核因子Ⅰ（nuclear factorⅠ，NFI）基因家族编码位点特异性转录因子，对许多器官系统的发育至关重要^[1]。NFI基因家族包含4个高度相关的基因：NFIA、NFIB、NFIC及NFIX，其编码蛋白的结合位点位于各器官和组织中的大量基因启动子、增强子或沉默区^[2]。NFIB在人体内参与大量的生物学过程，调节细胞的分化和增殖^[3]。最近的研究结果表明，NFIB在人类肿瘤的进展中发挥关键作用，并已被确定为许多癌症的关键肿瘤抑制因子或癌基因^[4]。有报道NFIB与结直肠癌患者不良预后相关，且可促进结直肠癌细胞的增殖与转移^[5]。炎症性肠病是一组由免疫反应失调引起的结肠和小肠炎症状态，近年来从遗传、药理学和流行病学数据中发现炎症性肠病和结直肠癌之间存在着一定关系，炎症性肠病是结肠癌发展的重要危险因素^[6]。先天和适应性免疫系统的激活及功能障碍是炎症性肠病患者肠道异常炎症反应的原因之一^[7]。在炎症性肠病中组织学表现是先天免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞）以及适应性免疫细胞（B细胞和T细胞）流入固有层^[8]。但是，NFIB在肠道炎症发生、发展中的作用仍不清楚。

在体内研究抑制作用最有效的方法是敲除动物中的基因并观察其整体表型。近年来，Cre-loxP重组酶系统在基因靶向研究中得到了广泛的应用^[9-10]。在靶基因序列的两端插入loxP获得杂合子flox小鼠，与带有组织特异性启动子的Cre小鼠杂交后，2个loxP位点之间的序列被子细胞切除和遗传，能够得到条件性基因敲除（conditional gene knockout，cKO）小鼠。已有多种动物实验模型被用于研究炎症性肠病的病因和发病机制、开发药物等，其中葡聚糖硫酸钠盐（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的结肠炎模型应用最广。急性、慢性和复发的肠道炎症模型都可以通过改变DSS的浓度和给药频率来实现^[11]。本研究拟建立髓系特异性NFIB敲除小鼠，并通过DSS诱导的肠炎模型观察敲除髓系细胞中的NFIB后免疫细胞和肠道炎症的变化，初步探讨髓系细胞中NFIB的抗炎作用，为研究NFIB在肠道炎症中的作用奠定基础。

从人类蛋白质图谱数据库、基因型-组织表达数据库和FANTOM5数据库中检索NFIB基因相关外周血细胞单个核细胞转录组数据并作为标准化表达NX（每个样本中每个基因的转录表达值）进行分析。

实验小鼠品系为C57BL/6N，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0011]；Lyz2-Cre工具小鼠购自美国杰克逊实验室，饲养于重庆医科大学实验动物中心[动物使用许可证号：SYXK（渝）2018-0003]。所有小鼠均按特定的SPF等级动物饲养标准饲养，室内温度为20~26 ℃，昼夜周期为12 h/12 h。小鼠饲喂灭菌后的标准饮食，自由获得食物和水。所有组织标本在小鼠安乐死后收集。动物实验方案经重庆医科大学动物保护和使用机构委员会批准[科伦预审第（2019）133号]。

在NFIB基因第2外显子下游的内含子序列中插入1个loxP位点，并将FRT-neo-FRT-loxP元件插入到第2外显子上游内含子序列中，得到NFIB-flox小鼠。

将NFIB-flox小鼠与Lyz2-Cre工具小鼠杂交，进行种系传代和动物鉴定，得到flox纯合子和Cre杂合子的髓系特异性NFIB cKO小鼠（NFIB^fl/flLyz2-Cre小鼠）。

固定小鼠，用消毒后的手术剪剪取鼠尾尖端约1~2 mm组织，放入含有100 μL新鲜组织消化液（鼠尾直接PCR试剂盒，产品编号B40013，美国Bimake公司）的离心管中，55 ℃金属浴中消化15 min。随后将样本置于95 ℃金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶，12 400×g离心5 min，取上清作为PCR模板进行扩增后得到DNA样本。用双蒸水配制1%琼脂糖溶液，放入烧瓶中微波加热至琼脂糖颗粒完全溶解，待冷却至45~50 ℃，加入稀释10 000倍的GoldView核酸染料（DH392-5，长沙鼎国生物技术有限公司）7 μL，充分混匀，注意避免气泡产生，倒入制胶板中，插入梳子，待其自然冷却凝固后小心拔除梳子。然后向电泳槽中加入1×Tris-乙酸盐EDTA缓冲液，刚好没过凝胶约1 mm，用一次性枪头依次加样，关上电泳槽盖，接好电极插头，给予100 V的电压，其距离以阳极至阴极之间的测量值为准（1~5 V/cm），可见阳极和阴极由于电解作用产生的气泡，当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时关上电源、拔出电极插头，打开电泳槽盖。使用曝光仪器（ChampChemi^TM 580，中国森西赛智科技有限公司）曝光凝胶。

