2024, Vol. 45
2. 西南医科大学附属医院基建部, 泸州 646000;
3. 西南医科大学基础医学院, 泸州 646000;
4. 西南医科大学药学院, 泸州 646000
2. Department of Infrastructure, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China;
3. School of Basic Medical Sciences, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China;
4. School of Pharmacy, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China
放疗和化疗是治疗肿瘤的常规手段，但是放化疗的不良反应严重，治疗效果不佳。光热治疗（photothermal therapy，PTT）由于侵袭性小、毒性低、效率高等优点，在癌症治疗领域受到广泛关注[1]。PTT利用近红外光照射光热剂将光能转化为热能，诱导肿瘤发生不可逆损伤。吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）是一种光热剂，具备良好的光热转化效能，但稳定性差，进入体循环后易被机体快速清除，且其靶向效率低，从而严重限制了其临床应用[2]。虽然纳米制剂能改善药物稳定性，并通过高渗透长滞留效应促进药物被动靶向至肿瘤部位，但这类人工合成的纳米材料易被巨噬细胞识别并吞噬，大量药物在未到达肿瘤前就被网状内皮系统清除[3]。
学者们从天然细胞中获得灵感，开发了细胞膜仿生纳米粒，其能模拟机体内各种细胞的生理功能，减低了纳米粒的免疫原性，从而避免被网状内皮系统清除，改善药代动力学特性[4]。最重要的是，通过细胞膜修饰纳米粒表面能赋予其主动靶向病灶的能力，这极大提高了药物在肿瘤组织中的蓄积，有利于提高疗效和减少不良反应[5]。目前，很多细胞都被应用于开发仿生载体，尤其是血小板。血小板在各类肿瘤的发生、发展和转移中扮演着重要角色，这源于血小板和肿瘤细胞的相互作用[6]。血小板膜（platelet membrane，PM）仿生修饰的纳米粒在肿瘤靶向治疗中具有广阔的应用前景，探讨PM仿生修饰纳米粒在肿瘤PTT中的优势具有重要意义。
本研究制备了载吲哚菁绿血小板膜仿生脂质体（indocyanine green-loaded platelet membrane biomimetic liposome，ICG-PLP），并初步探索了其对非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌的PTT效果，现报告如下。
1 材料和方法 1.1 细胞、试剂与仪器细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院。
胆固醇（美国Sigma公司），BCA蛋白定量试剂盒、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）、磷脂（大连美仑生物技术有限公司），甲醇、二氯甲烷（成都市科隆化学品有限公司），SDS-PAGE快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司），考马斯亮蓝R250（上海麦克林生化科技有限公司），亲脂性羰花青染料（1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonatesalt；DiD）（北京兰博利德生物技术有限公司），DMEM、RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），FBS（内蒙古奥普赛生物科技有限公司），MTT（北京索莱宝科技有限公司）。
精密分析电子天平（德国Sartorius公司），激光器（长春镭仕光电科技有限公司），TU-1810SPC型紫外分光光度计（北京析普通用公司），低温离心机、Varioskan LUX型多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司），Zetasizer Nano型激光粒度仪（英国Malvern仪器有限公司），RV10型旋转蒸发仪（德国IKA公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），TCS SP8型激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公司），HT7700型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。
