2024, Vol. 45
表 1
(Tab 1)
金纳米颗粒表面催化发夹组装无酶信号放大快速荧光法检测微RNA-721
引用本文
刘英, 奚潇雨, 封加栋, 陆峰. 金纳米颗粒表面催化发夹组装无酶信号放大快速荧光法检测微RNA-721[J]. 海军军医大学学报, 2024, 45(6): 717-724 
LIU Ying, XI Xiaoyu, FENG Jiadong, LU Feng. Rapid fluorescence detection of microRNA-721 through enzyme-free signal amplification by surface-catalyzed hairpin assembly of gold nanoparticle[J]. Academic Journal of Naval Medical University, 2024, 45(6): 717-724 (in Chinese with English abstract)
金纳米颗粒表面催化发夹组装无酶信号放大快速荧光法检测微RNA-721
1. 上海理工大学健康科学与工程学院, 上海 200093;
2. 海军军医大学(第二军医大学)药学系药物分析学教研室, 上海 200433
2. 海军军医大学(第二军医大学)药学系药物分析学教研室, 上海 200433
摘要: 目的 构建一种自催化发夹组装无酶信号放大的靶标快速荧光法，用于检测靶标miRNA。方法 首先在金纳米颗粒（AuNP）表面修饰5-羧基荧光素（FAM）标记的DNA发夹探针H1，形成探针AuNP-H1，H1的荧光被AuNP猝灭。加入靶标miRNA会导致AuNP上的H1标记荧光素远离AuNP而重新发射荧光，随后H1与DNA发夹探针H2发生循环自组装，靶标循环被利用，导致荧光信号放大。将探针AuNP-H1、探针H2及不同浓度的miRNA-721共反应后，在480 nm激发波长下测定体系的荧光强度。结果 以急性心肌炎生物标志物miRNA-721为模型靶标，在优化的实验条件下使用20 μL探针AuNP-H1、50 μL 3 μmol/L探针H2（退火缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2，pH 7.4）与50 μL不同浓度（0.1~5 μmol/L）的miRNA-721在30 ℃共反应20 min，发现在520 nm处的相对荧光强度变化值（∆F＝F－F0）与miRNA-721浓度（C）呈良好的线性关系，拟合线性方程为∆F＝29 232×lgC－52 435（R2＝0.991 0）。该荧光法检测限为1.23 nmol/L。在正常人血清中的加标回收率为92.71%~104.02%。一次完整的miRNA分析可以在20 min内完成。结论 该方法可用于生物样品中miRNA-721的检测，为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段。
关键词:
荧光 无酶信号放大 催化发夹组装 微RNA-721 金纳米颗粒
Rapid fluorescence detection of microRNA-721 through enzyme-free signal amplification by surface-catalyzed hairpin assembly of gold nanoparticle
1. School of Health Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;
2. Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
2. Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
Abstract: Objective To develop a rapid fluorescence assay testing method for microRNA-721 (miRNA-721) detection using catalytic hairpin assembly for signal amplification without the need of enzymes. Methods A DNA hairpin probe H1 labeled with 5-carboxyfluorescein (FAM) was modified on the surface of gold nanoparticle (AuNP) to form probe AuNP-H1, and the fluorescence of H1 was quenched by AuNP. When the target miRNA was introduced, it caused the fluorescein modified in H1 on the AuNP to move away from the AuNP and emit fluorescence. This was followed by cyclic self-assembly between H1 and H2, and the target cycle was used to amplify the fluorescence signal. The fluorescence intensity of the system was measured at 480 nm excitation wavelength after co-reacting with the probe AuNP-H1, probe H2 and different concentrations of miRNA-721. Results When biomarker of acute myocarditis miRNA-721 was used as a model target, 20 μL of probe AuNP-H1 and 50 μL of 3 μmol/L probe H2 (annealing buffer of 20 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl2, pH 7.4) were co-reacted with 50 μL of miRNA-721 at various concentrations ranging from 0.1 to 5 μmol/L at 30℃ for 20 min. The change in relative fluorescence intensity at 520 nm (∆F＝F－F0) had a good linear relationship with the concentration of miRNA-721 (C), and the fitted linear equation was ∆F＝29 232×lgC－52 435 (R2＝0.991 0). The detection limit of this fluorescence method was 1.23 nmol/L. The recovery rate in normal human serum ranged from 92.71% to 104.02%. A comprehensive miRNA analysis could be completed in just 20 min. Conclusion The present method can be applied to detect miRNA-721 in biological samples, which providing a rapid diagnostic tool for acute myocarditis.
