2024, Vol. 45
肝癌起病隐匿，以手术切除为主的综合治疗是肝癌的首选治疗方法，但是大部分患者在确诊时已发展至肝癌中晚期，失去了手术治疗机会。WHO国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，全球新确诊肝癌人数超过90万，因肝癌死亡人数超过83万，死亡人数接近新发病人数；中国新发肝癌病例约41万例，位居癌症发病率第5位，死亡病例约39万例，高居癌症死亡率第2位[1]。肝癌的发病率稍低但死亡率偏高，这提示肝癌的治疗效果和预后相对较差[2]。因此，肝癌患者急需安全、有效的抗癌新技术以延长生存时间和提高生活质量。
三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）是一种无机化合物，化学式为As2O3，有剧毒，无臭、无味，为白色霜状粉末，是砒霜的主要成分。作为一种传统中医药，砒霜味辛、酸，性热，归肺、脾、胃、大肠经，具有蚀疮去腐、杀虫、劫痰、截疟之功效。现代医学研究发现，ATO联合全反式维甲酸可将急性早幼粒白血病患者的无病生存率提高至95%以上，达到基本治愈标准[3]。在胰腺导管腺癌中，ATO可以通过靶向肽基脯氨酰基顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1）明显抑制癌相关成纤维细胞的增殖，且联合程序性死亡蛋白1抗体治疗可以达到消除胰腺导管腺癌的效果[4]。
本研究利用DepMap和GEPIA数据库探索Pin1在人肝癌细胞系和组织中的表达情况，通过体内外实验检测ATO在肝癌中对Pin1异常激活的抑制作用，并通过RNA测序分析具体的信号通路，为寻找新的肝癌治疗策略提供参考。
1 材料和方法 1.1 DepMap数据库和GEPIA数据库中Pin1表达数据分析统计DepMap数据库23种人肝癌细胞系中Pin1的表达情况，以及GEPIA数据库中肝癌组织和正常肝组织中Pin1的表达情况并绘图。
1.2 细胞培养、传代与质粒转染小鼠肝癌细胞系H22购自中国典型培养物保藏中心，人肝癌细胞系Huh7购自中国科学院上海细胞库。H22细胞在添加10% FBS（货号C04001-500，上海逍鹏生物科技有限公司）的RPMI 1640培养基（货号L210KJ，上海源培生物科技股份有限公司）中培养。Huh7细胞在添加10% FBS的DMEM（货号L110KJ，上海源培生物科技股份有限公司）中培养。所有培养基均含有抗生素-抗真菌素三抗溶液（货号S120JV，上海源培生物科技股份有限公司）。从37 ℃培养箱（型号KBF115，德国BINDER公司）中取出细胞，用显微镜观察细胞形态和状态，去除旧培养基，用生理盐水清洗1次。加入适量胰蛋白酶，于37 ℃培养箱消化3~5 min，在显微镜下观察到细胞悬浮后，加入适量含血清培养基终止消化。随后将细胞转移到无菌离心管中，放入离心机（型号Microfuge 20R，美国Beckman Coulter公司）于140×g离心3 min。弃上清后加入适量培养基吹打混匀，接种在细胞培养皿或培养板中进行实验。当单层贴壁细胞生长密度达到80%~95%时进行细胞传代或给药处理。
1.3 ATP法检测细胞活力使用CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒（北京普洛麦格生物技术有限公司）进行实验。在96孔白色底透板中每孔接种8 000~10 000个细胞（细胞密度为30%~40%），每孔加培养基100 μL，每组设3个复孔。在第2天每孔加入含不同浓度（0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5 μg/mL）注射用ATO（北京双鹭药业股份有限公司）的培养基继续培养，H22和Huh7细胞均在加药处理48 h开始测量发光信号。室温避光融化CellTiter试剂，将CellTiter试剂和无血清培养基按1∶3的比例配成混合液。吸弃96孔白色底透板中的培养基，用生理盐水清洗1次，然后每孔加入100 μL配好的混合液，轻轻混匀，于37 ℃孵育15 min。使用多功能酶标仪（中国安捷伦科技有限公司）读取发光（全波长）信号值，以未加药孔为对照，各浓度ATO孔的测量值与对照孔测量值的比值即为各浓度ATO孔的细胞活力。
1.4 细胞免疫荧光染色在共聚焦培养小皿中加入适量Huh7细胞，用ATO（1 μg/mL）处理细胞16 h后加入4%中性甲醛溶液固定10 min，用PBS清洗1次；加入适量的0.2% TritonX-100进行样品穿孔，室温放置5 min，用TBS清洗3次；加入封闭液，室温封闭45~60 min；加入Pin1多克隆抗体（货号10495-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司，稀释比例为1∶200）、溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）多克隆抗体（货号9091S，美国CST公司，稀释比例为1∶200），于4 ℃孵育过夜，TBS清洗3次；加入对应的荧光二抗（货号分别为A11008、A21424，美国Invitrogen公司，稀释比例均为1∶200），于37 ℃避光孵育约1 h，用TBS清洗3次；再用DAPI染核10~15 min，最后用共聚焦荧光显微镜（德国Leica公司）进行观察和拍照。