1.2 细胞培养小鼠巨噬细胞RAW264.7、人非小细胞肺癌细胞A549、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelialcell，HUVEC）用含有10% FBS和1%青霉素、链霉素的DMEM在5% CO2、37 ℃条件下培养。小鼠乳腺癌细胞4T1用含有10% FBS和1%青霉素、链霉素的RPMI 1640培养基在5% CO2、37 ℃条件下培养。
1.3 实验动物清洁级SD大鼠[体重（200±20）g，雌性]由西南医科大学实验动物中心提供并饲养，实验动物生产许可证号为SCXK（川）2023-0017，实验动物使用许可证号为SYXK（川）2023-0065。
1.4 ICG-PLP的制备称取1 mg ICG、8 mg胆固醇、40 mg磷脂和1 mg TPGS至圆底烧瓶中，加4 mL二氯甲烷溶解，随后于旋转蒸发仪上减压蒸发至形成均匀透明薄膜；然后加入2 mL PBS，搅拌至形成均匀混悬液，水浴超声5 min，即得载ICG脂质体（liposome，LP）ICG-LP[7]。采用梯度离心法[3]提取分离大鼠全血中的血小板，提取后的大鼠血小板经过反复冻融、100 W超声5 min得到PM。将PM和ICG-LP在黑暗中孵育30 min，再经100 W超声5 min即得ICG-PLP。用激光粒度仪检测ICG-PLP的粒径、多分散系数和zeta电位，用透射电子显微镜观察ICG-PLP形貌。
1.5 ICG-PLP包封率的测定采用文献[7-8]的方法。取ICG-PLP混悬液置于超滤管中，于14 000×g4 ℃离心30 min。滤出液经稀释处理后，采用紫外分光光度计于793 nm波长处测定其光密度，计算ICG-PLP中游离ICG的含量（W1）。另取同批次、同体积的ICG-PLP混悬液，稀释破乳后测定其光密度，计算ICG-PLP中含有的总ICG含量（W2）。包封率（%）＝（W2－W1）/W2×100%。
1.6 SDS-PAGE考察ICG-PLP中PM全蛋白用BCA蛋白定量试剂盒检测ICG-PLP和PM中的蛋白质浓度后，加入蛋白上样缓冲液，于95 ℃加热5 min。处理后的样品经10% SDS-PAGE分离，凝胶采用考马斯亮蓝溶液染色以观察膜蛋白条带。
1.7 ICG-PLP光热能力初步考察（1）光热性能：分别配制ICG浓度为15、20、25 μg/mL的ICG-PLP混悬液各1 mL，置于比色皿中，采用808 nm近红外光照射300 s（2 W/cm2），照射期间每隔30 s记录1次温度。
（2）光热稳定性：分别配制25 μg/mL的ICG溶液和同等ICG浓度的ICG-PLP混悬液各1 mL，置于比色皿中，采用808 nm近红外光（2 W/cm2）照射5 min，等待温度下降至室温，在此期间每隔1 min记录1次温度，共进行3个开/关循环。
1.8 细胞摄取实验评估巨噬细胞RAW264.7及肿瘤细胞A549、B16-F10、4T1对仿生制剂的摄取情况。将ICG替换为DiD，按1.4节方法制备DiD标记的LP和DiD标记的血小板膜仿生脂质体（platelet membrane biomimetic liposome，PLP）。将RAW264.7细胞及肿瘤细胞以5×104个/皿的密度接种于激光共聚焦皿中，于37 ℃培养过夜。随后分别在激光共聚焦皿中加入DiD标记的LP和PLP。孵育4 h后，用PBS轻柔洗涤细胞，随后采用4%多聚甲醛固定液固定细胞，再用10 μg/mL Hoechst 33342溶液对细胞核染色。处理后的细胞经PBS洗涤后，采用激光共聚焦显微镜观察。
1.9 MTT法评估ICG-PLP体外抗肿瘤效果A549、B16-F10、4T1细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板中，于37 ℃培养过夜。随后加入不同浓度的ICG、ICG-LP、ICG-PLP溶液（ICG浓度分别为0、2.5、5、10、15 μg/mL）与细胞孵育4 h，经808 nm近红外光照射5 min（2 W/cm2），对照细胞不予任何处理，继续培养至24 h，用MTT法检测细胞活力。
1.10 溶血实验将2%红细胞混悬液（500 μL）分别与等体积200、400、600、800、1 000 μg/mL的ICG-PLP溶液混合，于37 ℃下避光孵育2 h。同时，分别用2% Triton溶液（阳性对照组）、0.9% NaCl溶液（阴性对照组）与2%红细胞混悬液孵育。孵育完毕后于400×g离心10 min，并在540 nm波长处测定上清液的光密度，按公式计算溶血率[9]：溶血率（%）＝（As－An）/（Ap－An）×100%，其中As、An和Ap分别代表样品、阴性对照、阳性对照的光密度值。
