, and sparse capillaries. CD31 immunohistochemical analysis further confirmed that ultrasonic cavitation therapy significantly outperformed traditional LIPUS treatment in promoting microcirculation perfusion, microvascular neogenesis, and tissue repair in ischemic skeletal muscles (CD31 relative expression level 5.03±0.33 vs 3.57±0.21, P < 0.01). Conclusion Compared with single LIPUS treatment, continuous ultrasound cavitation therapy has a more significant effect on promoting microcirculation perfusion in the ischemic hindlimb of mice, which provides a new strategy for microcirculatory perfusion disorders in skeletal muscles of limbs caused by peripheral arterial ischemic diseases.
Key words:
microbubble cavitation therapy low-intensity pulsed ultrasound shockwave therapy contrast-enhanced ultrasound microcirculatory perfusion peripheral arterial disease
外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）主要是指除冠状动脉和颅内动脉以外的动脉系统发生狭窄、闭塞或功能障碍，导致远端肢体微循环灌注异常，进而引发一系列临床症状的疾病[1]。PAD临床上多表现为间歇性跛行、静息痛和肢体溃疡等，严重时可能致残，影响患者的生活质量[1]。尽管药物疗法和外科手术能在一定程度上缓解症状，但治疗过程中的潜在风险及手术并发症等问题仍不容忽视[2]。因此，探索一种更高效、安全、无创的治疗方法，解决由肢体缺血引发的微循环灌注障碍问题，对于促进病患的康复具有至关重要的意义。
低强度脉冲式超声（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）是一种新兴的非侵入性治疗技术，其通过将脉冲式的超声能量作用于目标区域，有效促进了局部组织的修复与再生，同时还避免了对周围正常组织的损伤，展现出独特的治疗优势[3-5]。然而，在处理区域广泛、病程较长的微循环障碍类疾病时，LIPUS的治疗往往难以达到预期效果[6]。研究表明，在LIPUS作用下，微泡（microbubble，MB）会发生空化现象[7]。基于这一机制，LIPUS通过激发MB在血液循环中的惯性空化，激活嘌呤能信号通路，促进一氧化氮和前列腺素的合成，增强内皮依赖性血管扩张，从而有效改善缺血组织的血流灌注[8-9]。与单纯使用LIPUS治疗相比，LIPUS联合MB的空化治疗（以下简称超声空化治疗）在促进缺血组织微循环灌注方面具有显著优势[10-11]。此外，与外科手术等治疗手段相比，超声空化治疗不仅能有效促进微循环灌注，还能更好地确保能量控制的安全性[12]。因此，超声空化治疗为PAD类疾病提供了新的非侵入性治疗选择，为临床治疗开辟了新思路。
在超声空化治疗领域，苏州飞依诺科技股份有限公司独创了专为空化治疗而设计的V-flash超声治疗模式[13]，该模式可通过调节与空化治疗相关的探头中心频率（frequency，F）、脉冲长度（pulse length，PL）、脉冲重复频率（pulse repetition frequency，PRF）等参数，精确调整占空比，从而调控空化治疗过程中的能量密度，优化治疗效果[7]。基于此，本研究针对临床常见PAD所致微循环灌注障碍的病理生理特点，拟建立小鼠左后肢缺血模型，利用苏州飞依诺科技股份有限公司生产的数字化彩色超声诊断仪的V-flash空化治疗模式，对连续超声空化治疗促进小鼠缺血后肢的微循环灌注障碍效果进行初步评价，以期为PAD所致肢体缺血骨骼肌微循环灌注障碍提供新的治疗策略，并为实现该类疾病的无创诊疗一体化提供新的解决方案。
1 材料和方法 1.1 动物模型建立与分组SPF级雄性ICR小鼠64只，6~8周龄，体重35~45 g，购自上海雷根生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2024-0004，使用许可证号：SYXK（沪）2022-0011。实验过程中对动物的处置符合国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》，所有动物实验均经海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院动物伦理委员会审查批准（20ZR1457900）。