Key words:
fluorescence enzyme-free amplification catalytic hairpin assembly microRNA-721 gold nanoparticle
miRNA作为一种内源性非编码单链RNA，广泛存在于人体和几乎所有动植物细胞中，在细胞的增殖、发育、生长分化、凋亡、代谢及癌变等一系列生命过程中起着重要调控作用[1-2]。miRNA也存在于许多高度稳定的生物液体中，可以很容易地从血液或其他液体、细胞中提取出来。miRNA还对组织或细胞类型有很高的特异性，可见miRNA-721符合作为一种良好生物标志物的标准：高特异性、易获得性和灵敏性[3]。自2008年以来，miRNA已被确定为癌症的生物标志物，miRNA-155、miRNA-210、miRNA-21可用于诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤[4]；miRNA-378被认为是可靠的结直肠癌生物标志物[5]；血清中miRNA-221-3p、miRNA-378c-3p和miRNA-744-5p的变化有助于胃癌的早期筛查[6]；hsa-miRNA-375-APH1B、hsa-miRNA-107-CDC42SE2、hsa-miRNA-375-CELF2和hsa-miRNA-107-IL6被认为是阿尔茨海默病的潜在生物标志物[7]；在类风湿关节炎中miRNA-22的血浆浓度可被视为与疾病活动相关的潜在分子标志物[8]；miRNA-1、miRNA-19a、miRNA-208和miRNA-499等的浓度在急性心肌梗死患者的血液中持续升高，有可能成为急性心肌梗死诊断和预后的生物标志物[9]。miRNA-721作为一种新的急性心肌炎诊断生物标志物，建立其早期、灵敏、快速和特异的血液检测方法对提高急性心肌炎的诊断具有重大的临床意义[10]。由于miRNA分子较小、表达水平低、序列同源性较高、易降解，用传统的Northern印迹法[11]检测时存在步骤烦琐、耗时、灵敏度不佳和特异性差等问题。
为了满足低丰度miRNA的灵敏、定量检测需求，各种酶辅助等温扩增策略相继被开发出来，如滚环扩增[12]、环介导的等温扩增[13]和等温指数扩增反应[14]等。这些扩增技术一般需要2种或更多类型的酶，实验成本高昂且比较耗时。作为一种无酶、恒温的DNA信号放大技术，催化发夹组装技术受到越来越多的关注[15-16]。2022年Li等[17]通过基于MOF@Au@G-triplex/hemin nanozyme分子信标催化发夹组装的通用、非酶类电化学生物传感器实现了对生物样本中的miRNA-721的超灵敏检测，但该研究中样品制备和探针设计均较复杂，且目前用于miRNA检测的电化学发光传感器基本仅限在实验室使用。
本研究利用金纳米颗粒（gold nanoparticle，AuNP）猝灭荧光的特性，结合催化发夹组装技术，研究了一种检测miRNA-721的新方法。催化发夹DNA自组装无酶信号放大用于miRNA检测的原理如图 1所示，该信号放大功能由DNA发夹探针H1-5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein，FAM）功能化的AuNP和未标记的DNA发夹探针H2完成。选择急性心肌炎生物标志物miRNA-721作为靶标。
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图 1 基于AuNP催化发夹组装检测miRNA-721的实验原理图 Fig 1 Experimental schematic of miRNA-721 detection based on AuNP-catalyzed hairpin assembly AuNP: Gold nanoparticle; miRNA: MicroRNA; H1, H2: DNA hairpin probe; FAM: 5-carboxyfluorescein. |
根据miRNA-721序列，设计H1为识别探针（5'端修饰-SH、3'端修饰FAM），设计H2为辅助探针，并用Oligo7分析软件分别对其二级结构进行分析，结果显示2条发夹DNA的熔链温度均在60 ℃以上，确保了它们各自的稳定性。H1通过金硫键与AuNP共价结合，由于荧光共振能量转移效应，H1的荧光被AuNP猝灭。当加入靶标miRNA-721时，其与探针H1 5'端茎部的序列互补杂交，将H1的发夹结构打开形成H1-miRNA中间体，H1标记的FAM因远离AuNP而恢复荧光。随后该中间体通过Toehold结构域可进一步与H2发夹结构的茎环部互补杂交，触发Toehold辅助的链置换反应，形成稳定的H1-H2双链结构，置换下的miRNA-721又可以引发AuNP表面多个H1和H2探针的循环组装。通过这种方法靶标miRNA被循环利用，实现了无酶荧光信号放大。一次miRNA分析可以在20 min内完成，明显优于既往文献报道的荧光检测miRNA所需的反应时间（40~120 min）[18]。