1.5 蛋白质印迹法检测Huh7细胞用或不用10 μmol/L氯喹预处理3 h后再加入ATO（0.5 μg/mL或1 μg/mL）处理20 h进行检测。Huh7细胞用或不用5 μmol/L Pin1抑制剂sulfopin（别名PIN1-3；货号S9782，美国斯莱克生物科技有限公司）处理48 h进行检测。H22细胞用ATO（0.5 μg/mL或1 μg/mL）处理20 h进行检测。吸弃培养基，加入RIPA强裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（上海陶术生物科技有限公司）混合液（体积比均为100∶1），于冰上超声处理30 s破碎细胞（UP-250型超声仪，上海净信实业发展有限公司；30%强度，3 s/次，间隔1 s），4 ℃、13 201×g离心15 min。使用BCA蛋白定量检测试剂盒并通过多功能酶标仪进行蛋白质定量。根据待检测蛋白质的分子量分别配制10%和12%的SDS-PAGE胶，将胶固定在电泳槽（E260-10A-1.0型电泳仪，江苏博美达生命科学有限公司）中并倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，当蛋白质样品分离至SDS-PAGE胶底部时结束电泳。用湿转法（VE-186型转膜仪，上海天能科技有限公司）、3M滤纸、NC膜转膜80 min。转膜结束后，用5%牛血清白蛋白溶液室温封闭NC膜1 h。用TBST清洗NC膜3次，每次5 min。加入用5%牛血清白蛋白溶液稀释的Pin1多克隆抗体（货号10495-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司，稀释比例为1∶1 000）、β-连环素多克隆抗体（货号8480，美国CST公司，稀释比例为1∶1 000）、GAPDH多克隆抗体（货号AC002，武汉爱博泰克生物科技有限公司，稀释比例为1∶1 000）、β-肌动蛋白多克隆抗体（货号AC026，武汉爱博泰克生物科技有限公司，稀释比例为1∶1 000），于4 ℃过夜孵育。第2天用TBST清洗3次，每次5 min。然后加入用5%牛血清白蛋白溶液稀释的荧光二抗（货号分别为D28802-25、D20621-05，北京安诺伦生物科技有限公司，稀释比例为1∶5 000），室温避光孵育1 h，用TBST清洗3次，每次5 min。最后用Odyssey光扫描仪（北京安诺伦生物科技有限公司）进行图像扫描。
1.6 qPCR检测Huh7细胞用或不用ATO（0.5 μg/mL或1 μg/mL）处理20 h或5 μmol/L PIN1-3处理48 h后进行检测。H22细胞用ATO（0.5 μg/mL或1 μg/mL）处理20 h后进行检测。吸弃培养基，加适量生理盐水清洗1次，采用TRIzol法提取总RNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国ThermoFisher Scientific公司）测量RNA浓度。用R223-01反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）合成cDNA，将cDNA用ddH2O稀释10倍。将稀释好的cDNA、引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]和SYBR Green试剂（货号70871300，瑞士Roche公司）按比例混合成10 μL体系（384孔板），每个样品设3个复孔，使用PCR仪（LightCycler® 384孔，瑞士Roche公司）进行扩增。人Pin1正向引物序列为5’-ACAGTTCAGCGACTGCAGCTCA-3’，反向引物序列为5’-GCAGCGCAAACGAGGCGTCTT-3’；小鼠Pin1正向引物序列为5’-GAGGAAGACTTTGA-ATCTCTGGC-3’，反向引物序列为5’-TGTCCGT-AGAGCAAACGACGCA-3’；人β-连环素正向引物序列为5’-CACAAGCAGAGTGCTGAAGGTG-3’，反向引物序列为5’-GATTCCTGAGAGTCCAAAG-ACAG-3’；内参18S RNA正向引物序列为5’-CG-GCTACCACATCCAAGGAA-3’，反向引物序列为5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’。
1.7 H22细胞皮下荷瘤小鼠模型的构建生理盐水重悬的H22细胞悬液与基质胶按照1∶1的体积比混合后再次重悬，然后接种于6周龄雄性BALB/c小鼠皮下，每只小鼠接种体积为100 μL，接种细胞数量为1×106个。接种后第5~7天观察肿瘤生长情况，第7天将小鼠随机分为两组（n≥5），分别予腹腔注射PBS、ATO（3 mg/kg）处理，每2 d 1次。每2 d测量1次肿瘤体积（计算方法为0.5LW2，其中L为肿瘤最长直径，W为肿瘤最短直径）。第17天用CO2窒息法处死小鼠，然后收取新鲜肿瘤组织备用或采用石蜡包埋制作标本。