ICR小鼠经适应性饲养1周后，建立左后肢缺血模型（0 d）。小鼠用0.375%戊巴比妥钠溶液腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，对小鼠左侧腹股沟及双后肢进行脱毛处理并消毒。在左腹股沟做一斜行切口，分离股动脉、股静脉，在股动脉皮支和肌动脉肌支的分支发出点远端1~2 mm处以5-0缝线结扎股动脉，然后缝合切口。随后使用小鼠尾静脉注射显像仪（WL-DXQ型，天津北瑞未来科技有限公司）经尾静脉注射超声造影剂0.1 mL（Sonazoid®，美国GE公司；约2×108个MB悬浮于0.1 mL生理盐水中），采集超声造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）图像数据，评估造模小鼠双侧后肢血供状态。
按照不同的治疗方式将小鼠随机分为4组，每组16只：模型组、MB组、LIPUS治疗组（LIPUS组）、超声空化治疗组（LIPUS+MB组）。模型组小鼠经尾静脉注射0.1 mL生理盐水，MB组小鼠经尾静脉注射0.1 mL MB，LIPUS组小鼠在经尾静脉注射0.1 mL生理盐水的同时采用LIPUS对缺血左后肢进行治疗，LIPUS+MB组小鼠在经尾静脉注射0.1 mL MB的同时采用LIPUS对缺血左后肢进行治疗；各组均每天注射1次，共7 d。以上各组分别于治疗的第1、4、7天，随机选取4只小鼠在治疗后2 h对双侧后肢腓肠肌对称部位进行二维超声及CEUS扫查，并定量评估，随后颈椎脱臼处死小鼠，取双侧后肢腓肠肌进行组织病理学观察。
1.2 超声空化治疗与CEUS数据采集使用苏州飞依诺科技股份有限公司生产的G86型数字化彩色超声诊断仪。将超声诊断仪调整至V-flash空化治疗模式，S1-8C探头通过固定装置纵向固定于小鼠左后肢上方，在注射MB的同时，开始空化治疗。治疗参数：F＝1.7 MHz，PRF＝3 000 Hz，机械指数（machine index，MI）＝0.6，PL为17.5个周期，每个周期后间歇3 s，以开/关模式进行治疗，持续20 min（对应占空比为3%）。之后使用X4-12L探头进行二维超声和CEUS扫描并采集数据，CEUS成像参数：F＝4.0 MHz，MI＝0.12。将探头横向固定于小鼠双后肢上方，以胫骨为骨性标志选取对称部位横断面，经尾静脉注射MB的同时进行30 s数据采集。为避免CEUS成像评估时出现数据差异，在同一只小鼠进行空化治疗和数据采集之间设置2 h间隔，确保CEUS成像时微循环中的MB代谢完全。
1.3 CEUS定量评估以1 Hz速率采集所有CEUS视频的时间-强度曲线数据，使用OriginPro 2022软件将其拟合至函数y＝A（1－e－βt），式中y是时间t处的强度，A表示相对微血管血容量的平台强度，速率常数β是微血管通量（microvascular blood flow，MBF）率[15]。MBF通过A与β的乘积来量化[14]。为了避免小鼠间的个体差异，实验中利用分析程序对同一只小鼠双侧后肢对称部位腓肠肌的CEUS视频进行感兴趣区（region of interest，ROI）对照分析，通过计算缺血侧（左）与非缺血侧（右）的MBF比值（MBFL/R）对不同治疗方式的疗效进行初步评估。
1.4 小鼠后肢腓肠肌H-E染色各组小鼠治疗结束后通过颈椎脱臼处死，取腓肠肌组织，用4%多聚甲醛溶液冲洗并固定。固定后的样本经二甲苯透明化（20 min共2次）、梯度乙醇脱水（100%、95%、80%、75%，各5 min）后，进行石蜡包埋。最后，将样本切成连续5 μm厚切片，贴于载玻片上以备后续染色。将石蜡切片脱蜡水洗后使用H-E染色试剂盒（北京索莱宝医疗科技有限公司）染色后，脱水、封片并镜下观察。
1.5 小鼠后肢腓肠肌CD31免疫组织化学染色将小鼠腓肠肌石蜡切片脱蜡水洗后，用5%牛血清白蛋白溶液（北京碧云天生物技术股份有限公司）封闭非特异性结合位点。加入兔抗CD31抗体（英国Abcam公司，稀释比例1∶2 000）4 ℃孵育过夜。次日，加入山羊抗兔二抗（英国Abcam公司，稀释比例1∶1 000）室温孵育50 min。使用DAB显色试剂盒（北京碧云天生物技术股份有限公司）显色后，苏木精复染细胞核，随后进行脱水、透明化和封片处理，最后使用ECLIPSE Ci-L光学显微镜（日本Nikon公司）进行观察、拍照。采用ImageJ 1.53t软件对免疫组织化学染色切片进行CD31相对表达水平分析，评估微血管密度。
1.6 统计学处理应用GraphPad Prism 9.0.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示。对于满足方差齐性的数据，采用单因素方差分析，通过Bonferroni校正评估组间差异。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 基于CEUS数据评估小鼠左后肢缺血模型的稳定性通过对各组小鼠双侧后肢腓肠肌的CEUS数据进行定量分析，评估小鼠左后肢缺血模型的稳定性。结果显示，左后肢缺血小鼠造模完成后，模型组小鼠的MBFL/R为（28.33±7.02）%，MB组为（28.00±6.56）%，LIPUS组为（26.00±7.21）%，LIPUS+MB组为（30.00±5.29）%，各组间两两比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），表明手术造模后各组的MBFL/R值在治疗前保持了一致性，说明建立的小鼠左后肢缺血模型的稳定性良好。
