Taohong Tongluo granules improve coronary microvascular dysfunction by inhibiting NLRP3/ASC/caspase-1 pathway
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摘要:
目的 研究桃红通络颗粒对冠状动脉微循环障碍（CMD）大鼠的心脏保护作用。 方法 SD大鼠随机分为假手术组、CMD组、尼可地尔组（5 mg/kg）及桃红通络颗粒组（50 mg/kg）。动物按分组先给予相应药物7 d，末次给药后2 h进行CMD模型制备。采用左心室腔内注射栓塞微球（粒径40~120 μm，约1 000个微球）的方法建立大鼠CMD模型。造模术后24 h，采用超声心动图检查左心室射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）及舒张末期容积（EDV）；通过2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定心肌受损区域，利用H-E染色观察心肌组织形态学变化，应用免疫组织化学染色和蛋白质印迹法检测大鼠NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及心肌组织caspase-1的蛋白表达水平。 结果 超声心动图检查显示，桃红通络颗粒组、CMD组和尼可地尔组的EF、FS均低于假手术组（均P＜0.001），桃红通络颗粒组和尼可地尔组的EF、FS均高于CMD组（均P＜0.01），但EDV在各组间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。H-E染色结果显示，假手术组大鼠心肌无异常改变，CMD组大鼠心肌有微球栓塞、细胞溶解破裂及炎性浸润，尼可地尔组和桃红通络颗粒组病变相对较轻且两组的血栓形成数均低于CMD组（均P＜0.01）。TTC染色结果显示，尼可地尔组和桃红通络颗粒组大鼠心肌受损区域面积均小于CMD组（P＜0.05或P＜0.01），且桃红通络颗粒组小于尼可地尔组（P＜0.05）。免疫组织化学染色结果显示，CMD模型中ASC和caspase-1蛋白表达及阳性细胞数增加且分布于心肌与间质细胞，桃红通络颗粒组ASC和caspase-1阳性细胞数均低于CMD组（均P＜0.01）。蛋白质印迹法检测结果显示，桃红通络颗粒组NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平均低于CMD组（均P＜0.05）。 结论 桃红通络颗粒可以保护微球栓塞所致CMD大鼠的心脏功能，改善心脏血流动力学指标，减少心肌梗死面积，其作用机制与抑制心肌细胞炎症小体从而减轻心肌损伤有关。 -
关键词:
- 冠状动脉微循环障碍 /
- 冠心病经皮冠状动脉介入治疗 /
- 桃红通络颗粒 /
- NLRP3炎症小体 /
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Abstract:Objective To investigate the cardiac protective effect of Taohong Tongluo granules on coronary microvascular dysfunction (CMD) rats. Methods SD rats were randomly assigned to sham-operated group, CMD group, nicorandil group (5 mg/kg), or Taohong Tongluo granule group (50 mg/kg). Animals were administered corresponding drugs for 7 d according to the grouping, and the CMD model was prepared 2 h after the last administration. The rat CMD model was induced by injecting embolization microspheres (diameter 40-120 μm, approximately 1 000 microspheres) into the left ventricular cavity. Twenty-four hours after modeling, echocardiography was performed to measure the left ventricular ejection fraction (EF), fractional shortening (FS), and end-diastolic volume (EDV). The damaged myocardial area was assessed by 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Myocardial morphological changes were observed by