2024, Vol. 45
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是引起寨卡病毒病的病原体，主要通过伊蚊叮咬、母婴垂直途径、性接触、血液或血液制品等进行传播，感染后常见的临床症状包括发热、头痛、皮疹、关节痛和结膜炎等。此外，ZIKV感染还与多种神经系统并发症有关，如新生儿小头畸形、吉兰-巴雷综合征及脑膜脑炎等[1]。目前，对ZIKV感染尚无有效的治疗药物和疫苗，只能采取对症支持治疗。深入探索ZIKV的致病机制可为抗病毒药物研发和临床治疗提供科学依据。
转录组测序技术又称RNA-seq技术，是近年来发展较为成熟的一种高通量测序技术，也是研究病毒与宿主细胞相互作用的重要手段。已有学者利用转录组测序技术在ZIKV感染的不同细胞和动物模型中开展了基因转录水平分析及相关机制研究，如有研究发现ZIKV感染非洲绿猴肾细胞Vero后能诱导细胞凋亡，差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)主要富集于凋亡相关信号通路[2]；而ZIKV感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y后，参与线粒体损伤和细胞凋亡的基因显著上调，并观察到ZIKV包膜蛋白E与线粒体共定位的现象[3]；利用ZIKV感染小鼠胚胎脑组织进行的转录组分析数据显示，ZIKV感染诱导的DEG主要与免疫反应有关[4]。然而，关于ZIKV感染诱导神经细胞损伤的机制尚未阐明，有必要进一步对ZIKV感染的神经细胞开展转录组学研究。
本研究应用转录组测序技术对ZIKV感染的SH-SY5Y细胞进行转录组分析，以未感染病毒的细胞作为对照，筛选出ZIKV感染诱导的DEG，并进一步分析DEG的功能及它们在ZIKV感染过程中可能参与的生物学过程和信号途径，以期从分子水平了解ZIKV感染人神经细胞后的宿主反应特点，为后续深入研究ZIKV感染引起宿主神经系统病变的分子机制奠定基础。
1 材料和方法 1.1 实验材料与仪器人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、人肺癌肺泡基底上皮细胞A549、人肝癌细胞Huh7均为本教研室保存。SH-SY5Y、HUVEC、A549、Huh7采用DMEM完全培养基培养。ZIKV(GZ01菌株)由北京微生物与流行病学研究所秦成峰教授提供。DMEM和FBS购于美国ThermoFisher Scientific公司；裂解液RNAiso、PrimeScript反转录试剂盒、TB Green qPCR检测试剂盒购于日本TaKaRa公司；裂解缓冲液、带有Oligo(dT)的磁珠、Agilent 2100生物分析仪、Illumina HiSeq平台均由上海中科新生命生物科技有限公司提供；7300 Plus qPCR仪、96孔或8连排qPCR反应板购于美国Applied Biosystems公司。
1.2 转录组样品提取与检测首先将SH-SY5Y细胞种于6个10 cm2平皿，每3个平皿为1组，共分为2组(感染组和对照组)。待第2天细胞密度达到80%~90%时，用ZIKV以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1感染SH-SY5Y细胞，对照组加入等体积的DMEM，于37 ℃用含5% CO2培养箱培养2 h后，弃去病毒液和对照培养基，换成新鲜培养基。根据前期预实验结果及ZIKV感染SH-SY5Y细胞后不同时间点的细胞状态和关键细胞途径(如信号转导、自噬、脂代谢等)活化情况，将两组细胞继续培养至24 h，弃去培养基，加入PBS洗涤细胞2次，用1 mL RNAiso裂解细胞，提取细胞总RNA。对照组细胞样品命名为SY-1、SY-2、SY-3，感染组样品命名为SY-4、SY-5、SY-6。用Agilent 2100生物分析仪检测RNA样品的纯度、浓度及RNA的完整性，RNA完整性指数＞8可进行后续分析。
1.3 文库构建与转录组测序样品经检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA。随后加入裂解缓冲液将mRNA进行随机打断。以mRNA为模板反转录合成cDNA，将双链cDNA纯化后再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，最后进行体外PCR扩增得到cDNA文库。文库构建完成后，对文库的插入片段长度和有效浓度进行检测，以保证文库质量。质检合格后，采用Illumina HiSeq平台对cDNA文库进行转录组测序。
1.4 测序数据质量评估为确保后续分析的质量和可靠性，需对测序结果进行质检，主要包括去除接头序列及过滤掉低质量(碱基平均质量值＜20)和无法确定的碱基数量＞5的读数。同时对净读数进行碱基质量值和GC含量计算。
1.5 DEG的筛选采用DESeq2软件进行两组之间基因的差异表达分析。将P＜0.05、|log2(差异倍数)|＞1作为DEG的筛选标准。