2.2 CEUS动态评估小鼠缺血左后肢治疗后的微循环变化第1天治疗结束后，对各组小鼠进行CEUS扫查评估微循环灌注情况。如图 1所示，模型组和MB组小鼠缺血左后肢在约6 s时观察到MB开始进入，且两组小鼠缺血左后肢的ROI时间-强度曲线的峰值强度相似。相比之下，LIPUS组小鼠缺血左后肢在约4 s时即能观察到少量MB进入；而LIPUS+MB组小鼠则在约4 s时即出现了明显的MB进入现象，且ROI时间-强度曲线的峰值强度高于其他组。
|
图 1 第1天治疗后各组小鼠双侧后肢CEUS对比观察 Fig 1 CEUS observation of bilateral hindlimbs of mice in each group on the 1st day after treatment On the 1st day after treatment, the CEUS imaging of the left hindlimb of ischemic mice showed that the contrast MBs in the model group and MB group entered at about 6 s, and the LIPUS group and LIPUS+MB group entered at about 4 s. Compared with the other groups of mice, the LIPUS+MB group had the highest peak intensity of contrast. The CEUS imaging of the right hindlimb of ischemic mice showed that the contrast MBs in each group entered at about 4 s. CEUS: Contrast-enhanced ultrasound; MB: Microbubble; LIPUS: Low-intensity pulsed ultrasound; 2D US: 2-dimensional ultrasound; L: Left; R: Right. |
2.3 MBFL/R定量分析治疗后小鼠缺血左后肢微循环灌注的变化
如表 1所示，在治疗第1天，LIPUS组和LIPUS+MB组小鼠缺血左后肢的MBFL/R高于模型组（均P＜0.05），而MB组与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。随着治疗次数的增加，在治疗第4天、第7天，LIPUS组和LIPUS+MB组小鼠的MBFL/R均高于模型组（均P＜0.01），且LIPUS+MB组的MBFL/R增幅高于LIPUS组（均P＜0.05），说明LIPUS+MB组、LIPUS组的治疗方式均可有效促进小鼠缺血左后肢的微循环灌注，且超声空化治疗促进缺血骨骼肌微循环灌注的疗效优于单独使用LIPUS。
|
表 1 治疗期间各组小鼠缺血左后肢MBFL/R对比 Tab 1 MBFL/R value of ischemic left hindlimb of mice in each group during treatment |
如图 2所示，在整个治疗过程中，MB组和模型组小鼠的缺血左后肢MBFL/R差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与造模后（0 d）相比，治疗第1天时，LIPUS组和LIPUS+MB组小鼠的缺血左后肢MBFL/R均增加（均P＜0.01）。LIPUS组的MBFL/R在治疗第1天、第4天和第7天均有不同程度的增加，但不同时间点间的差异无统计学意义（均P＞0.05）。LIPUS+MB组小鼠的缺血左后肢MBFL/R持续增高，治疗第7天的MBFL/R与第4天相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，超声空化治疗促进小鼠缺血骨骼肌微循环灌注的疗效随治疗次数的增加逐步加强。
|
图 2 治疗期间各组小鼠缺血左后肢的MBFL/R Fig 2 MBFL/R value of ischemic left hindlimb of mice in each group during treatment A: Model group; B: MB group; C: LIPUS group; D: LIPUS+MB group. *P < 0.05, **P < 0.01. n＝16, x±s. MBFL/R: Ratio of microvascular blood flow on the ischemic side (left) to that on the non-ischemic side (right); MB: Microbubble; LIPUS: Low-intensity pulsed ultrasound. |