hematoxylin-eosin (H-E) staining. The protein expression levels of NOD-like receptor family pyrin domain containing protein 3 (NLRP3), apoptosis-associated speck-like protein (ASC), and cysteine aspartic acid specific protease (caspase)-1 in rat myocardial tissue were detected by immunohistochemical staining and Western blotting. Results Echocardiography showed that the EF and FS values in the Taohong Tongluo granule group, CMD group, and nicorandil group were significantly lower than those in the sham-operated group (all P < 0.001). The EF and FS values in the Taohong Tongluo granule group and nicorandil group were significantly higher than those in the CMD group (all P < 0.01). However, there were no significant differences in EDV among the groups (all P > 0.05). H-E staining showed no abnormalities in the myocardium in the sham-operated group. The CMD group exhibited microsphere embolism in the myocardium, myocardial cell dissolution and rupture, and inflammatory infiltration. The lesions in the nicorandil group and the Taohong Tongluo granule group were relatively milder, and the number of thrombi in both groups was lower than that in the CMD group (both P < 0.01). The results of TTC staining indicated that the areas of damaged myocardial regions in both the nicorandil group and the Taohong Tongluo granule group were smaller than that in the CMD group (P < 0.05 or P < 0.01). Moreover, the area in the Taohong Tongluo granule group was smaller than that in the nicorandil group (P < 0.05). The results of immunohistochemical staining showed that in the CMD model, the expression of ASC and caspase-1 proteins, as well as the number of positive cells for these proteins, was increased and was distributed in myocardial and interstitial cells. The numbers of ASC and caspase-1 positive cells in the Taohong Tongluo granule group were lower than that in the CMD group (both P < 0.01). The Western blotting showed that the expression levels of NLRP3, ASC, and caspase-1 proteins in the Taohong Tongluo granule group were all lower than those in the CMD group (all P < 0.05). Conclusion Taohong Tongluo granules can improve cardiac function, ameliorate hemodynamic parameters, and reduce myocardial infarction area in rats with CMD induced by microsphere embolism. The mechanism is related to the inhibition of myocardial inflammasome activation, thereby attenuating the myocardial injuries. -