1.11 细胞相容性考察HUVEC以5 000个/孔的密度接种于96孔板中，于37 ℃培养过夜。随后加入0、200、400、600、800、1 000 μg/mL的ICG-PLP溶液与细胞孵育24 h，采用MTT法检测细胞活力。
1.12 大鼠体内血液循环考察12只SD大鼠随机分为3组，每组4只，分别通过尾静脉注射游离ICG、ICG-LP、ICG-PLP（剂量为2.5 mg/kg，以ICG计）。在给药后0.16、1、2、3、4、5 h于大鼠眼眶后静脉丛取血至肝素化离心管中，并于900×g离心10 min，收集上层血浆样品，用多功能酶标仪检测血浆样品中ICG的荧光强度。
1.13 统计学处理使用GraphPad Prism 8进行数据分析，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 ICG-PLP理化特性考察所制备的ICG-PLP平均粒径为（109.77±0.76）nm，平均zeta电位为（－21.23±0.84）mV，多分散系数为0.22±0.01，平均包封率为（97.68±0.01）%。通过透射电子显微镜观察到ICG-PLP为类球形结构（图 1A），与文献[3]报道的PLP类似。SDS-PAGE结果（图 1B）显示ICG-PLP具备与PM相似的蛋白质条带，提示仿生制剂ICG-PLP制备成功。如图 1C所示，经过近红外光照射后，ICG-PLP升温显著，且与ICG的浓度呈正相关。ICG浓度为15、20、25 μg/mL时，ICG-PLP温度可分别升至大约51.17、54.33、57.83 ℃。光热稳定性实验结果显示，经过3个近红外光照射周期后ICG-PLP仍有很强的产热能力，其光热稳定性比游离ICG高（图 1D）。
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图 1 ICG-PLP理化性质初步考察 Fig 1 Preliminary investigation for physicochemical properties of ICG-PLP A: The morphology of ICG-PLP observed by transmission electron microscope; B: The sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis results of PM and ICG-PLP; C: Temperature curves of ICG-PLP irradiated by 2 W/cm2 near-infrared ray at different concentrations of ICG (n＝3, x±s); D: Temperature curves of free ICG and ICG-PLP irradiated by 3 cycles of near-infrared ray (n＝3, x±s). ICG-PLP: ICG-loaded platelet membrane biomimetic liposome; ICG: Indocyanine green; PM: Platelet membrane; PBS: Phosphate buffered saline. |
2.2 细胞摄取
如图 2显示，PLP能被肿瘤细胞大量摄取。与普通纳米粒LP组比较，巨噬细胞对PLP摄取较少。结果表明PM仿生修饰能帮助纳米粒躲避巨噬细胞吞噬，促进药物靶向至肿瘤细胞。
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图 2 肿瘤细胞和巨噬细胞对PLP的摄取 Fig 2 Uptake of PLP by tumor cells and macrophages A: Tumor cell A549; B: Tumor cell B16-F10; C: Tumor cell 4T1; D: Macrophage RAW264.7. PLP: Platelet membrane biomimetic liposome; LP: Liposome. |
2.3 肿瘤杀伤效果评价
如图 3所示，在近红外光照射下ICG-LP和ICG-PLP展示出较强的细胞杀伤能力；随着ICG浓度升高，ICG制剂的细胞毒性逐渐增强。在近红外光照射下，ICG浓度为15 μg/mL时，ICG-PLP对肿瘤细胞A549、B16-F10、4T1的杀伤效果强于ICG-LP和游离ICG（均P＜0.01），提示ICG-PLP具有很强的光毒性，能用于肿瘤治疗。