1 材料和方法 1.1 试剂与仪器氯金酸（HAuCl4）购自上海化学试剂公司。二水合柠檬酸三钠、Tris-HCl、六水氯化镁（MgCl2·6H2O）、氯化钠（NaCl）、三（2-羧乙基）-膦[Tris-(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]盐酸盐、PBS、DEPC（无DNA、RNA酶）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，正常人血清由上海久心研生物科技有限公司提供。除另有说明，其他试剂均为分析级试剂。所有寡核苷酸（表 1）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和纯化。
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表 1 实验中所用的探针和miRNA序列 Tab 1 Sequences of probes and miRNA in this study |
超微量紫外可见光分光光度计（NanoDrop One，美国ThermoFisher Scientific公司），荧光分光光度计（FL6500，美国PerkinElmer公司），电子天平（HA-202M，日本A&D公司），多功能涡旋混合器（Vortex-Genie2，美国Scientific Industries公司），高速离心机（TG16-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司），数控超声波清洗仪（KQ-2250-DB，昆山市超声波仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），实验室纯水系统（Smart-D UV，上海和泰仪器有限公司），透射电子显微镜（HT7700 Exalens，日本日立公司），粒径电位测定仪（Zetasizer Nano ZS，英国Malvern公司）。Bio-Rad凝胶成像系统（ChemiDoc，美国Bio-Rad公司）。
1.2 AuNP的制备采用经典的柠檬酸钠还原法[19]制备AuNP，取100 mL HAuCl4溶液（1.0×10－3mol/L）加入到三颈烧瓶中，设置搅拌器加热温度为240 ℃，同时放入洗净的磁力搅拌子，等待液体加热至沸腾后，打开搅拌器保证磁力搅拌子在烧瓶的正中央旋转，以控制AuNP的均一性，设置转速为每分钟800转，在剧烈搅拌下一次性加入10 mL二水合柠檬酸三钠（3.88×10－2 mol/L）溶液。大约3 min后反应液颜色由淡黄色变为酒红色，继续在回流条件下加热搅拌25 min。随后在室温下继续搅拌30 min，缓慢冷却至室温后放于4 ℃冰箱中待用。
1.3 AuNP表面H1的修饰将7.17 μL H1-FAM（1.0×10－4 mol/L）溶液与4.5 μL新鲜制备的2.0×10－2 mol/L TCEP缓冲液混合，在室温下活化1 h，以将S-S还原为-SH。随后，将活化后的H1与250 μL AuNP混合。室温条件下孵育24 h后，每隔8 h依次加入4.39、4.54、4.84 μL 2 mol/L NaCl溶液，使溶液中盐浓度提高到0.1 mol/L。修饰结束后，16 200×g离心20 min，并用含0.05%吐温-20的PBS洗涤3次，以去除溶液中游离的H1，最后将DNA功能化的AuNP重新悬浮于PBS中，置于4 ℃冰箱中待用[20-21]。
1.4 基于AuNP催化发夹组装定量检测miRNA 1.4.1 催化发夹DNA的组装将20 μL发夹探针H1功能化的AuNP和50 μL发夹探针H2（3 μmol/L）与50 μL靶标miRNA-721以不同浓度（0.1~5 μmol/L）混合，在30 ℃下反应20 min，进行催化发夹组装信号放大。
1.4.2 荧光检测取上述反应溶液共120 μL用荧光分光光度计测定荧光强度和荧光光谱（激发波长为480 nm，发射波长为520 nm），以定量miRNA。
1.5 信号放大策略的可行性和特异性 1.5.1 可行性取4种反应液（发夹探针AuNP-H1，发夹探针AuNP-H1与发夹探针H2混合液，发夹探针AuNP-H1与靶标miRNA-721混合液，发夹探针AuNP-H1、发夹探针H2和靶标miRNA-721混合液）分别测定其荧光信号强度。通过12%非变性聚丙酰胺凝胶电泳验证miRNA-721引发的催化发夹组装信号放大策略的可行性。10 μL上样反应液包括终浓度为6.0 μmol/L的DNA、PBS、DNA上样缓冲液。凝胶电泳条件：电压120 V，60 min，室温，Tris-硼酸电泳缓冲液。凝胶电泳结束后使用核酸染料浸泡凝胶，室温震荡30 min进行染色，将染色后的凝胶置于Bio-Rad凝胶成像系统显影。