2.4 病理学评估小鼠缺血左后肢腓肠肌的微观结构变化 2.4.1 H-E染色结果
如图 3所示，在治疗的第7天，与小鼠健侧右后肢腓肠肌相比，模型组和MB组小鼠的缺血左后肢腓肠肌表现出明显的肌细胞数量减少、肌细胞裂解坏死，肌束排列紊乱、间距变宽，毛细血管稀疏。而在LIPUS+MB组的切片中，可观察到大量新生毛细血管和肌成纤维细胞，表明该组具有较为明显的组织修复反应。LIPUS组亦可见新生毛细血管及肌成纤维细胞，但其数量和分布相较于LIPUS+MB组较少。结果表明超声空化治疗在促进血管生成和组织修复方面具有更为显著的效果。
|
图 3 治疗后各组小鼠双侧后肢腓肠肌H-E染色结果 Fig 3 H-E staining results of bilateral hindlimb gastrocnemius muscles of mice in each group after treatment A: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the model group; B: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the MB group; C: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the LIPUS group; D: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the LIPUS+MB group; E: Healthy right posterior gastrocnemius muscle of mice. H-E: Hematoxylin-eosin; MB: Microbubble; LIPUS: Low-intensity pulsed ultrasound. |
2.4.2 CD31免疫组织化学染色结果
如图 4所示，在治疗的第7天，LIPUS+MB组小鼠的缺血左后肢腓肠肌组织中CD31阳性表达（棕黄色染色颗粒）显著增加，高于模型组（5.03±0.33 vs 1.61±0.05，P＜0.01）和MB组（5.03±0.33 vs 1.63±0.06，P＜0.01）。LIPUS组虽然也有一定的CD31阳性表达，但分布区域及相对密度不及LIPUS+MB组（3.57±0.21 vs 5.03±0.33，P＜0.01）。结果表明，超声空化治疗显著促进了小鼠左后肢缺血区域血管新生，表现出更高的CD31表达，而LIPUS单独治疗虽然也有一定的促进作用，但效果不及LIPUS+MB组。
|
图 4 治疗后各组小鼠双侧后肢腓肠肌CD31免疫组织化学染色结果 Fig 4 Immunohistochemical staining results of CD31 in bilateral hindlimb gastrocnemius muscles of mice in each group after treatment A: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the model group; B: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the MB group; C: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the LIPUS group; D: Ischemic left posterior gastrocnemius muscle in the LIPUS+MB group; E: Healthy right posterior gastrocnemius muscle of mice. MB: Microbubble; LIPUS: Low-intensity pulsed ultrasound. |
3 讨论
PAD是导致肢体缺血的常见原因，通常伴随着血流不畅、组织缺氧及代谢异常等微循环灌注障碍导致的病理变化[15]。这些病理改变不仅会引发一系列严重的临床症状，还会对患者的预后和生活质量造成严重影响。促进血管新生并改善缺血骨骼肌微循环灌注已成为PAD治疗的重要研究方向[16-17]。促进缺血区域的微循环灌注，不仅可以有效缓解PAD患者的症状，提高生活质量，还能降低心血管事件的发生风险[1]。
