氯霉素类抗生素主要包括氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素，可通过抑制细菌蛋白质的合成达到抑菌的目的。甲砜霉素和氟苯尼考分别被称为第2代和第3代氯霉素，是常用的兽药与饲料添加物^[1]。如今抗生素滥用所致的环境污染越来越严重，土壤和水源中均能测出抗生素残留，人们不仅会从家禽的肉类中被动摄入残留的抗生素，也可能会在日常饮用水中接触到抗生素^[2-4]。抗生素本身就是严格管控的药物，抗生素残留易造成孕妇流产、畸胎，危害极大^[5-6]。

目前，氯霉素类抗生素的液质联用测定方法多用于食品中残留的测定，针对孕妇这类特殊人群体内抗生素残留的检测方法较少^[7-9]。因此，建立操作简便、灵敏准确的氯霉素类抗生素尿药浓度质谱分析方法具有重要意义。本研究通过建立液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）检测孕妇尿液中3种残留的氯霉素类抗生素，并进行方法学验证，为氯霉素类抗生素的残留与孕妇不良妊娠结局的相关性研究提供方法学基础。

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪、Agilent 1946D单四极杆质谱仪购自美国Agilent公司，Mettler AE240型十万分之一电子天平购自瑞士Mettler-Toledo公司，Heal Force超纯水系统购自香港力康生物医疗科技控股集团，DNA 120高速溶剂离心浓缩仪、MICRO 17离心机购自美国ThermoFisher Scientific公司，涡旋仪购自美国Aoran科技有限公司，Oasis HLB 96-Well Plate（30 μm，30 mg）固相萃取小柱购自美国Waters公司，Resolvex^TM M10多道固相萃取仪购自瑞士Tecan公司。

对照品氯霉素（批号：130555-201704，纯度为99.8%）购自中国食品药品检定研究院，对照品氟苯尼考（批号：12616-2001，纯度≥98%）、甲砜霉素（批号：12620-2001，纯度≥98%）均购自美国Sigma-Aldrich公司，内标甲苯磺丁脲（批号：I1820190，纯度＞99%）购自美国Aladdin Industrial Corporation公司，色谱纯甲酸购自美国ACS恩科化学公司，色谱纯乙腈和甲醇购自美国Honeywell公司，水为超纯水（自制）。

色谱柱为SHISEIDO MG-C₁₈（100 mm×3.0 mm，3.0 μm），流动相采用乙腈-水（含0.1%甲酸），按0~10 min 20%~80%乙腈、10~15 min 80%乙腈梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，分析时间为15 min，平衡时间为5 min；柱温为25 ℃，进样量为2 μL。

采用电喷雾离子源，负离子模式。离子源参数：毛细管电压3 500 V；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi（1 psi＝6.895 kPa）；干燥气温度350 ℃。选择离子模式检测离子为[M－H]^－：氯霉素m/z 320.8、氟苯尼考m/z 355.8、甲砜霉素m/z 353.8、甲苯磺丁脲（内标）m/z 268.9，碎片电压100 V。

精密称取氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素对照品各1.0 mg，置于1.5 mL棕色离心管中，用移液器（已校准）加入1.0 mL甲醇溶解，涡旋混匀，配制成1.0 mg/mL的对照品储备液，平行配制2份，其中1份为标准曲线对照品储备液，另1份为质控对照品储备液；用移液器（已校准）取上述标准曲线对照品储备液适量，配制成每一种待测物浓度均为100 μg/mL的混合标准品溶液，用甲醇逐级稀释，配制成每一种待测物质量浓度分别为100、200、400、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000 ng/mL的系列对照品溶液。同法制备质量浓度分别为100、200、1 000、8 000 ng/mL的质控对照品溶液，置于－20 ℃冰箱保存，待用。

精密称取甲苯磺丁脲对照品约1.0 mg，置于1.5 mL离心管中，用移液器（已校准）加入1.0 mL甲醇溶解，涡旋混匀，配制成1.0 mg/mL的内标储备液，用甲醇稀释5 000倍，得质量浓度为200 ng/mL的内标溶液，置于4 ℃冰箱保存，待用。

取空白尿液570 μL，精密加入按2.2.1节制备的系列标准溶液30 μL，旋涡混匀，配制成质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、400、500 ng/mL的标准含药尿样。同法制备质量浓度分别为5、10、50、400 ng/mL的质控样品溶液，待用。

采用固相萃取方法，按以下步骤处理。（1）活化：使用600 μL甲醇与600 μL超纯水活化柱子；（2）上样：取500 μL含药尿样与100 μL 200 ng/mL内标溶液加入固相萃取小柱上样；（3）淋洗：使用1 mL 20%甲醇水溶液淋洗柱子；（4）洗脱：取1 mL甲醇进行萃取洗脱，留下萃取液。将萃取液置于1.5 mL离心管中，放入离心浓缩仪，加热旋转挥干，取100 μL 50%甲醇水溶液复溶，旋涡混匀30 s，以9 380×g高速离心5 min，取80 μL上清液放入进样瓶中，进行LC-MS分析。

