海军军医大学学报  2025, Vol. 46 Issue (1): 72-78 |
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应激又称为压力，是当身体应对超出自身所能承受的刺激时所表现出的一种系统性的、非特异性的反应[1]。伴随着社会生活和工作节奏的加快，当代人各个层面的压力正在不断增加，越来越多的人出现各种躯体和精神方面的异常症状。关于应激对食欲的影响已有大量研究，然而应激源停止（或脱离应激环境）后食欲的变化及机制的相关研究甚少。下丘脑是机体神经中枢影响摄食行为的核心，也是应激影响的主要脑区，其中紧邻第三脑室的弓状核是下丘脑中影响食欲的一个重要核团，包含多个与食欲调控有关的影响因子[2]。在众多动物应激模型中，慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）与人类心身疾病具有高度相似性，因此本研究采用此模型，通过观察C57BL/6小鼠体重和摄食量变化，检测下丘脑食欲调节因子食欲素1型受体（orexin 1 receptor，OX1R）、瘦素受体（leptin receptor，LEPR）和刺鼠相关蛋白（agouti-related protein，AgRP）的表达，探讨应激依赖性的食欲变化机制。
1 材料和方法 1.1 动物模型的构建与分组C57BL/6小鼠，雄性，6~8周龄，体重18~22 g，由上海杰思捷实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0004]提供。将小鼠随机分为对照（Ctrl）组（n=16）和应激（CUMS）组（n=16）。小鼠在12 h光照/12 h黑暗循环、温度20~25 ℃、相对湿度65%~75%、自由摄食和饮水的条件下饲养1周后进行实验。
CUMS组小鼠每周随机进行7种应激（味道刺激、昼夜颠倒、束缚、潮湿垫料、空笼、频闪、强光照射36 h[3]），连续11周，建立CUMS模型。对照组正常饲养。记录小鼠摄食量和体重。通过悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为，验证模型是否建立成功。模型建立成功后（第12周），从两组各随机取8只小鼠收集全脑、下丘脑组织；两组各剩余的8只小鼠重新编组为应激停止（C-CUMS）组和应激停止对照（C-Ctrl）组，继续观察3周后，于第15周取全脑、下丘脑组织。全脑组织立即放入多聚甲醛溶液固定，随后进行石蜡包埋、切片；下丘脑组织立即放于-80 ℃冰箱保存待测。
1.2 qPCR检测小鼠下丘脑食欲调节因子mRNA的表达取小鼠下丘脑组织放于1.5 mL离心管中，加入1 mL RNAiso Plus裂解液（货号9109，日本TaKaRa公司），使用组织研磨机研磨；匀浆后置于冰上，加入200 μL氯仿（货号67-66-3，昆山金城试剂有限公司），用漩涡振荡器剧烈震荡15 s后，4 ℃、16 000×g离心15 min；取上清液，加入500 μL异丙醇（货号67-63-0，上海麦克林生化科技股份有限公司），混合均匀，4 ℃静置10 min后，4 ℃、16 000×g离心15 min；弃上清液，加入1 mL 75%乙醇（山东利尔康医疗科技股份有限公司）漂洗后，4 ℃ 6 300×g离心5 min；弃上清液，室温干燥25 min至沉淀透明，加入DEPC水[货号B501005-0500，生工生物工程（上海）股份有限公司]溶解RNA。将获得的RNA按照反转录试剂盒（货号RR036A，日本TaKaRa公司）的步骤操作，获得cDNA。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，采用qPCR法检测小鼠下丘脑食欲调节因子OX1R、LEPR、AgRP mRNA的表达。β-actin正向引物5'-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3'，反向引物5'-ATGCCACAGGATTCCATACC-3'；OX1R正向引物5'-CAGGCTTTGTGCAAGGTCAT-3'，反向引物5'-CTTGAACAACAGTGGGTGGC-3'；LEPR正向引物5'-ATGACGCAGGGCTGTATGTC-3'，反向引物5'-TGGACTGTTGGGAAGTTGGTAG-3'；AgRP正向引物5'-GGAAGCAGTCACGTGTGGACCC-3'，反向引物5'-AGTGGAGCCACGCCCATCTGG-3'。按照试剂盒（货号RR420A，日本TaKaRa公司）说明书配制扩增体系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌水6.8 μL。将扩增体系分别加入八联管，使用QuantStudio 1荧光定量PCR仪（美国赛默飞公司）进行检测。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.3 免疫组织化学染色检测小鼠下丘脑AgRP和LEPR蛋白的表达取小鼠全脑组织切片，经二甲苯、无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇脱蜡至水后，用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min；室温下于通透液中浸泡15 min，用PBS缓慢振荡洗涤6次、每次5 min；通过煮沸法进行抗原修复，将切片置于沸水浴中20 min，冷却至室温后用PBS缓慢振荡洗涤6次、每次5 min；加入内源性过氧化物酶阻断剂（3%过氧化氢溶液）孵育15 min，用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min；采用山羊血清在室温下孵育10 min；加入稀释好的一抗（LEPR抗体：货号20966-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司；AgRP抗体：货号ab254558，英国Abcam公司），4 ℃孵育过夜；第2天在室温下复温30 