自2006年Iida等[6]首次报道了经皮低频超声波在人体肱动脉中会产生显著扩张效应以来，低频超声波在灌注障碍类疾病治疗领域的研究中逐渐崭露头角。这一发现不仅为缺血性疾病的治疗提供了新思路，也激发了研究者们对超声波治疗机制的深入探索[5]。随着医学技术的不断进步，MB增强超声空化效应的作用逐渐得到科学验证。这种效应通过MB与超声波的相互作用，能够显著提高超声治疗的效果[18]。目前，将LIPUS与MB结合的研究已成为热点，这种超声空化治疗技术展现出显著促血管扩张及增加血流量的潜力[19]。Belcik等[14]利用超声空化治疗成功实现了缺血模型治疗后血流量的双倍增长，证实LIPUS联合MB治疗对促进缺血组织微循环灌注疗效显著，为后续的临床研究奠定了有力的基础。已有研究者通过相关实验证实，占空比和MI可作为影响超声空化治疗效果的关键参数，采用20%~30%的占空比和0.6~1.3的MI能够确保治疗的安全性和有效性[20-21]。尽管超声空化治疗在促进骨骼肌微循环灌注方面的效果已得到验证，但关于其在更长时间内是否能够维持这一积极效果并用于相关疾病模型治疗的研究数据尚显不足。基于前期文献[9, 13, 22]和动物预实验结果，本研究选用MI＝0.6作为有效实验参数，借助苏州飞依诺科技股份有限公司生产的G86型超声诊断仪的V-flash空化治疗模式，探索连续超声空化治疗在促进缺血骨骼肌微循环灌注方面的治疗效果。
为了确保研究对照一致性，本研究利用小鼠双侧后肢骨骼肌对称部位进行自身对照，利用CEUS定量评估MBFL/R变化以评价不同治疗对小鼠缺血左后肢微循环灌注的促进效果。在左后肢缺血小鼠造模完成后，各组之间的MBFL/R差异均无统计学意义，这证明本研究动物模型的构建具有较高的一致性和可重复性。各组小鼠左后肢缺血损伤造模后，对比CEUS图像，MB的进入速度及ROI时间-强度曲线的峰值强度显著降低，MBFL/R均低于50%，表明该小鼠模型成功模拟出PAD导致的肢体微循环障碍状态，在此动物模型基础上，则能够在更接近真实病理生理变化情况下，对不同治疗方法改善肢体微循环灌注障碍的效果进行客观、准确的评估。
本研究的模型组用于评估PAD所致微循环灌注障碍的基础状态，另设置3个治疗组进行对比，观察连续LIPUS治疗（LIPUS组）和连续超声空化治疗（LIPUS+MB组）在促进小鼠缺血后肢微循环灌注方面的疗效。实验结果证实，超声空化治疗与单纯LIPUS治疗均可有效促进小鼠缺血左后肢的微循环灌注，但超声空化治疗促进缺血骨骼肌微循环灌注的疗效优于单纯LIPUS治疗，并且超声空化治疗促进缺血骨骼肌微循环灌注的疗效随着治疗次数的增加逐步加强，这些结果与治疗性声学仪器研究结果[19]相契合。为了验证实验结果的可靠性，本研究还采用了H-E染色和CD31免疫组织化学染色等方法，从病理组织微观结构变化层面进行了疗效分析，结果显示在超声空化治疗促进微循环灌注的治疗过程中，小鼠左后肢缺血区域出现了积极的修复效果，损伤部位在治疗后缺血状态得到缓解。实验结果表明，连续超声空化治疗不仅能够有效促进小鼠左后肢缺血区域的微循环灌注，还能加快缺血区域的组织修复进程。这一发现具有重要的临床意义，有望为PAD患者带来更为安全、有效的治疗方法。
值得关注的是，目前其他研究多通过特制的超声治疗仪进行超声空化治疗，并辅以其他声学设备分别进行诊断和评估[11, 14]，或仅通过调节不同的MI在超声诊断仪上进行研究。而本研究则利用超声诊疗一体机的V-flash空化治疗模式，通过相关参数（F、PRF、PL、MI、占空比）调节，实现在同一台超声设备上完成诊断、评估和无创治疗全过程。这一研究改进不仅极大地提升了实验便利性和研究效率，减少了操作复杂性和实验误差概率，同时也能够更加精确评估微循环灌注，实时观察骨骼肌微循环灌注情况，并有效地同步实施非侵入性超声空化治疗，从而为PAD的诊疗一体化提供新的解决方案。
本研究仍存在一定的局限性：（1）超声空化治疗涉及参数复杂[7]，由于本研究选用的超声空化治疗参数较为单一，最佳空化治疗参数有待进一步研究；（2）本研究仅着重观察了超声空化治疗对微循环灌注障碍的改善效果，相关分子机制并未深入探究。未来将进一步探讨超声空化治疗改善微循环灌注障碍的关键机制及信号通路。
综上所述，本研究通过小鼠左后肢缺血模型成功模拟了动脉缺血性疾病的微循环灌注障碍状态，并证实连续超声空化治疗在促进小鼠缺血后肢骨骼肌微循环灌注方面具有比单一LIPUS治疗更显著的稳定疗效。这一研究发现可为未来临床治疗PAD等微循环灌注障碍类疾病提供新视角与新策略，在促进缺血肢体微循环灌注和组织修复方面具有广阔的临床应用前景，有望为PAD等动脉缺血性疾病提供新的诊疗一体化手段。
参考文献
| [1] |
SHAH A J, PAVLATOS N, KALRA D K. Preventive therapies in peripheral arterial disease[J]. Biomedicines, 2023, 11(12): 3157. DOI:10.3390/biomedicines11123157 |
| [2] |
SCHAWE L, RAUDE B, CARSTENS J C, et al. Effect of revascularization on intramuscular vascular endothelial growth factor levels in peripheral arterial disease[J]. Biomedicines, 2022, 10(2): 471. DOI:10.3390/biomedicines10020471 |
| [3] |