冠心病是威胁人类健康的最严重的心血管疾病，也是我国居民死亡的首要病因[1-2]。WHO等统计研究数据表明，冠心病的发病率和死亡率均居前列[3-5]。目前经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是冠心病最常用的治疗方法，但是支架植入后再狭窄发生率为30%~50%[6-7]。此外，PCI术后无复流占再灌注患者的10%~30%[8]，其主要原因可能与冠状动脉微循环障碍（coronary microvascular dysfunction，CMD）有关。
炎症反应在CMD的发生和进展中起着至关重要的作用[9]。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing protein 3，NLRP3）是NOD样受体家族的成员，NLRP3炎症小体的激活会导致冠状动脉微血管内皮功能障碍、氧化应激和炎症反应[10-11]。NLRP3炎症小体及其下游介质如IL-1β、IL-18和caspase-1共同组成NLRP3信号通路，该通路在心血管疾病中发挥重要作用。
中医药在冠心病的长期临床实践中展现出明确疗效。研究表明，中药对原发性微血管障碍引起的心绞痛和PCI术后微血管功能障碍具有确切治疗作用，并且在改善炎症反应等难点问题上与现代医学优势互补，呈现出良好的发展势头[12-14]。
本团队在长期临床实践中发现，“气-血-脉不通”是冠心病发病的关键机制，并总结发现“气脉不通”初期影响内环境稳态为冠心病的无症状期，即亚临床期。长时间“气脉不通”堵塞气道，痰饮血瘀，血脉不通，最终引起冠状动脉血管的病理改变，包括微小血管的病变，临床表现为胸闷、胸痛、乏力、胀满等。本团队基于“气-血-脉不通”理论，针对冠心病的病因病机特点，在常规活血化瘀的基础上常辅以“调气”之品，并以桃红四物汤合丹参饮化裁优选，形成专利方桃红通络颗粒（专利号ZL201610662662.4），2024年获批院内制剂转化（沪药制备字Z20240016000）。既往研究证实该方可有效改善心血瘀阻型稳定性冠心病患者的中医证候及生活质量[15-16]；联合常规抗血小板药物在稳定型冠心病PCI术后抗血小板治疗中显示出确切疗效[17]。临床随机对照试验证实，该方的穴位敷贴剂型对冠心病患者胸闷、心悸等临床症状疗效明确[18]。
桃红通络颗粒调和气脉、活血通络的治法能有效改善CMD，但具体作用机制尚未明确。本研究通过冠状动脉内注射栓塞微球建立CMD大鼠模型，阐明桃红通络颗粒通过抑制NLRP3信号通路保护心脏的作用机制及其在改善心肌缺血方面的治疗价值，为中医药在冠心病微循环障碍中的应用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组
6~8周龄健康SPF级雄性SD大鼠，体重280~300 g，由上海必凯科翼生物科技有限公司提供[动物生产许可证号为SCXK（沪）2018-0006，合格证编号为20180006042275]，饲养于上海市普陀区中心医院实验动物中心。饲养条件：温度（23±2）℃、相对湿度55%~60%，12 h/12 h光照-黑暗循环，每小时通风换气10~15次。所有实验程序遵守上海中医药大学附属普陀医院和上海中医药大学附属机构动物护理与使用委员会的指南并通过伦理审批（DWEC-A-202206010）。
使用随机数字表法将实验大鼠随机分为假手术组（n＝6）、CMD组（n＝8）、尼可地尔组（n＝8）和桃红通络颗粒组（n＝8）。按照体表面积换算法将临床用药剂量换算为实验动物给药剂量，尼可地尔临床等效剂量为5 mg/kg，桃红通络颗粒临床等效剂量为50 mg/kg。桃红通络颗粒（组方有桃仁、红花、丹参、桂枝、甘草、檀香、生地黄）由上海顺源福坤堂药房有限公司提供（生产批号21100339）。尼可地尔由中外制药株式会社生产（5 mg/片，批号：H41024517）。尼可地尔组和桃红通络颗粒组大鼠按分组分别给予相应药物7 d，按每天1次10 mL/kg剂量灌胃给药，假手术组和CMD组给予等体积生理盐水。末次给药后2 h制备CMD模型，造模后24 h处死大鼠并取材。
1.2 大鼠CMD模型的建立
将大鼠置于诱导箱中，通过吸入2%异氟烷进行麻醉诱导，待角膜反射消失后取仰卧位固定。使用Veet脱毛膏处理颈部及左胸区域，2 min后擦净残留物。沿颈部中线切口，钝性分离皮下组织及肌肉层，充分暴露气管后插入18G BD InsyteTM IV静脉导管（货号381247，美国BD公司），连接小动物呼吸机实施机械通气（潮气量6 mL/kg，呼吸频率80 min－1），通气气体为100%纯氧，并维持异氟烷浓度在3%~5%以保持麻醉深度。栓塞微球制备采用Merit Medical S120GH型微粒球（批号X2212989，美国Merit Medical公司生产，规格2 mL，粒径40~120 μm）。取1 mL无菌注射器抽取200 μL生理盐水，加入2 μL微球原液（稀释比例1∶100），轻柔颠倒混匀后排除气泡，最终配制成200 μL悬浮液备用。使用弯头蚊式止血钳夹闭主动脉8~10 s（避开肺动脉和肺），同时使用胰岛素注射器将200 μL该悬浮液注入左心室。假手术组大鼠接受与实验组（CMD组、尼可地尔组、桃红通络颗粒组）大鼠相同的麻醉、插管及开胸程序，但左心室注射步骤替换为等体积生理盐水，不注入微球。