1.8 H-E染色收集小鼠肿瘤组织样本进行石蜡包埋（EG1150H型包埋机，德国Leica公司）和切片（RM2245型切片机，德国Leica公司），采用KD-PI型摊片机（金华科迪仪器设备有限公司）、KD-HI型烘片机（金华科迪仪器设备有限公司）对切片进行相应处理后常温保存。在65 ℃电热恒温箱（型号DHP-9272，上海一恒科学仪器有限公司）中烘烤组织切片1 h，然后采用Autostainer XL型全自动染色机（德国Leica公司）进行H-E染色处理。将样本切片置于苏木精染液中染色10 min，用ddH2O洗掉多余苏木精染液，迅速在盐酸乙醇分化液中涮洗2次，用缓慢流动的自来水冲洗返蓝30 min，取出片子后沥干水分，放置在ddH2O中5 min，最后用全自动染色机进行脱水处理。滴加约50 μL中性树脂，取盖玻片封片，放在烘箱中烘烤过夜，干燥后在显微镜下观察染色结果。
1.9 免疫组织化学染色将组织切片在60~65 ℃电热恒温箱中烘烤1 h后，使用全自动染色机进行脱蜡处理。脱蜡后加入3%过氧化氢溶液清洗，然后选择合适的酸性修复或碱性修复方式进行抗原修复。自然冷却到室温后，用ddH2O清洗切片3次，每次5 min，再用PBS（pH＝7.4）清洗5 min。用1%牛血清白蛋白溶液于37 ℃封闭30~60 min。吸弃封闭液，滴加Pin1多克隆抗体（货号10495-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司，稀释比例为1∶1 000）、Ki-67多克隆抗体（货号9949，美国CST公司，稀释比例为1∶1 000），每个组织切片约50 μL，于湿盒中4 ℃孵育过夜。第2天室温复温湿盒中的切片15 min，用PBS清洗4次，每次5 min，再滴加相应二抗，于37 ℃孵育30~50 min。PBS同前清洗4次后用DAB溶液（A液与B液的体积比为50∶1）显色至出现明显砖红色为止，显色时间为1~10 min。将切片放进ddH2O中终止反应，再用ddH2O清洗2次，每次5 min。然后将切片置于苏木精染液中复染10 min，用ddH2O洗去多余苏木精染液，迅速在盐酸乙醇分化液中涮洗2次，用自来水流水冲洗返蓝30 min后取出切片，沥干水分，在ddH2O中放置5 min，最后进行脱水处理。滴加中性树脂封片，待彻底干燥后在显微镜下观察染色结果。
1.10 RNA测序分析从ATO处理和未处理的H22细胞样品中分别提取总RNA（1 μg）并去除污染的DNA，按照Poly（A）法构建链特异mRNA文库并合成cDNA文库。测序前使用Agilent 4200型生物分析仪评估cDNA文库的浓度和分布，然后使用Illumina NovaSeq 6000系统进行测序。高通量测序过程完全按照制造商说明书（美国Illumina公司）进行。用Seqtk工具过滤原始reads，使用Hisat2 2.0.4软件定位基因组。使用StringTie 1.3.3b软件对基因片段进行计数。差异表达基因是指错误发现率高于阈值（q＜0.05）和差异倍数（fold-change）＞2的基因。在联川生物云平台上进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）基因集富集分析。
1.11 统计学处理所有实验重复至少3次。应用SPSS 21.0软件及GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析与绘图。数据以x±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 Pin1在人类肝癌细胞系中的表达对DepMap数据库23种人肝癌细胞系（HEP3B217、JHH7、SNU878、SNU739、SKHEP1、SNU449、JHH4、HLF、SNU182、SNU761、JHH2、JHH5、Huh7、SNU886、PLCPRF5、SNU423、SNU398、HUH1、JHH1、LI7、SNU387、JHH6、SNU475）和GEPIA数据库人肝癌组织中Pin1的表达情况进行分析，结果显示Pin1在肝癌细胞系和肝癌组织中高表达（图 1）。根据数据库和实验条件，选择Pin1表达水平相对较高的Huh7细胞进行后续实验。
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图 1 DepMap数据库人肝癌细胞系和GEPIA数据库人肝癌组织中Pin1基因的表达情况 Fig 1 Expression of Pin1 gene in human hepatocellular carcinoma cell lines in DepMap database and human hepatocellular carcinoma tissue in GEPIA database A: Analysis of Pin1 expression in 23 kinds of human hepatocellular carcinoma cell lines from DepMap database; B: Analysis of Pin1 expression in human hepatoma tissue from GEPIA database. Pin1: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1; TPM: Transcripts per million. |
2.2 ATO在体外对Pin1表达的抑制作用
ATP法检测结果显示，ATO在Huh7和H22细胞中具有明显的细胞毒性，ATO处理后Huh7和H22细胞的细胞活力均降低，IC50分别为1.087 μg/mL和0.245 9 μg/mL（图 2）。