1.6 DEG的功能注释及富集分析对筛选出的DEG进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能注释分析和分类。然后将所有DEG与参考基因的GO功能注释结果进行对比，通过Fisher确切概率法分析选出所有DEG富集的功能类别(筛选标准为P＜0.05)。通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库预测DEG参与的信号通路和细胞途径。最后用分子相互作用分析工具STRING(https://cn.string-db.org/)预测DEG编码的蛋白质之间的相互作用。
1.7 qPCR验证根据DEG分析结果，挑选6个上调基因、5个下调基因进行qPCR验证。用ZIKV以MOI为1感染SH-SY5Y、HUVEC、A549、Huh7细胞24 h，提取ZIKV感染及未感染细胞的总RNA，用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，然后使用TB Green qPCR检测试剂盒进行qPCR扩增。扩增反应体系为上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL、TB Green Premix Ex Taq DNA聚合酶10 μL、ROX参考染料(ROX Reference Dye) 0.4 μL、ddH2O 6.8 μL。引物序列见表 1。qPCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，反应40个循环；溶解反应95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH为内参，目的基因的相对表达水平采用2－ΔΔCt法计算，其中ΔΔCt＝(Ct目的基因－Ct内参基因)感染组－(Ct目的基因－Ct内参基因)空白对照组。通过双侧独立样本t检验进行组间分析，检验水准(α)为0.05。
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表 1 基因引物序列（5’-3’） Tab 1 Gene primer sequences (5'-3') |
2 结果 2.1 测序数据及其质量分析
利用Illumina HiSeq平台共检测了2组样品(ZIKV感染组和对照组，每组样品各有3个重复)，每组样品平均有11.84 Gb的数据。如表 2所示，ZIKV感染组和对照组的原始测序数据经过滤后，碱基质量值Q20均＞98%，Q30均＞95%，GC含量约为50%，表明经质控后获得了高质量的测序数据，可用于后续分析。
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表 2 测序数据质量分析结果 Tab 2 Quality analysis results of sequencing data |
2.2 ZIKV感染组与对照组DEG的筛选
本次转录组测序共检测了38 196个基因，其中27 455个为已知基因，10 741个是新基因。在ZIKV感染组和对照组中均能检测到的基因共有32 162个，非共有基因为6 034个(ZIKV感染组和对照组分别为3 044和2 990个)。差异表达分析结果显示，ZIKV感染SH-SY5Y细胞后，共检测到259个DEG，其中172个基因表达上调，87个基因表达下调。DEG在6个不同样品中的表达情况见图 1A。与对照组相比，ZIKV感染后表达上调的前10个基因为纤维调节蛋白(fibromodulin，FMOD)、骨膜蛋白(periostin，POSTN)、Kruppel样因子15(Kruppel like factor 15，KLF15)、ChaC谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰转移酶1(ChaC glutathione specific γ-glutamylcyclotransferase 1，CHAC1)、抑制素亚基β E(inhibin subunit β E，INHBE)、生长停滞和DNA损伤诱导γ(growth arrest and DNA damage inducible γ，GADD45G)、核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1)、中胚层特异性转录本(mesoderm specific transcript，MEST)、转运RNA-yW合成蛋白1同源物B(transfer RNA-yW synthesizing protein 1 homolog B，TYW1B)、睾丸表达14细胞间桥形成因子(testis expressed 14，intercellular bridge forming factor；TEX14)，表达下调的前10个基因为肌球蛋白重链6(myosin heavy chain 6，MYH6)、富含脯氨酸的蛋白33(proline rich 33，PRR33)、角蛋白75(keratin 75，KRT75)、跨膜蛋白35A(transmembrane protein 35A，TMEM35A)、肽酶抑制因子3(peptidase inhibitor 3，PI3)、母系表达基因9(maternally expressed 9，MEG9)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)12、信号转导及转录激活因子5A(signal transducer and activator of transcription 5A，STAT5A)、细胞色素P450家族24亚家族A成员1(cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1，CYP24A1)、Kelch样家族成员4(Kelch-like family member 4，KLHL4)，见表 3。