1.3 超声心动图检查
在CMD模型建立后24 h对大鼠进行彩色多普勒超声检查。通过腹腔内注射10% 水合氯醛溶液麻醉大鼠，后取仰卧位于实验台上进行超声心动图检查以评估心脏功能，记录每只大鼠左心室射血分数（ejection fraction，EF）、短轴缩短率（fractional shortening，FS）和舒张末期容积（end-diastolic volume，EDV）等关键参数。
1.4 H-E染色
取大鼠心肌组织，经10%甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片及H-E染色，置于光镜下观察。对每组样本的每只大鼠随机选取5张切片，每张切片再随机选取5个视野，统计各视野微血栓数，并计算平均值。
1.5 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride staining，TTC）染色[19-20]评估缺血区域的相对大小
在超声心动图检查之后迅速切取大鼠心脏，并用冰冷的PBS冲洗。使用精密心脏切片机将组织垂直于房室沟切成2 mm厚的切片，将心脏切片在37 ℃的1% TTC溶液中避光孵育15~20 min，使存活组织染成深红色，而梗死区域则保持未染色状态。染色后，将切片在10%甲醛中固定至少24 h。使用高分辨率相机拍摄染色心脏切片的数字图像，使用ImageJ 1.53g软件测量未染色区域的面积，以进行梗死面积分析。梗死面积（%）＝未染色面积/心脏切片总面积×100%。
1.6 免疫组织化学染色
取出心肌组织并切成薄片，将薄片固定在载玻片上，用PBS洗涤去除血液和杂质；脱脂并阻断非特异性结合后加入一抗，在4 ℃下孵育过夜；加入二抗并在室温下孵育1 h后，将DAB加入到PBS中，在室温下孵育10~30 min后显色。使用荧光显微镜对染色图像进行定量分析，计算各组中的阳性细胞数。凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）抗体、caspase-1抗体由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供（货号A11433、A0964）。
1.7 蛋白质印迹法
首先使用BCA法对组织中的蛋白质进行提取和定量，随后进行变性处理。NLRP3抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供（货号BA3677）；ASC抗体由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供（货号A16672）；caspase-1抗体由武汉三鹰生物技术有限公司提供（货号22915-1-AP）。在80 V电压下进行电泳，持续2 h。然后在200 mA电流下将蛋白质转移到膜上，持续2 h；转移后，将膜在室温下置于振荡器上，用封闭液孵育1 h，以确保均匀封闭；随后用TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min；在4 ℃条件下将膜与一抗一起在摇床上孵育过夜；随后再用TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min；在室温下将膜与山羊来源的二抗一起在摇床上孵育2 h；再用TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min；最后使用Image Lab软件对膜上的图像进行显影和分析。
1.8 统计学处理
使用SPSS 23.0软件和GraphPad Prism 8.0.2软件（美国GraphPad Software公司）进行分析。满足正态分布及方差齐的计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析；非正态分布的计量资料以M（Q9, Q9）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果
2.1 桃红通络颗粒可改善CMD大鼠心脏功能
超声心动图数据表明，与假手术组相比，CMD组大鼠的心肌收缩力受损；与CMD组相比，尼可地尔组和桃红通络颗粒组大鼠心功能得到改善（图 1A）。各组间EDV差异均无统计学意义（均P＞0.05），但与CMD组相比，尼可地尔组和桃红通络颗粒组的EF和FS均增加（均P＜0.01），见图 1B~1D。这提示桃红通络颗粒改善了CMD大鼠心脏功能。
图 1 桃红通络颗粒可增强CMD大鼠心脏功能A：建模后24 h各组大鼠的代表性M型超声心动图；B~D：定量分析各组大鼠的左心室EF、FS和EDV. **P＜0.01。CMD：冠状动脉微循环障碍；EF：射血分数；FS：短轴缩短率；EDV：舒张末期容积.