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图 2 ATP法检测ATO对Huh7和H22细胞活力的影响 Fig 2 Effect of ATO on viability of Huh7 and H22 cells detected by ATP method n＝3, x±s. ATP: Adenosine triphosphate; ATO: Arsenic trioxide. |
免疫荧光染色结果显示，ATO处理后Huh7细胞中Pin1的表达降低（图 3A）。蛋白质印迹法检测结果显示，ATO处理后Huh7和H22细胞中Pin1表达均降低（图 3B）。qPCR检测结果显示，ATO处理后Huh7和H22细胞中Pin1在转录水平上表达下调（图 3C）。
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图 3 ATO对Huh7和H22细胞中Pin1表达的影响 Fig 3 Effect of ATO on Pin1 expression in Huh7 and H22 cells A: Immunofluorescence diagram of Huh7 cells (200×); B: Western blotting pictures; C: Results of quantitative polymerase chain reaction (**P < 0.01. n＝3, x±s). ATO: Arsenic trioxide; Pin1: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1; DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. |
2.3 ATO可能通过溶酶体途径抑制Pin1表达
预先用氯喹预处理抑制溶酶体途径后，通过蛋白质印迹法检测观察到ATO处理的Huh7细胞中Pin1表达降低被逆转（图 4A）。随后通过免疫荧光染色进行共定位分析，Pin1和LAMP1在Huh7细胞中的分布呈现一定相关性（图 4B），表明ATO可能通过溶酶体途径影响Pin1的表达。
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图 4 Huh7细胞中氯喹预处理对ATO处理后Pin1表达的影响 Fig 4 Effect of chloroquine pretreatment on expression of Pin1 in Huh7 cells after ATO treatment A: Expression of Pin1 in Huh7 cells detected by Western blotting; B: Co-localization expression of LAMP1 and Pin1 proteins in Huh7 cells detected by immunofluorescence (630× in the left 4 column images and 12 000× in the right 1 column image). Chloroquine is an autophagy lysosome inhibitor. ATO: Arsenic trioxide; Pin1: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole; LAMP1: Lysosomal-associated membrane protein 1. |
2.4 ATO在体内对Pin1表达的抑制作用
用H22细胞对小鼠进行皮下荷瘤造模后，第7天开始腹腔注射ATO（3 mg/kg，每2 d 1次）；第17天处死小鼠并取肿瘤组织，观察肿瘤体积发现ATO在体内具有一定抗肿瘤效果（图 5A）。对肿瘤组织进行H-E染色可见肝癌细胞多行排列，核质分布异常，而在ATO干预后肝癌细胞皱缩变圆（图 5B）。免疫组织化学染色结果显示，ATO治疗组小鼠肝癌组织中Pin1阳性染色和Ki-67阳性染色均减少（图 5C）。上述结果说明ATO抑制了肝癌细胞增殖及Pin1表达。
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图 5 ATO对H22细胞皮下荷瘤小鼠肝癌生长及肿瘤组织中Pin1和Ki-67表达的影响 Fig 5 Effects of ATO on hepatocellular carcinoma growth and Pin1 and Ki-67 expression in tumor tissue of H22 cell subcutaneous tumor-bearing mice A: Therapeutic effect of ATO on tumor growth; B: Hepatocellular carcinoma pathology detected by hematoxylin-eosin staining; C: Expression of Pin1 and Ki-67 in tumor tissue detected by immunohistochemical staining. ATO: Arsenic trioxide; Pin1: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1; PBS: Phosphate-buffered saline. |