对DEG进行聚类分析，结果显示，ZIKV感染后的DEG可以划分成12个功能组别，其中主要功能组别与细胞过程、生物调节、细胞代谢过程及刺激应答有关，分别占总数的28.07%、21.93%、14.91%和11.40%(图 1B)。
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图 1 ZIKV感染组与对照组SH-SY5Y细胞的差异表达基因分析 Fig 1 Differentially expressed genes between control and ZIKV-infected SH-SY5Y cells A: Cluster map of the differentially expressed genes (highly expressed genes were indicated in red and lowly expressed genes were indicated in blue); B: Categories of biological process of the differentially expressed genes. SY-1, -2, and-3 were control cell samples and SY-4, -5, and -6 were ZIKV-infected cell samples. ZIKV: Zika virus. |
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表 3 ZIKV感染SH-SY5Y细胞后表达上调和下调的前10个基因 Tab 3 Top 10 up-and down-regulated genes in SH-SY5Y cells after ZIKV infection |
2.3 ZIKV感染细胞中DEG的GO功能注释及富集分析
ZIKV感染后出现的DEG共涉及2 730个GO条目，显著富集的GO条目有552个，其中涉及生物学过程的注释量最多，高达451个条目，主要集中在刺激应答、多细胞有机体过程、发育过程等方面，分别包括48、42和41个DEG；涉及分子功能的GO条目有66个，涉及细胞组分的GO条目有35个。GO功能富集分析显示，ZIKV感染后出现的DEG主要与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、细胞外包裹性结构、细胞外结构组织、细胞外间隙、抗微生物体液免疫反应等有关(图 2A)。
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图 2 DEG的GO功能富集分析 Fig 2 GO functional enrichment analysis of DEGs A: GO enrichment analysis of total DEGs; B: GO enrichment analysis of down-regulated genes; C: GO enrichment analysis of up-regulated genes. DEG: Differentially expressed gene; GO: Gene Ontology; CC: Cellular component; BP: Biological process; MF: Molecular function. |
对上调与下调的DEG分别进行GO富集分析，结果如图 2B、2C所示。下调DEG涉及的细胞组分主要与肌球蛋白复合物、肌球蛋白丝、应力纤维有关；分子功能涉及较广，主要与微丝运动活动、转移酶活性、酶结合、蛋白质结合、蛋白质活性有关；主要参与心脏发育、应激导致的心肌肥大、心肌适应、心脏收缩力调节等生物学过程。上调DEG涉及的细胞组分主要与细胞外结构有关，包括ECM、细胞外包裹性结构、细胞外间隙、含胶原蛋白的ECM等；分子功能主要与ECM结构成分及其赋予的抗压性、细胞因子活性、结构分子活性、蛋白质二聚体化活性有关；生物学过程主要与细胞对内源性刺激的反应、细胞外结构组织、核糖体DNA异染色质组装、巨噬细胞趋化性等有关。以上结果提示ZIKV感染神经细胞后，可能通过抑制宿主细胞骨架重排、增加细胞外具有免疫调节活性成分、重塑ECM结构来调节病毒感染活性。