JIA L, LI D, WEI X, et al. Efficacy and safety of focused low-intensity pulsed ultrasound versus pulsed shortwave diathermy on knee osteoarthritis: a randomized comparative trial[J]. Sci Rep, 2022, 12(1): 12792. DOI:10.1038/s41598-022-17291-z |
| [4] |
QIN H, LUO Z, SUN Y, et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes skeletal muscle regeneration via modulating the inflammatory immune microenvironment[J]. Int J Biol Sci, 2023, 19(4): 1123-1145. DOI:10.7150/ijbs.79685 |
| [5] |
魏霞, 李东倩, 骆诗琪, 等. 低强度脉冲聚焦超声对小鼠膝关节软骨细胞损伤中炎症因子和焦亡蛋白的影响[J]. 海军军医大学学报, 2024, 45(3): 268-276. WEI X, LI D Q, LUO S Q, et al. Effects of focused low-intensity pulsed ultrasound on inflammatory cytokines and pyroptosis-related proteins in mouse knee joint chondrocyte injury[J]. Acad J Naval Med Univ, 2024, 45(3): 268-276. DOI:10.16781/j.CN31-2187/R.20230516 |
| [6] |
IIDA K, LUO H, HAGISAWA K, et al. Noninvasive low-frequency ultrasound energy causes vasodilation in humans[J]. J Am Coll Cardiol, 2006, 48(3): 532-537. DOI:10.1016/j.jacc.2006.03.046 |
| [7] |
O'BRIEN W D Jr. Ultrasound-biophysics mechanisms[J]. Prog Biophys Mol Biol, 2007, 93(1/2/3): 212-255. DOI:10.1016/j.pbiomolbio.2006.07.010 |
| [8] |
HE J, LIU Z, ZHU X, et al. Ultrasonic microbubble cavitation enhanced tissue permeability and drug diffusion in solid tumor therapy[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(8): 1642. DOI:10.3390/pharmaceutics14081642 |
| [9] |
MASON O R, DAVIDSON B P, SHEERAN P, et al. Augmentation of tissue perfusion in patients with peripheral artery disease using microbubble cavitation[J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2020, 13(3): 641-651. DOI:10.1016/j.jcmg.2019.06.012 |
| [10] |
SONG X, ZHANG Q, CHANG M, et al. Nanomedicine-enabled sonomechanical, sonopiezoelectric, sonodynamic, and sonothermal therapy[J]. Adv Mater, 2023, 35(31): e2212259. DOI:10.1002/adma.202212259 |
| [11] |
LIU J, YOU Q, LIANG F, et al. Ultrasound-nanovesicles interplay for theranostics[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2024, 205: 115176. DOI:10.1016/j.addr.2023.115176 |
| [12] |
MULLER M A, BELCIK T, HODOVAN J, et al. Augmentation of tissue perfusion with contrast ultrasound: influence of three-dimensional beam geometry and conducted vasodilation[J]. J Am Soc Echocardiogr, 2021, 34(8): 887-895. DOI:10.1016/j.echo.2021.02.018 |