2.5 ATO通过抑制Pin1调节Wnt/β-连环素通路
RNA测序数据的基因集富集分析结果显示，在ATO处理的H22细胞中Wnt/β-连环素通路相关基因显著富集（P＝0.030 9，图 6A）。蛋白质印迹法检测结果显示，在ATO处理的Huh7细胞中β-连环素表达降低（图 6B），说明ATO通过抑制Pin1减缓肝癌细胞生长可能与下调Wnt/β-连环素信号通路有关。进一步使用PIN1-3抑制Huh7细胞中Pin1的表达后，检测观察到抑制Pin1对Wnt/β-连环素通路在蛋白质水平有抑制作用（图 6C），但在转录水平没有明显影响（图 6D），这表明抑制Pin1对肝癌生长的影响可能与β-连环素的蛋白质降解有关。
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图 6 ATO处理和抑制Pin1表达对肝癌细胞Wnt/β-连环素通路的影响 Fig 6 Effects of ATO treatment and inhibiting Pin1 expression on Wnt/β-catenin pathway in hepatocellular carcinoma cells A: Gene set enrichment analysis results showed that Wnt/β-catenin pathway-related genes were significantly enriched in H22 cells after ATO treatment; B: The effect of ATO on β-catenin expression in Huh7 cells detected by Western blotting; C: The effect of PIN1-3on β-catenin expression in Huh7 cells detected by Western blotting; D: The effect of PIN1-3 on β-catenin transcriptional level in Huh7 cells detected by quantitative polymerase chain reaction (n＝3, x±s). PIN1-3, also known as sulfopin, is an inhibitor of Pin1. ATO: Arsenic trioxide; Pin1: Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1; PBS: Phosphate-buffered saline; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. |
3 讨论
Pin1是一种肽基脯氨酰基顺反异构酶，参与调节细胞增殖等多种重要细胞行为学过程。在正常组织和细胞中，Pin1的表达水平随着年龄的增长而下降[5]。然而，Pin1在大多数恶性肿瘤中广泛过表达，其过度激活与临床预后不良密切相关[6-7]。异常高表达的Pin1通过激活包括致癌Kras信号转导通路中多个分子在内的60多种癌蛋白和灭活30多种抑癌因子来促进肿瘤发生[8]。研究发现，敲除Pin1的小鼠对肿瘤有高度的抵抗性，且自身发育正常[9-10]。本研究分析发现，Pin1在肝癌中过度表达，通过ATO降低Pin1在肿瘤细胞中的表达可以抑制肝癌细胞增殖。
ATO在我国中医药领域具有悠久的研究历史，多项研究表明ATO具有抑制肝癌细胞增殖的效果[11-13]。哈佛医学院华人科学家卢坤平教授与周小珍教授等探寻了ATO靶向抑制Pin1治疗胰腺导管腺癌的可能性，结果显示ATO非共价结合Pin1活性位点，直接抑制Pin1蛋白并激发Pin1降解，从而下调Pin1水平，抑制癌细胞生长[4]。在乳腺癌中ATO和全反式维甲酸协同抑制Pin1表达，阻断β-连环素等途径，从而抑制乳腺癌细胞生长[14]。本研究观察到在抗肝癌治疗中，ATO对Pin1在蛋白质水平上有抑制作用，并通过RNA测序数据富集分析发现ATO抑制Pin1可能与Wnt/β-连环素通路有关。
Wnt/β-连环素信号通路是一条进化的高度保守信号通路，参与细胞分化、增殖等多个过程[15]。Pin1与β-连环素相互作用，抑制β-连环素的细胞核输出和蛋白质降解[16]。研究表明，Pin1表达与人食管鳞状细胞癌中的细胞周期蛋白D1表达呈正相关，且通过调节Wnt/β-连环素通路促进肿瘤发生[17]。在肝癌中Wnt/β-连环素信号通路往往过度激活[18]。本实验结果显示，ATO可能通过溶酶体途径抑制Pin1表达，并且抑制Wnt/β-连环素信号通路。
本研究结果表明，ATO在肝癌中通过溶酶体途径抑制Pin1表达，并且下调Wnt/β-连环素通路。在肝癌临床治疗中，对于Pin1异常激活和Wnt/β-连环素信号通路过度活跃的患者ATO不失为一种潜在的治疗方案。
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