min，用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min，洗去未结合的一抗；加入对应一抗种属的二抗试剂（货号PV-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育25 min，用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min；加入HRP标记的链霉卵白素试剂，室温孵育15 min，用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min；避光加入按比例稀释的DAB显色剂，室温孵育，在显微镜下观察5~15 min，发现变色后放入自来水中终止显色，用PBS缓慢振荡洗涤5次、每次3 min；用苏木精染核30 s；加入5%冰乙酸分化30 s；流水冲洗1 h；70%、80%、90%、100%乙醇分别冲洗30 s；二甲苯浸泡1 min；中性树脂封片。
1.4 统计学处理应用GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据分析和绘图。呈正态分布的计量资料以x±s表示，任意两组间的比较采用独立样本t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 CUMS对小鼠摄食量及体重的影响CUMS组小鼠第2~11周累积摄食量均高于Ctrl组（均P＜0.05，图 1A），11周内两组小鼠体重差异无统计学意义（均P＞0.05，图 1B）。有趣的是，停止应激3周后，第15周时C-CUMS组小鼠累积摄食量少于C-Ctrl组（P＜0.05，图 1C）。第11周时CUMS组和Ctrl组小鼠体重差异无统计学意义（n=16，P＞0.05，图 1B），但C-CUMS组第11~15周体重均低于C-Ctrl组（n=8，均P＜0.05，图 1D）。以上结果表明CUMS对小鼠的食欲有重要影响。
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图 1 各组小鼠累积摄食量和体重的变化 Fig 1 Changes of cumulative food intake and body weight of mice in each group A, C: Changes of cumulative food intake; B, D: Changes of body weight. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Ctrl group at the same week; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs C-Ctrl group at the same week. n=16 in Ctrl and CUMS group, n=8 in C-Ctrl and C-CUMS group, x±s. Ctrl: Control; CUMS: Chronic unpredictable mild stress; C-Ctrl: Cessation-control; C-CUMS: Cessation-CUMS. |
采用悬尾实验和强迫游泳实验评价小鼠抑郁样行为，CUMS组小鼠的悬尾不动时间和水中漂浮时间均长于Ctrl组小鼠[（42.82±8.07）s vs（26.48±6.44）s，（223.01±14.27）s vs（165.12±20.39）s，均P＜0.01]。以上实验结果表明小鼠出现了明显的抑郁样行为，CUMS模型构建成功。
2.3 CUMS对小鼠下丘脑组织中食欲调节因子表达的影响qPCR检测结果（表 1）显示，CUMS组小鼠下丘脑组织中OX1R mRNA和AgRP mRNA表达量较Ctrl组升高（均P＜0.01），LEPR mRNA表达量较Ctrl组下降（P＜0.01）。停止应激3周后，C-CUMS组与C-Ctrl组小鼠下丘脑组织中OX1R mRNA和AgRP mRNA表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05），但C-CUMS组LEPR mRNA表达量较C-Ctrl组升高（P＜0.01）。以上实验结果表明，CUMS导致下丘脑组织中促食欲因子OX1R mRNA和AgRP mRNA表达量升高、抑食欲因子LEPR mRNA表达量降低，应激停止后LEPR mRNA表达水平提高，提示食欲调节因子在CUMS导致的食欲变化中起着重要作用。
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表 1 qPCR检测各组小鼠下丘脑组织中食欲调节因子的mRNA相对表达量 Tab 1 mRNA expression of appetite-regulating factors in hypothalamus of mice in each group detected by qPCR |
免疫组织化学染色结果显示，CUMS组小鼠下丘脑弓状核中AgRP蛋白表达水平较Ctrl组升高（P＜0.05），而C-CUMS组与C-Ctrl组比较小鼠下丘脑弓状核中AgRP蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图 2。以上结果表明CUMS激活了小鼠下丘脑弓状核中的AgRP神经元。
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图 2 各组小鼠下丘脑弓状核AgRP免疫组织化学染色结果 Fig 2 Immunohistochemical staining of AgRP in hypothalamic arcuate nucleus of mice in each group A-D: Representative immunohistochemical staining images (A: Ctrl group; B: CUMS group; C: C-Ctrl group; D: C-CUMS group); E: AgRP positive area in Ctrl group and CUMS group; F: AgRP positive area in C-Ctrl group and C-CUMS group. *P < 0.05. n=3, x±s. AgRP: Agouti-related protein; Ctrl: Control; CUMS: Chronic unpredictable mild stress; C-Ctrl: Cessation-control; C-CUMS: Cessation-CUMS. |