1.5.2 特异性在一系列离心管中分别加入miRNA-721、单碱基错配miRNA-721（MT1）、三碱基错配miRNA-721（MT3）、随机序列（random）、miRNA-21和miRNA-122等6种miRNA，所有miRNA浓度均为3 μmol/L。其他参数条件为20 μL AuNP-H1、50 μL H2（3 μmol/L）。在30 ℃反应20 min，以荧光分光光度计测定荧光信号强度和荧光光谱，每个样本平行3份检测。
1.6 发夹探针H1功能化的AuNP表征取制备好的AuNP经透射电子显微镜、紫外分光光度计进行表征。另取发夹探针H1功能化的AuNP进行粒径和Zeta电位表征。
1.7 关键参数的优化 1.7.1 探针AuNP-H1用量分别取15、20、25、30、35、40 μL探针AuNP-H1与50 μL探针H2（3 μmol/L）、50 μL靶标miRNA-721（1 μmol/L）混合，测定相应的荧光信号强度（S）和空白信号强度（N），计算信噪比（S/N），每个样本平行3份检测。
1.7.2 探针H2不同退火缓冲液设5种退火缓冲液进行条件优化实验，第1种为20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl，pH 7.5；第2种为20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/LMgCl2，pH 7.4；第3种为10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2，pH 7.2；第4种为10 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0；第5种为H2O。所有探针都经过95 ℃退火5 min，缓慢冷却至室温备用。分别取上述5种不同的探针H2退火缓冲液50 μL（3 μmol/L）与20 μL探针AuNP-H1和50 μL靶标miRNA-721（1 μmol/L）混合，测定相应的荧光信号强度（S）和空白信号强度（N），计算信噪比（S/N），每个样本平行3份检测。
1.7.3 反应温度将20 μL探针AuNP-H1和50 μL探针H2（3 μmol/L）与50 μL靶标miRNA-721（1 μmol/L）混合，分别置于20、25、30、37、40 ℃下测定相应的荧光信号强度（S）和空白信号强度（N），计算信噪比（S/N），每个样本平行3份检测。
1.7.4 反应时间将20 μL探针AuNP-H1和50 μL探针H2（3 μmol/L）与50 μL靶标miRNA-721（1 μmol/L）混合后，分别反应5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min后测定相应的荧光信号强度（S）和空白信号强度（N），计算信噪比（S/N），每个样本平行3份检测。
1.8 miRNA-721检测方法的线性、检测限（limit of detection，LOD）和生物样品测定 1.8.1 线性及LOD以不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5 μmol/L）的miRNA-721的对数作为横坐标，在上述优化条件下以不同浓度（0.1~5 μmol/L）体系下发生催化发夹组装反应的荧光强度（F）与空白荧光强度（F0）的差值（∆F＝F－F0）为纵坐标绘制标准曲线，并按照LOD＝3.3δ/m公式计算LOD[22]（式中δ为响应值的偏差，m为标准曲线的斜率），每个样本平行3份检测。
1.8.2 生物样品测定样品为稀释的正常人血清，在优化条件下，加入了不同浓度（0.2、0.4和4.0 μmol/L）的miRNA-721，然后根据1.4.2节方法检测荧光信号强度，并计算回收率，每个样本平行3份检测。
2 结果 2.1 验证信号放大策略的可行性如图 2A所示，发夹探针H1功能化的AuNP由于对FAM荧光的猝灭作用，发射出微弱的荧光信号（黑色曲线），当在传感系统中加入发夹探针H2时荧光强度变化不大（红色曲线），这表明在没有miRNA-721的情况下AuNP-H1和H2几乎不会发生相互杂交。当miRNA-721和发夹探针AuNP-H1混合时，传感系统的荧光强度从10 400增加到30 922（蓝色曲线），表明miRNA-721可以打开H1的发夹，使FAM远离AuNP，荧光恢复。当AuNP-H1、miRNA-721和H2共存时，荧光强度增加到58 723（绿色曲线），这表明miRNA-721可以在H2探针的辅助下激活催化发夹组装反应，实现无酶扩增。