分别取6个健康空白尿样（本院健康体检者尿样）、质控样品和实测样品各500 μL，按照2.3节的前处理方法操作，进样分析，获得空白尿液样品色谱（图 1A）、质控样品色谱（图 1B）和实测样品色谱（图 1C）。氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和内标甲苯磺丁脲的保留时间分别为5.8、5.4、3.1和8.4 min。结果表明，空白尿液中的内源性成分不干扰氯霉素类抗生素和内标出峰，选择性良好。

图 1 空白尿液（A）、质控样品（B）、实测样品（C）中3种氯霉素类抗生素的液相色谱-质谱图

取2.2.3节制备的标准含药尿样500 μL，按照2.3节的前处理方法操作，进样分析，获得色谱图，以各待测物尿样浓度为横坐标（X）、每个待测物与内标峰面积比为纵坐标（Y）进行回归，使用1/X加权，氯霉素回归方程为Y＝0.010 2X+0.069 4（r＝0.999 6），氟苯尼考回归方程为Y＝0.006 7X+0.023 3（r＝0.999 5），甲砜霉素回归方程为Y＝0.005 6X－0.009 1（r＝0.999 2）。结果表明，尿液中的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素在5~500 ng/mL范围内线性关系均良好。以信噪比＞10确定，定量下限为5 ng/mL，即标准曲线的最低点。

按照2.2.3节配制氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素4个浓度质控样品，每个浓度平行配制5份并建立随行标准曲线，再按照2.3节的前处理方法操作，进样分析。每天配制质控样品定量下限、低浓度、中浓度、高浓度（5、10、50、400 ng/mL）各5份，进样分析，连续3 d，计算批内、批间的精密度和准确度。用RSD和相对误差（relative error，RE）分别表示精密度和准确度，结果表明，氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素批内和批间的RSD均＜8.9%，∣RE∣均＜9.3%，符合方法学要求。

取6个不同来源的空白尿液，相当于质控样品低、高浓度（10、400 ng/mL）下进行考察。先按照2.3节的前处理方法（不加内标）制备萃取液，然后加入混合标准品溶液及内标标准溶液，使得其终浓度与处理后的质控样品低、高浓度一致；同时配制同样浓度不含尿液基质的混合标准品溶液和内标的甲醇溶液，进样分析。分别计算氯霉素类抗生素和内标的峰面积，得出基质因子和经内标归一化的基质因子（表 1）。结果表明，变异系数RSD均＜15%，符合方法学要求。

表 1 (Tab 1)

表 1 基质效应的实验结果  %, n＝6 化合物 基质因子 内标基质因子 归一化基质因子 变异系数 氯霉素10 ng·mL－1 98.59 82.13 120.56 9.52 氯霉素400 ng·mL－1 59.24 72.56 81.70 8.76 氟苯尼考10 ng·mL－1 42.50 84.31 50.65 11.12 氟苯尼考400 ng·mL－1 32.24 72.18 44.51 14.65 甲砜霉素10 ng·mL－1 108.30 84.31 129.44 13.50 甲砜霉素400 ng·mL－1 83.77 72.18 116.66 9.64

表 1 基质效应的实验结果

取同一来源的空白尿液，在相当于质控样品低、中、高浓度（10、50、400 ng/mL）下进行考察。先按照2.3节的前处理方法（不加内标）制备萃取液，然后加入混合标准品溶液及内标标准溶液，使其终浓度与处理后的质控样品低、中、高浓度一致；同时按照2.2.3节和2.3节的方法配制和处理3个浓度的质控样品，每个浓度平行制备5份，分别进样分析，记录色谱图。通过峰面积计算氯霉素类抗生素的提取回收率（表 2）。结果表明，精密度RSD均＜9.2%，符合方法学要求。

表 2 (Tab 2)

表 2 提取回收率的实验结果  %, n＝5 化合物 回收率 精密度 氯霉素10 ng·mL－1 83.95 5.67 氯霉素50 ng·mL－1 90.26 5.68 氯霉素400 ng·mL－1 88.03 8.06 氟苯尼考10 ng·mL－1 71.37 4.72 氟苯尼考50 ng·mL－1 98.37 9.13 氟苯尼考400 ng·mL－1 108.46 8.98 甲砜霉素10 ng·mL－1 86.81 6.68 甲砜霉素50 ng·mL－1 73.46 8.73 甲砜霉素400 ng·mL－1 78.85 8.75

表 2 提取回收率的实验结果

配制新鲜的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和内标储备液1.0 mg/mL，考察对照品储备液在－20 ℃下避光放置30 d的稳定性，结果表明，∣RE∣均≤2.7%，储备液稳定性良好。然后在质控样品低、高浓度（10、400 ng/mL）时分别考察以下4种条件下抗生素的稳定性：室温放置3 h、冷藏冰箱（4 ℃）放置24 h、冻融循环3次及超低温冰箱（－80 ℃）冻存放置30 d，每个浓度平行测定3份。按照2.3节的前处理方法操作，进样分析，分别将氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和内标峰面积的比值代入随行标准曲线，求得实际浓度并计算RE和RSD，结果见表 3，稳定性良好。