基因组DNA从鼠尾中提取，使用苯酚-氯仿法纯化。纯化后的DNA经限制性内切酶AflⅡ于37°缓冲液中消化过夜，酶切反应通过65 ℃加热10 min终止。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，电压设置为100 V，当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时关闭电源。电泳后，凝胶经0.5 mol/L NaOH变性15 min，随后将DNA转移至尼龙膜，转印后经紫外交联（120 mJ/cm²）固定。尼龙膜于5%脱脂奶粉中封闭1 h，随后加入标记探针（5′端引物序列正向5′-AGTGGGAGCTGAAAGCATGGCAT-3′、反向5′-TTCCAACAAAGAAGCTGCCTCAGC-3′，3′端引物序列正向5′-AGAAGGGACTGGGAGAAAA-ACAGGAG-3′、反向5′-CCATCCGTCTCTATCTC-GTCTTCCAT-3′）于65 ℃孵育过夜。杂交后使用0.1×柠檬酸钠盐缓冲液、0.1% SDS洗液洗去未杂交的探针，于曝光仪下显色。

选用6~8周、体重＞18 g的雌性髓系特异性NFIB cKO小鼠（实验组）及鉴定排除的非cKO小鼠（对照组），每组4~6只。实验第1天分别给实验组、对照组小鼠含2.5% DSS（分子量为36 000~50 000，货号02180139；美国MP公司）的饮用水和正常饮用水，连续饮用7 d，分别在实验第3、5天给实验组更换含2.5% DSS的新鲜饮用水，给对照组更换新鲜正常饮用水。第8天实验组更换为不含DSS的正常饮用水，连续饮用14 d。上述DSS/正常饮用水方案重复循环1次。第42天采用颈椎脱臼法处死小鼠。

造模过程中持续观察小鼠体重、粪便等变化。DSS诱导第1天随机选取实验组的63号小鼠（NFIB cKO小鼠）和对照组的51号小鼠（Cre小鼠）进行称重并记录，随后每间隔7 d至少称重1次，直到第42天处死小鼠，根据体重变化百分比绘制曲线图。

处死小鼠后留取小鼠结肠标本。首先分离小肠与大肠，再截取整个结肠（从盲肠至肛门），测量结肠长度；然后将结肠组织常规石蜡包埋、连续切片后行H-E染色，于光学显微镜下观察结肠组织学损伤并进行组织活动评分。通过幻灯片以盲评法进行组织学检查和评分。细胞浸润评分：（1）固有层偶有炎症细胞，计0分；（2）固有层浸润增加，主要在隐窝底部，计1分；（3）炎症浸润汇合到黏膜，计2分；（4）浸润跨壁延伸，计3分。组织损伤评分：（1）无黏膜损伤，计0分；（2）小面积隐窝丢失（≤49%），计1分；（3）大面积隐窝丢失至全部丢失（50%~100%），上皮完整，计2分；（4）隐窝全部丢失，上皮丢失，计3分。组织学总分为细胞浸润评分和组织损伤评分之和，总分为0~6分。

将肠道石蜡切片脱蜡、复水后，用3%过氧化氢溶液灭活过氧化氢酶8 min，柠檬酸钠抗原修复液微波加热10 min，共3次，PBS清洗3次，每次3 min。10%山羊血清室温封闭10 min，加入CD11b抗体（Bioss bs-1014R）4 ℃孵育过夜，加入二抗37 ℃孵育15 min，PBS清洗3次，随后进行DAB和苏木精染色。最后脱水封片。

使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，符合正态分布且方差齐的计量资料采用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。检验水准（α）为0.05。

从人类蛋白质图谱数据库、基因型-组织表达数据库和FANTOM5数据库中获得18种血细胞类型和外周血总单个核细胞，共74个样本的转录组数据，并作为标准化表达NX（每个样本中每个基因的转录表达值）进行报告。结果发现NFIB在血细胞中呈差异性表达，髓系细胞（红细胞系、粒细胞系、单核细胞系、巨核细胞系）以中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的NFIB表达最为明显，其次为各类淋巴细胞（T细胞、浆细胞）、单核细胞。