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图 2 基于催化发夹组装的荧光传感器用于miRNA-721检测的可行性验证 Fig 2 Feasibility validation of a fluorescent sensor based on catalytic hairpin assembly for miRNA-721 detection A: Fluorescence spectra under different conditions; B: Analysis by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. The concentrations of all samples were 6.0 μmol/L. miRNA: MicroRNA; a.u.: Arbitrary unit; AuNP: Gold nanoparticle; H1, H2: DNA hairpin probe; M: Marker; 1: AuNP-H1; 2: H2; 3: miRNA-721; 4: AuNp-H1+H2; 5: AuNp-H1+miRNA-721; 6: AuNp-H1+H2+miRNA-721. |
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果（图 2B）显示，在不加入靶标时2条发夹链基本不发生杂交反应，与荧光光谱结果一致；miRNA-721与AuNp-H1共孵育后出现了1条新的颜色变浅的条带，这表明miRNA-721可以将H1的发夹打开，形成复合物。miRNA-721与AuNp-H1和H2的混合物形成了迁移速率最低的高亮新条带，说明通过靶标引发了催化发夹组装反应，形成了H1和H2双链DNA的复合条带。荧光和电泳实验的结果充分证明了miRNA-721触发的催化发夹组装具有科学上的可行性。
2.2 AuNP和发夹探针H1功能化的AuNP表征由透射电子显微镜照片（图 3A）可见，AuNP为球形的单分散体系，未观察到有团聚现象，直径约13 nm。AuNP的紫外吸收光谱中可见紫外吸收峰位于520 nm处（图 3B）。进一步利用动态光散射（dynamic lightscattering，DLS）对AuNP和AuNP-H1进行粒径检测，AuNP平均流体力学尺寸为20 nm，相较于透射电子显微镜的结果偏大，可能的原因是DLS所测到的不是AuNP的真实尺寸，而是AuNP在溶液中的水合直径，而发夹探针H1功能化的AuNP粒径增加到37 nm（图 3C），说明吸附在AuNP表面的发夹探针H1呈直立状态，导致粒径增大。AuNP和AuNP-H1的Zeta电位分别为－16.2 mV和－33.6 mV，后者具有更小的负Zeta电位。上述结果都说明，H1被成功修饰到AuNP上。
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图 3 AuNP及H1功能化的AuNP的表征 Fig 3 Characterization of AuNP and H1-functionalized AuNP A: Transmission electron microscope image of AuNP; B: Ultraviolet-visible absorption spectrum of AuNP; C: Particle size analysis of AuNP and AuNP-H1. AuNP: Gold nanoparticle; H1: DNA hairpin prode. |
2.3 关键参数的优化结果 2.3.1 AuNP-H1用量
当探针AuNP-H1的用量为15、20、25、30、35、40 μL时，AuNP-H1、H2、miRNA-721混合液的信噪比分别为4.16±0.18、4.38±0.15、4.19±0.27、3.94±0.17、3.25±0.13、3.26±0.15。在AuNP-H1用量为20 μL时体系信噪比达到最高，之后缓慢下降，在后续实验中AuNP-H1的用量为20 μL。
2.3.2 探针H2的退火缓冲液用第1、2、3、4、5种H2退火缓冲液时，AuNP-H1、H2、miRNA-721混合液的信噪比分别为2.49±0.2、4.20±0.23、3.16±0.13、2.42±0.03、2.67±0.17。用第2种探针H2退火缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2，pH 7.4）时体系信噪比优于其他4种缓冲液，后续实验采用第2种探针H2退火缓冲液。
2.3.3 反应温度20、25、30、37、40 ℃反应温度下，AuNP-H1、H2、miRNA-721混合液的信噪比分别为3.10±0.29、3.92±0.22、4.26±0.06、3.25±0.11、3.13±0.11。反应温度为30 ℃时体系信噪比最佳，在后续实验反应温度为30 ℃。
2.3.4 反应时间反应时间为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min时，AuNP-H1、H2、miRNA-721混合液的信噪比分别为3.20±0.10、4.02±0.20、4.38±0.17、5.02±0.06、4.67±0.20、4.96±0.22、4.87±0.25、5.06±0.30、4.46±0.05、5.07±0.06、4.94±0.07、4.83±0.06。反应时间为20 min时体学信噪比趋于稳定，在后续实验反应时间为20 min。
