肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，且发病率不断上升^[1]。由于HCC早期没有明显的临床症状，大多数患者首次诊断时已为中晚期。现有的治疗方法难以有效延长HCC患者的生存期，5年生存率约为18%^[2]。目前HCC的诊断和监测主要依靠血清生物标志物和影像学检查，甲胎蛋白作为HCC最常用的血清标志物，其对约1/3的HCC并不灵敏^[3]；而当肿瘤直径≤2 cm时，影像学检查的灵敏度和特异度大大减低。因此，需要寻找新的有效的生物标志物进行早期诊断和肿瘤疗效监测。液体活检，特别是循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）已经成为肿瘤诊断和动态检测的有用工具^[4]。本文就CTC目前常用的检测技术及其在HCC诊断和疗效预测方面的研究进行介绍。

CTC是从原发肿瘤脱落后进入外周血液并在血液中循环的肿瘤细胞。虽然CTC起源于原发肿瘤，但其与原发部位的肿瘤细胞不同，具有上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）特性，可帮助其脱离原发肿瘤并内渗到外周血液中。此外，CTC可能与成纤维细胞、白细胞、内皮细胞或血小板形成聚集体而产生CTC簇。与单个CTC相比，CTC簇具有更高的转移潜力和生存能力。然而，大多数CTC在循环中死亡，只有少数有限的CTC存活并浸润到远处器官。随着科技的发展，新兴的CTC检测技术使CTC的生物学研究趋于成熟、简便，也促进了CTC在肿瘤筛查、疗效动态监测和预后评估中的临床应用。

CTC的检测方法主要有免疫富集法和物理富集法。免疫富集法分为免疫磁珠法和利用微流控芯片的免疫吸附法。免疫磁珠法包括使用针对CTC表面特定肿瘤相关抗原的抗体来捕获CTC的阳性富集法，以及使用针对CD45抗体来耗尽背景中血细胞的阴性富集法^[5]。如CellSearch是CTC阳性富集法的代表性产品，其依赖于涂有上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、细胞角蛋白和CD45抗体的磁珠，是唯一经美国FDA批准的用于转移性癌的CTC检测方法。然而，上皮标志物（如EpCAM）在EMT过程中经常下调或丢失，使免疫捕获方法无效，并可能导致假阴性结果^[6]。阴性富集法通过使用包被CD45抗体的免疫磁珠去除背景血细胞，这种间接富集CTC的方法弥补了CellSearch高度依赖EpCAM的局限性。与阳性富集法相比，阴性富集法具有更高的灵敏度，消耗的抗体更少，富集纯度更高。免疫吸附法基于微流控芯片，微流控芯片技术利用2级磁电泳和针对白细胞的耗竭性抗体分离CTC，因其在测试前不需要对样品进行预标记和处理而获得了广泛应用，但微流控芯片在处理液体样品方面的整体效率仍然较低，在商业化应用方面也有待进一步探索。

物理富集法是通过利用CTC与血细胞之间直径、密度和电学特性等的差异来富集CTC，这些方法的特异度虽然不及免疫富集法，但是所获得的细胞群体更为全面，有助于CTC异质性分析^[7-8]。Parsortix系统是一种具有特定微尺寸微流控通道的微流控芯片，其允许直径较小的细胞通过，但会阻止CTC等直径较大的细胞。Parsortix系统通过细胞直径过滤分离CTC较为容易和可靠，但存在由于过滤阻力积累导致回收效率降低的缺陷。密度梯度离心法根据CTC与白细胞之间密度及体积等沉降系数的差异对CTC进行分离。OncoQuick^®系统结合了密度梯度离心和微孔膜过滤方法，操作简单且价格低廉，但由于容易污染血细胞，通常与其他系统联合用于CTC分离的初始步骤。基于电荷的电泳技术利用不同细胞之间电学特性的差异可以准确地选择感兴趣的细胞。DEPArray^TM系统可以将单细胞困在电泳笼中，同时将回收的单个CTC用于特异性遗传分析。物理富集法的优势是不依赖特定标志物，有利于检出异质型CTC和其他未知抗原的CTC亚型，但存在分离纯度较低、容易漏检部分体积较小的肿瘤细胞等不足。

