2025, Vol. 46
2. 海军军医大学(第二军医大学)第一附属医院心血管内科, 上海 200433
2. Department of Cardiovasology, The First Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2，GRh2）是中药人参类植物中的一种有效成分，具有多种生物调节功能。在肿瘤方面，GRh2能通过调节酪氨酸蛋白激酶类基因的表达，抑制丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶和ERK基因的表达，从而抑制癌细胞的迁移、侵袭和增殖[1-3]，并参与促进各种癌细胞凋亡的过程[4-6]。GRh2还能够通过抑制促炎因子的表达减轻小鼠神经/肺损伤和病理性炎症反应[7-8]。在心血管领域，GRh2除了抗炎作用[9]外，还能减少心脏纤维化、改善心功能[10]，体外实验表明GRh2还具有抗氧化应激损伤等作用[11-12]。目前，测定人参皂苷类血药浓度的报道较多，由于测定的种类多或实验种类的不同[13-15]，其结果不够完整且针对性不强，在同样使用液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）测定血浆中药物浓度的实验中，其研究方向更多集中在中成药中药物浓度的测定[16]，而未研究单体本身的药代动力学情况。
本研究使用LC-MS/MS测定小鼠血浆GRh2浓度，分析了GRh2在小鼠体内的药代动力学参数，为GRh2的临床应用提供理论支持。
1 方法和结果 1.1 仪器、药品和试剂MIX-200多孔涡旋混匀仪[拓赫机电科技（上海）有限公司]，MX100-4A微孔板振荡器（杭州奥盛仪器有限公司），LC-30AD液相泵、CBM-20A控制器、DGU-20A5R(C)脱气机、CTO-20A柱温箱均为日本岛津公司产品。采用SIL-30ACMP自动进样器配合Triple Quad 5500+质谱仪（美国Applied Biosystems公司），通过电喷雾离子源进行样品的液相色谱分离与质谱检测。数据采集及数据处理软件为Analyst 1.7.2（美国Applied Biosystems公司）和Watson LIMS Version 7.6.1（美国ThermoFisher公司）。
GRh2（货号G12911，纯度≥98%）购自上海吉至生化科技有限公司；色谱级乙腈、甲醇购自霍尼韦尔上海有限公司；色谱级甲酸购自罗恩试剂有限公司（上海）；水为纯化水；双氯芬酸钠购自上海吉至生化科技有限公司，经中国食品药品鉴定研究院鉴定，纯度为100%。
1.2 高效液相色谱与质谱条件 1.2.1 色谱条件色谱柱：Waters BEHC18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液和含0.1%甲酸的乙腈；流速：0.60 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：1.00 µL。
1.2.2 质谱条件电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测；离子源喷雾电压：5 500.00 V，离子源温度：500.00 ℃；气帘气：40.00 psi（1 psi＝6 894.8 Pa）；碰撞气：7.00 psi；质谱采集时间：2 min；质谱分析GRh2时去簇电压、碰撞能量和监测离子对分别设定为50.00 V、15.00 V和623.700/587.400，分析双氯芬酸钠时分别设定为100.00 V、26.00 V和296.200/215.000。
1.3 溶液的配制取适量的GRh2标准品，室温白光条件下完全溶解于甲醇中，制得浓度为1.00 mg/mL的储备溶液。用50%甲醇水溶液稀释GRh2储备液，制得标准曲线样品工作溶液和质控样品工作溶液，储存于－20 ℃透明玻璃瓶中。标准曲线样品工作溶液浓度分别为1 000、800、200、100、40、10、4、2 μg/mL；质控样品工作溶液浓度分别为750、500、6、2 μg/mL。
取适量的双氯芬酸钠标准品，室温白光条件下完全溶解于甲醇中，制得浓度为1.00 mg/mL的储备溶液。用甲醇稀释双氯芬酸钠储备溶液制得内标工作溶液（100 ng/mL），储存于－20 ℃条件下透明玻璃瓶中。
1.4 给药与血液采集3只雄性C57BL/6小鼠购自吾创生物科技（上海）有限公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004]，鼠龄7~8周。给药前禁食12 h，自由饮水。称取10 mg GRh2药物，溶解于0.25 mL的无水乙醇中使药物完全溶解，再加入9.75 mL生理盐水配制成1 mg/mL的药液。按7.5 mg/kg剂量灌胃给药，分别于给药后5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h时在小鼠眼眦后静脉丛采集血液约0.03 mL，置于肝素处理后的离心管中，3 000×g离心5 min，取上清液，移至另一离心管中，冻存待测。
1.5 血浆样品前处理取10 µL空白血浆，加入190.0 µL的0.1%甲酸乙腈溶液，于室温条件下涡旋混匀约5 min，4 ℃下3 000×g离心5 min，转移150.0 µL上清液至96孔聚丙烯板，经氮气（40 ℃）吹干后用50.0 µL的50%甲醇水溶液复溶，涡旋混匀5 min后进样分析。
1.6 质谱分析电喷雾离子源正离子模式下，Q1、Q3全扫描质谱图获得准分子离子峰[M+H]+峰，选择性对[M+H]+进行产物离子全扫描质谱分析，见图 1，结果均未见其他溶剂或金属加合离子。
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图 1 GRh2和双氯芬酸钠的质谱图 A：GRh2的母离子质谱图；B：GRh2的产物离子质谱图；C：双氯芬酸钠的母离子质谱图；D：双氯芬酸钠的产物离子质谱图. GRh2：人参皂苷Rh2. |