首先构建NFIB基因敲除打靶载体，策略设计如图 1A，即含有loxP位点的向导RNA（guide RNA，gRNA）。gRNA1靶序列为5′-ATGCCAC-ACAGTTCCCGCTTTGG-3′，gRNA2靶序列为5′-TGTAAACATGGGCCGGCAT-GC-GG-3′。在对最终载体进行测序验证后，将其与Cas9 mRNA共同注入小鼠受精卵中，产生靶向条件敲除小鼠F0（founder 6#）。对F0进行PCR鉴定及序列分析，确认loxP位点正确插入后将其与野生型小鼠杂交产生F1后代（41、42、43），培育计划如图 1B所示。

图 1 基因打靶策略设计和小鼠培育计划示意图 Fig 1 Schematic diagram of gene targeting strategy design and breeding plan of mice A: NFIB cKO gene targeting strategy; B: NFIB-floxed chimeric mouse breeding program. F0 is the initial generation of targeted cKO mice, F1 (41, 42, 43) is the first generation of positive NFIB-floxed chimeric mice. KO: Knockout; UTR: Untranslated region; loxP: Locus of X-over in P1; cKO: Conditional gene knockout; WT: Wild-type; NFIB: Nuclear factor ⅠB.

对F1小鼠进行PCR鉴定，引物位点见图 2A，长片段PCR引物1序列为正向5′-CAGTAACAGC-AAACCCAGGACAACAG-3′、反向5′-AGTACTGT-GGATTCGGACCAGTCTGAC-3′，引物2序列为正向5′-CACGTAAACGGCCACAAGTTCGAG-3′、反向5′-AAGGCATTCAGCAGCTAGACAAAGAGG-3′，退火温度为60 ℃。41、42、43均在NFIB条件等位基因位点（4.2 kb）出现阳性条带，而野生型小鼠和对照无条带（图 2B、2C），表明F1小鼠NFIB基因两端成功插入loxP位点。在DNA样品不是很纯或没有足够的PCR延长时间时，长片段PCR产物可能不会被扩增，可以行短片段PCR鉴定（引物5序列为正向5′-TGTTTCAGTGTTG-GAATGTTGGACG-3′、反向5′-GGTGGCACAGAA-ACACAAAGCATG-3′，引物6序列为正向5′-GAC-AGAGCATCACAGAGCAAACCAG-3′、反向5′-AC-ACGGCTCATTAACAACGGAAACC-3′），策略详见图 3A。

图 2 基因分型策略和NFIB-flox嵌合小鼠PCR、测序鉴定结果 Fig 2 Genotyping strategy, PCR and sequencing identification results of NFIB-floxed chimeric mice A: Schematic diagram of genotyping strategy. B, C: PCR identification results for F1 mice (41, 42, 43) from the first-generation breeding showed positive results with both PCR primers 1 (B, 4.2 kb) and PCR primers 2 (C, 4.4 kb). D: Sequencing results. Taking mouse ID 41 as an example, 5′ primers (F3) and 3′ primers (F4) were used for sequencing. The detection results showed that the loxP site with 34 bp was inserted correctly, and the loxP site was displayed in red. NFIB: Nuclear factor ⅠB; PCR: Polymerase chain reaction; UTR: Untranslated region; loxP: Locus of X-over in P1; cKO: Conditional gene knockout; M: Marker; WT: Wild-type; Water: Water blank control, no DNA template was added.

图 3 短片段PCR、DNA印迹策略设计和鉴定结果 Fig 3 Short-fragment PCR, DNA imprinting strategy design and identification results A: Schematic diagram of short fragment PCR strategy. B: Schematic diagram of DNA imprinting strategy, marked in red as probe. C, D: DNA imprint results, mice No. 41, 42 and 43 all showed positive results at the 5′ probe (C) expected fragment (5.32 kb) and 3′ probe (D) expected fragment (3.66 kb), while WT mice only showed positive results at the expected fragment (8.84 kb), confirming the correct gene targeting in 3 F1 animals. PCR: Polymerase chain reaction; UTR: Untranslated region; loxP: Locus of X-over in P1; cKO: Conditional gene knockout; WT: Wild-type; AflⅡ: AflⅡ restriction endonuclease.