CTC分离后需进一步鉴定验证，其鉴定方法有基于蛋白质水平鉴定CTC的方法，包括免疫荧光法和流式细胞术；也有基于核酸水平鉴定CTC的方法，包括反转录PCR、荧光原位杂交和单细胞测序等。这些CTC鉴定方法对设备及人员的要求较高，目前相关技术仍有待进一步完善以适应临床需求。

研究表明CTC可作为早期筛查HCC的生物标志物，有助于HCC患者的早期诊断和治疗及无病生存期和总生存期的延长。Qi等^[9]使用CanPatrol CTC富集技术和原位杂交技术对HCC患者血液样本中的CTC进行分类和分析，发现即使是在早期HCC中，仍有超过90%的患者CTC检测呈阳性。Cui等^[10]对18项HCC临床研究进行的meta分析结果表明，CTC阳性HCC患者的总生存率低于CTC阴性HCC患者；对5项HCC临床研究（包括339例患者）的meta分析显示，外周血中存在CTC会显著增加HCC复发的风险。因此，外周血中的CTC可能是诊断HCC的有用标志物。另外，Wang等^[11]在53.3%的早期HCC患者和52.6%的甲胎蛋白阴性HCC患者中检测到CTC，进一步分析发现CTC可以帮助识别早期HCC和甲胎蛋白阴性的HCC，并且CTC在所有HCC患者诊断中的AUC值为0.789，而当甲胎蛋白和CTC联合检测时AUC值提高为0.883，表明甲胎蛋白联合CTC可提高早期HCC检测的灵敏度。

研究表明CTC对HCC预后有预测价值。Ye等^[12]研究了HCC根治切除术后CTC计数与临床转归的关系，发现CTC计数较低（≤2/5 mL）的患者无病生存期和总生存期均优于CTC计数较高（＞2/5 mL）的患者，提示CTC计数较高的HCC患者预后较差。除了术后CTC的数量外，CTC的亚型可能与治疗反应有关，可作为HCC分子亚型的补充。Nel等^[13]检测了11例不同疗法HCC患者的CTC，发现上皮性、间质性、肝脏特异性和混合性等不同亚型的CTC在不同患者中的分布差异显著，且与治疗结局相关。值得注意的是，上皮性CTC亚型增加的HCC患者治疗结果更差。Wang等^[14]指出间质性CTC亚型是HCC早期复发的独立危险因素，术后间质性CTC计数≥1/5 mL的HCC患者术后无病生存期更短。Yin等^[15]发现扭曲蛋白（twist）阳性与较高的转移、复发和死亡率有关，表明EMT相关表型的CTC在预测HCC复发和转移方面有重要作用。另外，联合CTC和外周血常规检测对HCC患者预后也有一定预测作用。Ni等^[16]回顾性研究发现，术前中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）和CTC都与HCC预后不良有关，NLR和CTC较高的HCC患者往往表现出较短的总生存期。术前CTC联合NLR可能是根治性肝切除术后HCC预后的可靠预测指标。总之，CTC可能是诊断HCC转移和预后的生物标志物，CTC集群或亚型的动态变化为HCC复发的早期发现和干预提供了重要线索。

除了用于HCC的早期诊断、复发和预后判断之外，CTC对于HCC治疗效果的评价也有帮助。当恶性肿瘤患者肿瘤完全切除后，CTC水平急剧下降，因而术后CTC水平可作为肿瘤负荷的监测工具用于评估肿瘤是否根治性切除。Fan等^[17]将体内流式细胞技术与原位转移肿瘤模型结合进行研究，结果显示肿瘤切除后CTC的数量和早期转移明显减少，且HCC的肿瘤大小和远处转移的数量与CTC的动态变化一致。CTC还可以作为HCC长期疗效的监测指标，其动态变化反映了经导管动脉化疗栓塞、放疗和射频消融等局部治疗方法的治疗反应。Rau等^[18]采用阴性富集法检测CTC并在治疗不同时间段进行分析，发现CTC有助于动态监测血清甲胎蛋白无明显变化的HCC患者的病情。Chen等^[19]发现CTC的状态可以指导HCC患者进行移植前射频消融术，从而改善CTC阳性HCC患者的预后。Zhou等^[20]检测49例HCC患者术前EpCAM mRNA阳性的CTC和CD4阳性/CD25阳性/叉头框蛋白P3阳性的调节性T细胞水平发现，CTC和调节性T细胞水平升高与HCC患者术后复发相关。上述研究结果表明CTC能用于预测和评价肿瘤治疗效果。有学者针对CTC设计了1种多点共击纳米药物GV-Lipo/SF/DT，通过将索拉非尼和洋地黄毒苷共加载到脂质体中，并在共载脂质体表面修饰抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体和抗血管细胞黏附分子1单克隆抗体以消除原发肿瘤并抑制相关CTC扩散，从而增强转移抑制和对HCC的治疗效果^[21]。