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图 3 游离ICG、ICG-LP和ICG-PLP在无或有近红外光照射下对肿瘤细胞的细胞毒性 Fig 3 Cytotoxicity of free ICG, ICG-LP, and ICG-PLP on tumor cells in absence or presence of near-infrared ray irradiation A: A549; B: B16-F10; C: 4T1. **P＜0.01. n＝5, x±s. ICG: Indocyanine green; ICG-LP: ICG-loaded liposome; ICG-PLP: ICG-loaded platelet membrane biomimetic liposome. |
2.4 大鼠体内循环时间考察
ICG-PLP在大鼠体内的滞留时间比游离ICG、ICG-LP长（P＜0.01）。给药3 h后，ICG组几乎检测不到荧光信号；给药4 h后，ICG-LP组也几乎检测不到荧光信号；给药5 h后，ICG-PLP组仍能检测到荧光信号。见图 4。
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图 4 尾静脉注射ICG、ICG-LP、ICG-PLP的大鼠血浆样本的相对荧光强度 Fig 4 Relative fluorescence intensities of plasma samples from rats injected with ICG, ICG-LP, or ICG-PLP via tail vein **P < 0.01 vs ICG group or ICG-LP group at the same time point. n＝4, x±s. ICG: Indocyanine green; ICG-LP: ICG-loaded liposome; ICG-PLP: ICG-loaded platelet membrane biomimetic liposome. |
2.5 安全性评价
在0~1 000 μg/mL的浓度范围内，ICG-PLP并未造成明显溶血，其溶血率均低于5%。采用MTT法考察仿生制剂与HUVEC的相容性，结果显示ICG-PLP对HUVEC活力无明显影响。结果表明ICG-PLP的安全性较好。
3 讨论ICG具有很好的光热转换率，但稳定性差，在水溶液中其结构会产生变化，影响其光学特性。本研究中ICG-PLP增强了ICG的光热稳定性，结果与文献报道[8]一致，这可能与纳米材料包裹ICG分子形成保护层从而将ICG与周围水环境隔离有关。ICG-PLP保留了大部分的PM蛋白，能够模仿血小板的功能。细胞摄取实验表明巨噬细胞对仿生纳米粒的吞噬较少，提示该纳米粒可通过PM伪装降低自身免疫原性，减少免疫系统的吞噬清除。其机制可能与PM上的CD47有关，CD47通过和巨噬细胞表面抑制性受体信号调节蛋白α结合，向巨噬细胞发送“不吃我”信号[10]。此外，CD47能延长仿生纳米粒的体内血液循环时间[11]。ICG半衰期短，在体内被迅速清除，本研究中ICG-PLP能延长ICG的体内循环时间，这一结果与巨噬细胞摄取实验结果相互印证。基于血小板的生理特性，PM修饰能促进仿生纳米粒被肿瘤细胞A549、B16-F10、4T1摄取。A549[12]、B16-F10[13]、4T1[14]均为表达CD44受体的肿瘤细胞，PM上的P-选择素能和肿瘤细胞上的CD44特异性结合[3]，促进仿生纳米粒被肿瘤细胞内化。因此，本研究中的仿生纳米粒显示出对A549、B16-F10、4T1等肿瘤细胞良好的靶向性。
在近红外光照射下ICG-PLP发挥了明显的抗肿瘤效果，对A549、B16-F10、4T1细胞的杀伤能力比游离ICG和ICG-LP强，原因可能为：（1）将ICG制备成ICG-PLP增强了ICG的光热稳定性，有助于增强PTT效果；（2）PM修饰促进了肿瘤细胞对仿生纳米粒的摄取，大量ICG蓄积在肿瘤细胞内可发挥更好的光毒性。安全性考察实验显示ICG-PLP的溶血率低于5%，表明其对红细胞无毒性作用[9]，同时对HUVEC几乎不造成损伤，安全性较好，该结果与文献报道[15]一致。这主要由于ICG-PLP采用的LP材料具有良好的生物相容性，且表面修饰的PM取自生物体内，因此几乎没有不良反应。
综上所述，仿生制剂ICG-PLP具有优良的光热性能和生物相容性，PM仿生修饰使其躲避巨噬细胞吞噬，延长药物在体内的作用时间，促进药物被肿瘤细胞（A549、B16-F10和4T1）识别摄取，通过PTT策略杀伤肿瘤细胞，具有高效靶向抗肿瘤的潜力。后期将开展体内靶向验证、体内光热效果考察、药效学评价及相关机制的研究。
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