表 3 (Tab 3)

表 3 稳定性的实验结果  %, n＝3 化合物 室温放置3 h 4 ℃放置24 h 冻融循环3次 －80 ℃冻存30 d RSD RE RSD RE RSD RE RSD RE 氯霉素10 ng·mL－1 2.58 5.33 5.68 3.56 3.36 2.48 3.11 6.13 氯霉素400 ng·mL－1 1.55 10.63 5.00 4.59 5.24 2.91 5.19 －10.28 氟苯尼考10 ng·mL－1 2.98 3.40 3.73 4.68 2.89 5.53 3.77 11.75 氟苯尼考400 ng·mL－1 4.58 9.87 6.27 4.19 9.62 －1.04 3.59 4.20 甲砜霉素10 ng·mL－1 4.39 5.07 0.49 5.52 2.52 3.82 2.76 11.20 甲砜霉素400 ng·mL－1 3.24 3.98 2.26 2.51 3.79 －4.32 4.31 8.17 RSD：相对标准偏差；RE：相对误差.

表 3 稳定性的实验结果

通过在定量上限500 ng/mL测定完成之后立即检测空白样品来评估残留情况。结果显示，分析物保留时间处峰面积小于最低定量限的20%，内标保留时间处的峰面积小于实际内标的5%，表明该方法几乎无残留，不影响测定。

通过使用空白基质将高于定量上限10倍（5 μg/mL）和100倍（50 μg/mL）浓度的样品稀释至定量范围内（5~500 ng/mL）来评估稀释可靠性，每个浓度平行测定5份。结果表明，不同浓度、不同抗生素的RSD和∣RE∣均＜15%，符合方法学要求，表明样品稀释不影响测定的精密度和准确度。

按照2.3节的前处理方法操作，进样分析，共检测了18份不同孕期孕妇的尿液样本（上海市第一妇婴保健院门诊孕妇尿液样本），包含孕早期、孕中期和孕晚期的尿液样本各6份。结果发现，大部分样品中都能检测到氯霉素，但浓度都低于定量下限。有少量样品能测出氟苯尼考有十几纳克的残留，属于异常值，因样本数量较少并不能下结论。这18个样品中完全没有检测到有甲砜霉素的残留。

前处理方案的优化中，比较了不同比例的淋洗液和洗脱液来选择最优方案，如10%、20%、30%的甲醇水溶液，结果发现20%甲醇水溶液作为淋洗液既不会留下太多杂质，也不会洗掉太多待测物（表 4）。在洗脱液的比较中选择了1 mL甲醇、1 mL 50%甲醇水溶液及2次1 mL甲醇，结果发现，1 mL甲醇作为洗脱液时洗脱能力好并且比2次1 mL甲醇挥干节约时间（表 4）。

表 4 (Tab 4)

表 4 不同淋洗液的淋洗效果及不同洗脱液的洗脱效果比较 化合物 淋洗效果（峰面积） 洗脱效果（峰面积） 10%甲醇水溶液 20%甲醇水溶液 30%甲醇水溶液 1 mL甲醇 1 mL 50%甲醇水溶液 2次1 mL甲醇 氯霉素100 ng·mL－1 311 059 321 215 228 427 336 423 290 575 339 542 氟苯尼考100 ng·mL－1 265 477 328 223 256 016 329 156 226 177 330 129 甲砜霉素100 ng·mL－1 228 736 246 082 182 806 256 347 170 615 257 845 甲苯磺丁脲200 ng·mL－1 248 615 265 368 194 193 273 546 177 841 274 586

表 4 不同淋洗液的淋洗效果及不同洗脱液的洗脱效果比较

通过查阅文献选择乙腈-水（含0.1%甲酸）作为流动相。实验中比较了等度洗脱与梯度洗脱，见图 2，结果发现梯度洗脱能将3个待测物以及内标很好地分离开来，峰形俱佳，因此选择梯度洗脱作为本实验的洗脱条件。

图 2 等度洗脱（A）和梯度洗脱（B）测定3种氯霉素类抗生素的液相色谱-质谱图 等度洗脱时，流动相为乙腈-水(含0.1%甲酸)；梯度洗脱时，0~10 min 20%~80%乙腈，10~15 min 80%乙腈.

在收集的孕妇尿液样本中，选取孕早期、孕中期、孕晚期的尿液样本各6份，均已排除2周内使用过抗生素的孕妇的样本。最终测得的抗生素的残留量非常小，但我们并不能忽略其危害性。有文献报道，有机磷阻燃剂pg级别的残留量也会给孕妇带来危害^[10]。

综上所述，本研究建立了操作简便、准确、重现性好的测定孕妇尿液中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素含量的LC-MS方法。样品以固相萃取法处理，最低定量限为5 ng/mL，回收率高，标准曲线线性良好，可为氯霉素类抗生素的残留与孕妇不良妊娠结局的相关性研究提供方法学基础。