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2.2 桃红通络颗粒可减轻CMD大鼠心肌微血管栓塞及炎症损伤
H-E染色结果（图 2A）显示，假手术组大鼠心肌细胞排列规则、紧密且整齐，大小正常，无变性、出血、水肿或中性粒细胞浸润迹象；CMD组大鼠微血管中可见栓塞的微球，并观察到大量心肌细胞溶解和破裂的小病灶，且细胞排列紊乱，间隙增宽，心肌组织中存在明显的炎症细胞浸润，亚心外膜层有少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；尼可地尔组中可见散在的心肌细胞溶解小病灶，心肌细胞小病灶之间的间隙变宽，以及少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；桃红通络颗粒组大鼠心肌微血管系统内可见一横截面呈珠状的物质，病变的范围和严重程度较CMD组降低。量化各组的血栓形成数量，结果显示尼可地尔和桃红通络颗粒均对血栓形成有抑制作用（均P＜0.01，图 2B）。
图 2 桃红通络颗粒可缓解CMD大鼠心肌缺血损伤A：H-E染色显示CMD组和尼可地尔组大鼠心肌组织可见典型凝固性坏死伴局部微血栓形成（红色箭头），心肌微血管系统内可见一横截面呈珠状的物质（蓝色箭头）；B：量化各组的血栓形成数量；C：TTC染色的宏观图像，蓝色箭头所示的未染色区域代表缺血组织；D：TTC染色损伤区域的定量分析（x±s）. *P＜0.05，**P＜0.01. CMD：冠状动脉微循环障碍；H-E：苏木精-伊红；TTC：2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑.下载:
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2.3 桃红通络颗粒可减轻CMD大鼠心肌缺血性损伤
用TTC染色评估心肌梗死或心脏组织内缺血性损伤程度，结果显示CMD组可见典型的苍白区域，表现出不同程度的缺血性损伤；给予桃红通络颗粒或尼可地尔可减轻CMD引起的心肌缺血性损伤（图 2C），桃红通络颗粒组和尼可地尔组大鼠心肌受损区域面积均小于CMD组（P＜0.05或P＜0.01），且桃红通络颗粒组的小于尼可地尔组（P＜0.05，图 2D）。
2.4 桃红通络颗粒抑制NLRP3炎症小体通路改善CMD
免疫组织化学染色结果显示，在CMD模型建立后ASC和caspase-1蛋白水平升高，这些蛋白主要分布在心肌细胞和间质细胞内。定量分析结果显示，CMD组的ASC、caspase-1阳性细胞数均高于假手术组（均P＜0.01），尼可地尔组、桃红通络颗粒组ASC阳性细胞数均低于CMD组（均P＜0.01），且桃红通络颗粒组ASC阳性细胞数低于尼可地尔组（P＜0.01），桃红通络颗粒组caspase-1阳性细胞数低于CMD组（P＜0.01），而尼可地尔组caspase-1阳性细胞数与CMD组差异无统计学意义（P＞0.05），见图 3A、3B。这表明NLRP3炎症小体复合物可导致CMD心肌和间质细胞内的炎症级联反应。蛋白质印迹法检测结果显示，桃红通络颗粒组NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达水平均低于CMD组（均P＜0.05，图 3C~3E），表明桃红通络颗粒对NLRP3炎症小体通路具有抑制作用。
图 3 桃红通络颗粒可阻断CMD激活的NLRP3炎症小体通路A，B：使用ASC和caspase-1抗体的代表性免疫组织化学染色图像（A）及定量分析（B）；C~E：蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织中NLRP3（C）、ASC（D）和caspase-1（E）蛋白表达（x±s）. *P＜0.05，**P＜0.01. CMD：冠状动脉微循环障碍；NLRP3：NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；caspase-1：胱天蛋白酶1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；COXⅣ：细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ.下载:
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3 讨论
本研究构建了大鼠CMD模型，以探讨桃红通络颗粒在改善CMD中的作用。结果证实桃红通络颗粒能减轻CMD诱导的大鼠心肌损伤并能改善心脏功能，机制探索发现桃红通络颗粒通过调节NLRP3/ASC/caspase-1通路来减轻CMD模型的炎症反应。