识别表达特定肿瘤标志物和药物靶点的CTC能够更好地指导HCC患者个体化治疗。Li等^[22]发现磷酸化ERK阳性/磷酸化Akt阴性的CTC对索拉非尼敏感，这有助于选择合适的HCC患者进行索拉非尼靶向药物治疗。近年来，免疫治疗在HCC中日益增多。Winograd等^[23]评估了HCC中程序性死亡蛋白配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）阳性的CTC，发现接受抗PD-L1治疗的6例患者中有3例对治疗有反应并具有PD-L1阳性CTC，因此PD-L1阳性CTC可以作为免疫治疗的一个重要预测因子；进一步通过更大规模研究发现PD-L1阳性CTC主要存在于晚期HCC中，并且与接受抗PD-1治疗的HCC患者的有益治疗反应有关，PD-L1的表达随着免疫状态、治疗反应和疾病进展而变化。因此，精确评估CTC中PD-L1的表达状态可实时评估和监测肿瘤细胞的免疫状态。另外，一项针对HCC转移前CTC定植的潜在机制研究发现，转移前生态位来源的基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）可以下调配对相关同源框1（paired related homeobox 1，Prrx1）表达，并通过体外信号转导及转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）途径诱导HCC细胞中趋化因子CXC亚家族受体（chemokine CXC subfamily receptor 4，CXCR4）的干性、耐药性和表达增加，而Prrx1表达降低可刺激SDF-1/CXCR4信号转导并有助于HCC中CTC在器官的定植，因此，抑制STAT3和特异性阻断CXCR4具有消除晚期HCC器官转移的临床潜力^[24]。除此之外，有学者预测，使用CTC的定量和定性分子分型有望为每例患者开发个体化治疗方案，即从外周血中发现的CTC和其分型特征可能成为患者随访过程的肿瘤标志物，并且可以通过就诊时检测标志物的表达更新风险评估，从而更好地对患者进行风险分层以为其制定最佳的个体化治疗方案，最终达到改善患者预后的目的^[25]。

CTC的检测对HCC患者的早期筛查或诊断、疗效监测、预后评估甚至靶向治疗和免疫治疗的耐药性预测都有临床应用价值。然而，CTC在广泛应用于HCC之前仍然面临着重大挑战。首先，临床缺乏CTC富集和检测的标准化方法，CTC检测结果的不稳定性和不确定性可能影响诊治方案的决策。其次，在目标患者中检测CTC的成本较高，与影像学检查相比，其广泛使用受到限制。最后，许多临床研究缺乏外部验证，大多数数据基于小型、单中心、病例对照研究，患者的特征差异很大，如种族、肝病病因和HCC分期等都使得验证相对困难。因此，需要一种高灵敏度和特异度的CTC标准化检测方案，这可能需要通过使用统一的CTC检测平台及多中心、大样本量、前瞻性研究来实现。未来随着技术的进步CTC检测的不足应当能够克服，CTC检测将是HCC临床全程管理的一个突破，特别是在早期诊断方面，可为患者在发生转移前提供根治性手术机会。有限的灵敏度和特异度是CTC检测难以作为HCC独立诊断工具的重要原因，CTC与传统影像学检查方法或其他肿瘤标志物联合使用可提高早期检测的灵敏度，也会为临床提供更全面的信息并指导个体化治疗方案的决策。