2.4 基于AuNP的催化发夹组装信号放大检测miRNA-721优化实验条件下，催化发夹组装体系的荧光信号强度随着miRNA-721浓度的增加而增强（图 4A）；520 nm处的相对荧光信号强度变化值（∆F＝F－F0）与miRNA-721浓度（C）呈良好的线性关系（图 4B）：∆F＝29 232×lgC－52 435（R2＝0.991 0），线性范围为0.1~5 μmol/L。本方法的LOD为1.23 nmol/L。
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图 4 荧光强度与miRNA-721浓度的关系 Fig 4 Relationship between fluorescence intensity and miRNA-721 concentration A: Fluorescence spectra of miRNA-721 at different concentrations. B: Linear relationship between fluorescence intensity and different miRNA-721 concentrations. ∆F＝F－F0. F and F0 are the fluorescence intensity of the system in the presence and absence of miRNA-721, respectively. n＝3, x ± s. miRNA: MicroRNA; a.u.: Arbitrary unit. |
2.5 特异性实验
在最佳反应条件下，miRNA-721、MT1、MT3、random、miRNA-21和miRNA-122的平均荧光强度分别为60 338±431、16 674±815、12 049±809、11 909±200、12 682±1552、11 736±892，MT1和MT3的荧光强度分别约为miRNA-721的28%和20%，表明该方法可以区分miRNA-721序列中的单碱基错配和三碱基错配；miRNA-21、miRNA-122、random的荧光强度与MT3相近。结果表明，该方法对miRNA-721的荧光检测具有较好的选择性。
2.6 生物样品测定稀释的正常人血清中加入0.2、0.4和4.0 μmol/L的miRNA-721后，加标回收率分别为94.02%、104.02%、92.71%，RSD分别为2.52%、3.69%、4.73%，表明本研究提出的检测miRNA-721的方法可行，在临床上可用于快速筛查急性心肌炎。
3 讨论经过一系列反应条件的优化，发现最优探针H2的退火缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/LNaCl、5 mmol/L MgCl2，pH 7.4）可以使H2正确折叠，可能是由于加入适当配比的NaCl和MgCl2后使发夹茎部的Gibbs自由能增加，部分改善了发夹探针正确折叠的质量，会相对减少具有畸形三维结构的发夹分子的形成，对降低催化发夹组装的背景噪音和提高信噪比具有至关重要的影响[23]。温度是催化发夹组装反应的另一个关键因素[24]，优化后发现荧光信号随着反应温度的升高逐渐增加，同时H1+H2背景信号也会随着反应温度的升高而增加，在30 ℃时得到最优信噪比，背景信号的增加也可能是由于在较高温度下H1的双链结构部分打开所致。催化发夹组装随反应时间的延长，H1+H2背景信号会逐渐增加，并在20 min时达到最优信噪比，原因可能是随着反应时间的增加荧光会发生猝灭，不利于实验的进行，所以尽量选择较短的反应时间[25]。
在H1和AuNP之间引入T12序列作为间隔区后，催化发夹组装反应的时间大大缩短。这可能是由于T12序列间隔区使H1与靶标结合时的空间位阻降低，从而使催化发夹组装反应速度更快[26]。
本研究提出了一种快速、无酶信号放大方法，可用于急性心肌炎生物标志物miRNA-721的检测，整个分析过程可在20 min内完成，具有潜在的临床应用前景，为急性心肌炎的早期诊断提供了一种快速检测手段。
血液中miRNA的表达水平极低，检测难度极大，本研究使用了核酸信号放大策略并首次用荧光法检测miRNA-721，实验的灵敏度相较于文献所报道的数据仍有很大的提升空间[27-28]。一方面由于探针之间可能存在交叉反应和聚集效应，导致灵敏度降低；另一方面由于存在立体位阻效应，用于识别目标的探针会被部分隐藏起来，降低了目标的负载和结合效率。此外，荧光miRNA传感器最大的缺点是高背景信号带来的灵敏度损失。
参考文献
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