免疫组织化学染色结果显示，CUMS组小鼠下丘脑弓状核中LEPR蛋白表达水平较Ctrl组下降（P＜0.01），而C-CUMS组小鼠下丘脑弓状核中LEPR蛋白表达水平较C-Ctrl组升高（P＜0.01），见图 3。以上结果提示应激停止后小鼠下丘脑弓状核中LEPR可能在小鼠食欲变化中发挥关键作用。
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图 3 各组小鼠下丘脑弓状核LEPR免疫组织化学染色结果 Fig 3 Immunohistochemical staining of LEPR in hypothalamic arcuate nucleus of mice in each group A-D: Representative immunohistochemical staining images (A: Ctrl group; B: CUMS group; C: C-Ctrl group; D: C-CUMS group); E: LEPR positive area in Ctrl group and CUMS group; F: LEPR positive area in C-Ctrl group and C-CUMS group. **P < 0.01. n=3, x±s. LEPR: Leptin receptor; Ctrl: Control; CUMS: Chronic unpredictable mild stress; C-Ctrl: Cessation-control; C-CUMS: Cessation-CUMS. |
研究者会根据研究目的选择合适的应激模型，比如CUMS主要涉及味道刺激、昼夜颠倒、束缚、潮湿垫料、空笼、频闪、强光照射36 h等比较温和的刺激，实验时间较长，一般持续2~4个月[3]；慢性束缚应激每日给予小鼠3~4 h的束缚刺激，应激周期控制在2~3周[4]；睡眠剥夺应激每日对小鼠进行8~12 h的睡眠剥夺，应激周期为1~2周[5]。本实验选择CUMS为应激模型，既很好地模拟了机体在应激状态下心理和生理的变化，又避免了造模本身对躯体的直接损伤。
应激对食欲的影响具有不确定性，有研究表明应激会导致食欲下降[6]，也有研究表明应激会导致食欲上升[7]。本研究结果发现，应激第2~11周CUMS模型小鼠的摄食量较对照组小鼠升高，而在第12周应激停止后C-CUMS组小鼠摄食量有降低的趋势，并在第15周表现出与C-Ctrl组差异有统计学意义，表明CUMS对小鼠的食欲有重要影响。
下丘脑是大脑中调节全身内稳态的重要区域，是机体中枢维持能量平衡的核心，对食欲调节有重要影响[8]。已确定与食欲相关的调节因子如AgRP和促食欲素等具有促进摄食的作用，而阿片黑素促皮质激素原（pro-opiomelanocortin，POMC）、黑皮质素及瘦素具有抑制摄食的作用[9-10]。下丘脑中的AgRP是增加食欲的主要调节因子，在摄食和能量平衡中起着重要作用[11]。本研究中，CUMS组小鼠AgRP mRNA表达量和蛋白表达水平均高于Ctrl组，而C-CUMS组与C-Ctrl组比较差异无统计学意义，提示CUMS小鼠食欲调节机制可能与AgRP有关。
食欲素是一种在神经系统内广泛分布的神经肽类物质，与其受体结合后激活下游信号通路，进而参与调节摄食的生理过程[12]。食欲素以2种形式存在，即食欲素A（orexin-A）和食欲素B（orexin-B）。食欲素受体有2种亚型，即OX1R和食欲素2型受体（orexin 2 receptor，OX2R）。OX1R只对食欲素A具有亲和力，而OX2R对食欲素A和食欲素B具有相同的亲和力。与食欲素B和OX2R相比，食欲素A和OX1R在调节摄食行为方面的作用更大。有趣的是，食欲素在增加食物摄入量的同时也会增加能量消耗，导致体重下降[13-14]。本研究中CUMS组小鼠OX1R mRNA表达量高于Ctrl组，C-CUMS组与C-Ctrl组OX1R mRNA表达量的差异无统计学意义。这一结果与CUMS导致小鼠摄食量增高的情况一致，而小鼠体重无明显变化。由此推测，CUMS后小鼠食欲上升、体重却无明显变化，食欲素很可能发挥了关键作用。
瘦素是白色脂肪细胞分泌的一种蛋白质，被认为是多种生理过程（包括食欲和能量代谢）的主要调节因子之一。它通过与多种受体结合的方式调节食物的摄入，可与下丘脑中的LEPR相结合抑制食欲，也可通过多种信号转导途径作用于POMC神经元，促其产生抑制食欲的α-黑素细胞刺激素，同时亦可作用于AgRP神经元并抑制其产生促进食欲的AgRP，引起食欲降低、机体能量消耗增加[15-17]。本研究中CUMS组小鼠LEPR mRNA和蛋白的表达水平均低于Ctrl组，而C-CUMS组LEPR mRNA和蛋白的表达水平均高于C-Ctrl组，表明应激停止后小鼠食欲下降的机制可能涉及LEPR的功能调节，但相关调节通路还有待进一步研究。一般生理状态下体重的升降与摄食量多少呈正相关，本研究发现应激导致小鼠摄食量增加时体重却没有升高，可能跟应激诱导的代谢稳态失衡有关。小鼠应激时摄取的依然是标准饲料，不能补偿应激所消耗的能量，所以体重没有增加。我们推测应激时AgRP可能抑制了瘦素与LEPR的结合，产生了促进食欲的作用。
综上所述，本研究初步证明CUMS导致小鼠食欲上升，其机制可能与LEPR和AgRP的功能调节有关；应激停止后小鼠食欲下降且体重降低，LEPR可能在此过程中发挥了重要作用。
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表 1
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