CMD是非阻塞性冠状动脉疾病相关性心绞痛患者心肌缺血的关键因素，目前尚无特异性治疗方法[21]。持续的CMD参与了多种心血管疾病的病理进程，会导致不可逆的后果，如心力衰竭和心源性猝死，因此，了解其发病机制至关重要[22-25]。冠状动脉微血管系统内炎症小体的激活可能导致CMD的炎症环境。NLRP3介导的炎症过程可损害微血管功能，导致血管收缩、内皮功能障碍和氧化应激[10-11]。鉴于CMD在心肌缺血的发病过程中发挥了重要作用，研究NLRP3炎症小体激活IL-1β和IL-18在心脏肥大和炎症中的作用显得尤其重要[26-30]。NLRP3炎症小体活性与多种心血管病变有关，包括心肌细胞焦亡、心功能不全和扩张型心肌病进展等[22-23]。此外，抑制NLRP3/IL-1β通路有望减少心脏萎缩和心肌病[29-30]。这些研究提示针对NLRP3炎症小体进行干预可能对CMD治疗有效。
现代中医认为CMD的病机属心络受损、血瘀阻络，乃属本虚标实之证。本虚则心气不足，心阳虚损，心络绌急，因气为血之帅，气虚则血行无力，血液运行不畅滞留成瘀。CMD的核心病机为“气脉失调，窠囊人络”，应采用益气、活血、通络、化痰和疏肝等治疗原则[31-32]。桃红四物汤源自吴谦的《医宗金鉴》，以四物汤补血活血，加桃仁、红花并入血分而逐血，全方养血而不滞血、活血而不破血，补中有行，破中有收，具有活血化瘀、养血补血的双重功效[33-34]。有meta分析提示桃红四物汤具有治疗不稳定性心绞痛的作用，可改善患者心功能以及血脂情况[35]。现代药理实验研究证明，桃红四物汤作用于血瘀模型可以有效加快微动脉及微静脉血流速度、扩张微血管、增加微血管管径，并降低血瘀模型大鼠全血比黏度等，有效改善血液的浓、黏、凝、聚，抑制血小板聚集[36-38]。丹参饮出自《时方歌括》，现代药理学研究表明丹参饮可减轻心肌细胞损伤[39]、坏死和凋亡[40-42]，增加心肌组织血管内皮生长因子的表达[43]，发挥对心肌缺血的预防和治疗作用。桃红通络颗粒为本课题组团队所研专利方，已完成前期临床观察。
本研究表明，桃红通络颗粒具有保护血管内皮、减轻炎症反应、改善冠状动脉血流及缓解心肌缺血的功效，其组成成分可有效抑制NLRP3炎症小体，提示其潜在的心脏保护作用。对NLRP3炎症小体复合物的调节是一种新颖且有前景的CMD抗炎治疗策略，未来可将尼可地尔和桃红通络颗粒共用，进一步探讨中西医药结合对于CMD治疗的价值。
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图 1 桃红通络颗粒可增强CMD大鼠心脏功能
A：建模后24 h各组大鼠的代表性M型超声心动图；B~D：定量分析各组大鼠的左心室EF、FS和EDV. **P＜0.01。CMD：冠状动脉微循环障碍；EF：射血分数；FS：短轴缩短率；EDV：舒张末期容积.
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图 2 桃红通络颗粒可缓解CMD大鼠心肌缺血损伤
A：H-E染色显示CMD组和尼可地尔组大鼠心肌组织可见典型凝固性坏死伴局部微血栓形成（红色箭头），心肌微血管系统内可见一横截面呈珠状的物质（蓝色箭头）；B：量化各组的血栓形成数量；C：TTC染色的宏观图像，蓝色箭头所示的未染色区域代表缺血组织；D：TTC染色损伤区域的定量分析（x±s）. *P＜0.05，**P＜0.01. CMD：冠状动脉微循环障碍；H-E：苏木精-伊红；TTC：2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑.
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图 3 桃红通络颗粒可阻断CMD激活的NLRP3炎症小体通路
A，B：使用ASC和caspase-1抗体的代表性免疫组织化学染色图像（A）及定量分析（B）；C~E：蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织中NLRP3（C）、ASC（D）和caspase-1（E）蛋白表达（x±s）. *P＜0.05，**P＜0.01. CMD：冠状动脉微循环障碍；NLRP3：NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；caspase-1：胱天蛋白酶1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；COXⅣ：细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ.
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