| [13] |
张毅, 冯爽, 唐娜娇, 等. 超声诊疗一体机VINNO 70空化调控功能及声学测量的研究[J]. 临床超声医学杂志, 2021, 23(3): 161-165. DOI:10.3969/j.issn.1008-6978.2021.03.002 |
| [14] |
BELCIK J T, DAVIDSON B P, XIE A, et al. Augmentation of muscle blood flow by ultrasound cavitation is mediated by ATP and purinergic signaling[J]. Circulation, 2017, 135(13): 1240-1252. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.116.024826 |
| [15] |
ZAIED A A, BREWER L, REZAEE S, et al. Abstract 14054:monocyte vascular endothelial growth factor receptor-1 signaling in peripheral artery disease[J]. Circulation, 2022, 146(Suppl_1). DOI:10.1161/circ.146.suppl_1.14054 |
| [16] |
徐振宏, 颜小斌, 李丽雅. 超声造影评估2型糖尿病骨骼肌微循环功能的研究[J]. 中国糖尿病杂志, 2021, 29(3): 200-204. DOI:10.3969/j.issn.1006 |
| [17] |
COOKE J P, MENG S. Vascular regeneration in peripheral artery disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2020, 40(7): 1627-1634. DOI:10.1161/atvbaha.120.312862 |
| [18] |
汤晓轶, 赵梦鑫, 李威, 等. 基于纳米技术的新型超声造影剂在肌肉骨骼关节疾病诊疗中的应用[J]. 海军军医大学学报, 2023, 44(2): 143-149. TANG X Y, ZHAO M X, LI W, et al. Application of novel ultrasound contrast agents based on nanotechnology in diagnosis and treatment of musculoskeletal joint diseases[J]. Acad J Naval Med Univ, 2023, 44(2): 143-149. DOI:10.16781/j.CN31-2187/R.20220530 |
| [19] |
MOCCETTI F, BELCIK T, LATIFI Y, et al. Flow augmentation in the myocardium by ultrasound cavitation of microbubbles: role of shear-mediated purinergic signaling[J]. J Am Soc Echocardiogr, 2020, 33(8): 1023-1031.e2. DOI:10.1016/j.echo.2020.03.016 |
| [20] |
ROUSOU C, SCHUURMANS C C L, URTTI A, et al. Ultrasound and microbubbles for the treatment of ocular diseases: from preclinical research towards clinical application[J]. Pharmaceutics, 2021, 13(11): 1782. DOI:10.3390/pharmaceutics13111782 |
| [21] |
KELLER S B, SHEERAN P S, AVERKIOU M A. Cavitation therapy monitoring of commercial microbubbles with a clinical scanner[J]. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control, 2021, 68(4): 1144-1154. DOI:10.1109/TUFFC.2020.3034532 |
| [22] |
POULIOPOULOS A N. Evaluating drug delivery enhancement following ultrasound treatment[J]. Lancet Oncol, 2023, 24(5): 420-422. DOI:10.1016/s1470-2045(23)00149-3 |