1.7 方法学考察 1.7.1 标准曲线
取空白小鼠血浆若干份，分别加入GRh2标准溶液，使其浓度分别为100、200、500、2 000、5 000、10 000、40 000 ng/mL，按1.5节方法操作处理后作LC-MS/MS分析。以GRh2与内标峰面积比值为Y、药物浓度为X（ng/mL）作线性回归，拟合标准曲线（权重因子为1/X2），得标准曲线方程为Y＝3.28×10－5X－6.69×10－4（r＝0.996 0），结果表明GRh2血浆质量检测浓度在100~40 000 ng/mL范围内与峰面积线性关系良好，定量下限为100 ng/mL（信噪比＝10）。
1.7.2 基质效应用提取后的空白基质制备相应浓度的血浆样品（300、25 000、37 500 ng/mL）、水代血浆样品，重复6份，按1.5节方法操作处理后作LC-MS/MS分析。结果显示，低、中、高浓度下的GRh2内标归一化基质效应因子分别为1.09、1.06、1.00（在0.80~1.20之间），低、中、高浓度下GRh2的RSD分别为7.0%、8.0%、9.4%（n＝6，均在15.0%以内），表明在此条件下基质效应对结果的影响较小，可忽略不计。
1.7.3 精密度和准确度取空白血浆配制标准血样，浓度分别为100、300、25 000、37 500 ng/mL，连续测定5批，按1.5节方法操作处理后作LC-MS/MS分析，计算批间精密度。取空白血浆配制标准血样，浓度分别为100、300、25 000、37 500 ng/mL，按1.5节方法处理后作LC-MS/MS分析，计算批内精密度。GRh2每一浓度水平样品的平均实测浓度为103、333、23 800、35 000 ng/mL，平均批间标准偏差为8.50、6.47、364、1 120 ng/mL，平均批间RSD为8.3%、1.9%、1.5%、3.2%，平均批间准确度偏差为102.9%、111.1%、95.2%、93.3%。
1.7.4 GRh2在生物基质中的稳定性（1）长期稳定性。分别配制浓度为300、37 500 ng/mL的GRh2血样，按1.5节方法预处理后作LC-MS/MS分析，记录峰面积比值。然后将该样品放在－80 ℃冰箱中保存，4 d后取样测定，记录峰面积比值。结果显示4 d后低、高浓度样品准确度分别为110.0%、93.6%（n＝6），说明该样品在－80℃冰箱中4 d内稳定。（2）短期稳定性。分别配制浓度为300、37 500 ng/mL的GRh2血样，按1.5节方法预处理后作LC-MS/MS分析，记录峰面积比值。然后将该样品放在室温环境24 h后取样测定，记录峰面积比值。结果显示24 h后低、高浓度样品准确度分别为95.7%、92.0%（n＝6），说明短期稳定性良好。
1.7.5 反复冻融性分别配制浓度为300、37 500 ng/mL的GRh2血样，按1.5节方法预处理后作LC-MS/MS分析，记录峰面积比值。后将该样品在超低温冷冻冰箱（－90~－70℃）冻存，首次冻存至少24 h，之后室温放置至少12 h，反复3次后取样分析，记录峰面积比值。结果显示反复冻融3次后，低、高浓度样品准确度分别为108.0%、86.4%（n＝6），说明该生物样品反复冻融稳定性良好。
1.7.6 提取回收率取精密度试验项下6份低、中、高浓度质控样品（300、25 000、37 500 ng/mL）按1.5节方法处理，与提取后的空白基质制备的相应浓度的血浆样品比较，计算回收率。结果显示低、中、高浓度样品提取平均回收率分别为95.1%、88.2%和86.7%，总体回收率为90.0%，RSD为5.0%，说明GRh2样品回收率良好。
1.8 药代动力学考察血样按1.5节方法处理后作LC-MS/MS分析，3只小鼠的血药浓度-时间曲线见图 2。采用PKSolver 2.0软件分析，利用非房室模型计算主要药代动力学参数。结果显示，GRh2血药浓度有2个峰值，2 h时达到最高值，8 h时GRh2血药浓度较低，未检测到。GRh2灌胃给药小鼠体内的药代动力学参数Tmax、Cmax分别为（1.42±1.01）h、（1 251±495）ng/mL。
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图 2 小鼠灌胃给药7.5 mg/kg GRh2后血药浓度-时间曲线 GRh2：人参皂苷Rh2. |
2 讨论
LC-MS/MS的应用涉及多个领域，尤其在治疗药物的监测、药物代谢和毒理学中应用广泛[17]。Zhang等[18]用LC-MS/MS法分析了大鼠血浆中达玛-20(22)E, 24-二烯-3β, 6α, 12β-三醇的含量，平均提取回收率为98.5%~102.7%。而Yang等[19]检测大鼠血浆人参皂苷Rh3浓度，线性回归决定系数（r2）＞0.99，提取回收率和基质效应分别为74.2%~78.7%和96.9%~108.4%。庞焕等[20]测定了人参皂苷Rg3的血药浓度，但其取样量大且血药浓度较低。除了血药分析外，何凡等[21]用高效液相色谱法检测了人参皂苷Rg3在大鼠体内的组织分布情况，发现人参皂苷Rg3和其代谢产物GRh2分布于大鼠各组织中，肝脏与胃是人参皂苷Rg3的主要代谢器官。Wei等[22]用LC-MS/MS联合纳米喷雾解吸电喷雾电离质谱法检测了大鼠静脉给药人参皂苷Rg1的药物分布情况，该方法使成像可视化，并在数据采集上进行了优化。
综上所述，本实验在选定的色谱质谱条件下基质效应RSD均＜15%，待测组分不受内源性物质的干扰，且精确度高，准确性好，可以满足对小鼠生物样品GRh2的测定需要。药代动力学考察结果显示，GRh2在小鼠体内的吸收利用率较高，具有良好的生物利用度。本实验所建立的LC-MS/MS准确、可靠，可用于小鼠血浆中GRh2浓度的测定和药代动力学研究。
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