为了检测34 bp的loxP位点是否正确插入，使用单向引物（引物3序列为5′-GATGAATGCA-TGCTGGAAGCTAATG-3′，引物4序列为5′-TCTG-ACAGAGGCCTAGATTTATGTTG-3′对F1小鼠的基因进行测序（图 2D），结果显示loxP位点正确插入。最后通过尾DNA样本的DNA印迹分析（策略设计见图 3B），证实了3只F1小鼠（41、42和43）的正确基因靶向性（图 3C、3D）。探针引物序列如下：5′探针正向引物序列为5′-AGTG-GGAGCTGAAAGCATGGCAT-3′，5′探针反向引物序列为5′-TTCCAACAAAGAAGCTGCCTCAGC-3′，3′探针正向引物序列为5′-AGAAGGGACTGGGA-GAAAAACAGGAG-3′，3′探针反向引物序列为5′-CCATCCGTCTCTATCTCGTCTTCCAT-3′。

在成功构建NFIB-flox嵌合小鼠后，将其与Lyz2-Cre小鼠杂交，杂合重组小鼠，从而得到髓系特异性NFIB cKO小鼠，具体步骤如下：（1）杂交杂合子靶向小鼠，产生纯合子靶向小鼠（flox^+/+），通过PCR鉴定（引物信息见表 1）；（2）用组织特异性Cre删除小鼠繁殖纯合子靶向小鼠，以产生针对目标等位基因的杂合子小鼠和针对Cre转基因的半合子/杂合子小鼠（Flox^+/－/Cre^+/－），通过PCR鉴定（引物信息见表 1）；（3）将Flox^+/+与Flox^+/－/Cre^+/－小鼠杂交，大约25%的后代将是纯合的目标等位基因和半合/杂合的Cre转基因（Flox^+/+/Cre^+/－）。可以用上述相同的方法筛选幼鼠。组织特异性基因缺失可以通过在PCR检测中添加1个额外的引物来证实（引物信息见表 1），结果证实成功地构建了NFIB cKO小鼠（图 4）。

表 1 (Tab 1)

表 1 组织特异性基因分型PCR引物及相应产物条带大小 Tab 1 Tissue specific genotyping PCR primers and corresponding product length Primer Sequence (5′-3′) Product length Flox F TGTTTCAGTGTTGGAATGTTGGACG flox/flox = 263 bp; flox/wt = 263/191 bp; wt/wt = 191 bp Flox R GGTGGCACAGAAACACAAAGCATG   Cre F CATATTGGCAGAACGAAAACGC Cre amplicon=413 bp Cre R CCTGTTTCACTATCCAGGTTACGG   cKO R ATCCTGACATGCTGGTTTGAAGA cKO=2 336 bp/263 bp; KO=322 bp F: Forward primer; R: Reverse primer; flox: Flanked by loxP; wt: Wild-type; Cre: Cyclization recombination enzyme; cKO: Conditional gene knockout; KO: Knockout.

表 1 组织特异性基因分型PCR引物及相应产物条带大小 Tab 1 Tissue specific genotyping PCR primers and corresponding product length

图 4 NFIB cKO小鼠PCR鉴定结果 Fig 4 PCR identification results of NFIB cKO mice A: PCR results showed that the successfully constructed mice No. 6, 15, 28 and 34 contained homozygous of flox sequence (263 bp). B: PCR results showed that Cre (413 bp) was expressed in the successfully constructed mice, No. 6 mouse were Cre homozygous, and No. 15 and 28 mice were Cre heterozygous. NFIB: Nuclear factor ⅠB; cKO: Conditional gene knockout; PCR: Polymerase chain reaction; M: Marker; WT: Wild-type; NC: Negative control; Cre: Cyclization recombination enzyme.

将NFIB-flox小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交后，后代自交。琼脂糖凝胶电泳结果（图 5）显示，编号为77、72、63和20的小鼠为NFIB cKO小鼠，基因型为NFIBfl/flCre，纳入实验组；编号为80、24的小鼠基因型为NFIBfl/fl，编号为74和51的小鼠基因型为Cre，编号为65的小鼠基因型为野生型，纳入对照组。

图 5 繁殖小鼠琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 Fig 5 Identification of breeding mice The results by gel electrophoresis showed that the genotypes of mice No. 77, 72, 63 and 20 were NFIBfl/flCre (experimental group), mice No. 80 and 24 were NFIBfl/fl (control group), mice No. 51 and 74 were Cre (control group), and mouse No. 65 were wild-type (control group). M: Marker.

使用2.5% DSS诱导慢性结肠炎，第8天时实验组所有小鼠均出现肉眼血便、腹泻、活动减少，造模期间小鼠体重减轻、采食差且精神萎靡。体重变化曲线显示实验组63号NFIB cKO小鼠体重减轻程度较对照组51号小鼠明显（图 6）。

图 6 DSS诱导的慢性结肠炎小鼠体重变化曲线 Fig 6 Weight change curve of mice with chronic colitis induced by DSS Body weight data were recorded at an interval of 7 d, and 2 matched mice (No. 63 and 51) were randomly selected to obtain the body weight change curves at various time points by using the current body weight/original body weight. DSS: Dextran sulfate sodium salt; NFIB: Nuclear factor ⅠB; cKO: Conditional gene knockout.

DSS造模第42天，小鼠处死后截取盲肠至肛门段结肠测量长度，实验组结肠[（8.23±0.35）cm]较对照组[（10.30±0.36）cm]短，差异有统计学意义（t＝7.11，P＜0.01）。实验组小鼠结肠的组织学评分[（4.25±0.50）分]高于对照组小鼠[（0.50±0.58）分]，差异有统计学意义（t＝9.82，P＜0.01）。

如图 7A、7B所示，对照组小鼠的结肠组织中均未见明显炎症细胞浸润和组织损伤。与对照组小鼠相比，实验组小鼠的黏膜上皮细胞脱落，黏膜增厚，大量炎症细胞浸润，肠绒毛和肠腺结构异常或缺失，淋巴结肿大。免疫组织化学染色（图 7C）显示，CD11b阳性细胞在实验组小鼠肠道募集数量多于对照组小鼠，且广泛浸润至黏膜下层、黏膜下肌层及浆膜层。

图 7 DSS诱导的慢性肠炎小鼠结肠组织H-E和IHC染色结果 Fig 7 H-E and IHC staining results of DSS induced chronic enteritis mice A: H-E staining of colon "Swiss roll". B: H-E staining of colon tissue of cKO mice showed extensive infiltration of inflammatory cells in submucosa (arrows), and abnormal and residual glandular structures could be observed after magnification (arrows). Control mice had no significant histopathological changes (arrows). C: IHC staining for surface markers of mouse myeloid cells showed that CD11b positive cells were more significantly enriched in cKO mice than in control mice. DSS: Dextran sulfate sodium salt; H-E: Hematoxylin-eosin; IHC: Immunohistochemical; NFIB: Nuclear factor ⅠB; cKO: Conditional gene knockout.

NFIB在小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌等恶性肿瘤中起促癌的作用^[12-15]，但在非小细胞肺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、皮肤鳞状细胞癌中则被认为是一种抑瘤基因^[16-19]。研究表明NFIB也能促进结直肠癌转移，说明NFIB在体内的作用具有组织特异性^[5]。本实验通过查找数据库发现在髓系细胞中NFIB也有表达（中性粒细胞为主），而髓系细胞在炎症性肠病中发挥重要作用。基因编辑技术是研究基因作用的常用方法^[20]。CRISPR/Cas9系统是目前基因编辑技术的焦点，结合Cre-loxP技术后可以cKO^[21-22]。2015年Tanaka等^[23]利用该技术成功构建了肠道特异性Cldn7 cKO小鼠。为了研究髓系细胞中NFIB对肠道炎症的影响，本实验采用该技术成功构建了髓系特异性NFIB cKO小鼠。

本研究观察了髓系细胞中敲除NFIB后肠道炎症的变化，发现髓系细胞中敲除NFIB后小鼠肠道长度缩短。H-E染色结果显示，与对照小鼠相比，NFIB cKO小鼠肠道炎症细胞浸润明显，以淋巴细胞及浆细胞为主（超过黏膜下层，可达固有肌层），也可见中性粒细胞；肠道黏膜增厚，黏膜上皮细胞损伤、细胞核崩解，杯状细胞缺失，异常隐窝灶（延伸、扭曲、分支、轴向改变、缺失等）增多，伴局部淋巴结肿大。为进一步探讨髓系敲除NFIB对结肠炎中免疫细胞浸润是否存在影响，本研究选用小鼠常见免疫细胞表面标志物CD11b（泛粒细胞）作为检测分子，免疫组织化学染色结果显示NFIB cKO小鼠的肠道CD11b阳性细胞多于对照组。说明敲除NFIB后增加了免疫细胞在肠道中的浸润，这些现象均表明NFIB的丢失导致更加严重的结肠炎症表现。

本研究成功构建了髓系特异性NFIB敲除小鼠，并发现髓系细胞中的NFIB能够通过抑制免疫细胞浸润减轻结肠炎症，为进一步研究NFIB在肠道炎症及炎症相关肠癌中的作用奠定了基础。