2.4 ZIKV感染细胞中DEG的KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析发现DEG注释到具体的代谢途径共有122条。按P值从小到大排序，对DEG富集的途径及富集程度进行制图，结果如图 3所示。富集的代谢途径包括类风湿关节炎、酒精中毒、系统性红斑狼疮、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成、甲型流感、脂质和动脉粥样硬化、神经活性配体-受体相互作用、癌症通路、代谢途径、IL-17信号通路等。本实验数据中显著富集的通路主要与炎症反应和自身免疫相关，如与类风湿关节炎有关的DEG有Fos原癌基因AP-1转录因子亚基(Fos proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit；FOS)、MMP1、C-X-C基序趋化因子配体2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)、C-C基序趋化因子配体5(C-C motif chemokine ligand 5，CCL5)，与系统性红斑狼疮有关的DEG有H4簇状组蛋白11(H4 clustered histone 11，H4C11)、H3簇状组蛋白13(H3 clustered histone 13，H3C13)、H2A簇状组蛋白18(H2A clustered histone 18，H2AC18)、H4簇状组蛋白15(H4 clustered histone 15，H4C15)，参与IL-17信号通路的DEG有FOS、CXCL2、MMP1，与甲型流感病毒感染有关的DEG包括丝氨酸蛋白酶1(serine protease 1，PRSS1)、多聚腺苷酸结合蛋白核1样蛋白(PABPN1 like，cytoplasmic；PABPN1L)、丝氨酸蛋白酶2(serine protease 2，PRSS2)、CCL5(表 4)。
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图 3 差异表达基因的KEGG通路富集分析 Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; cGMP: Cyclic guanosine monophosphate; PKG: Protein kinase G; IL-17: Interleukin-17; TNF: Tumor necrosis factor. |
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表 4 KEGG显著富集信号通路及其差异表达基因 Tab 4 Significant enrichment of KEGG pathways and their corresponding differentially expressed genes |
2.5 DEG的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析
利用STRING分析部分DEG之间存在的潜在相互作用，结果显示，有32个DEG编码的蛋白质存在相互作用，包括24个上调基因和8个下调基因编码的蛋白质。根据K-means聚类将相互作用网络分为三部分，如图 4所示，其中红色部分主要与ECM和细胞外区域有关，包括FMOD、富含亮氨酸小蛋白(biglycan，BGN)、基质重塑相关蛋白5(matrix remodeling associated 5，MXRA5)、POSTN、Ⅺ型胶原蛋白α 1链(collagen type Ⅺ α 1 chain，COL11A1)、MMP1、MMP12、壳多糖酶3样蛋白1(chitinase 3 like 1，CHI3L1)、表面活性蛋白D(surfactant protein D，SFTPD)、PRSS2、PRSS1、HtrA丝氨酸肽酶4(HtrA serine peptidase 4，HTRA4)、CCL5、趋化素趋化因子样受体1(chemerin chemokine-like receptor 1，CMKLR1)共14个候选蛋白质；绿色部分主要与细胞对内源性刺激的反应及炎症反应有关，包括FOS、CXCL2、WAP四二硫键核心结构域12(WAP four-disulfide core domain 12，WFDC12)、PI3、STAT5A、CHAC1、GADD45G、INHBE、KLF15、多巴胺受体D1(dopamine receptor D1，DRD1)、H4C11、H4C15、H3C13、H2AC18共14个候选蛋白质；蓝色部分为肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7，MYH7)、利尿钠肽B(natriuretic peptide B，NPPB)、MYH6、受磷蛋白(phospholamban，PLN)共4个候选蛋白组成的相互作用网络，主要与组织发育、cGMP-PKG信号通路有关。
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图 4 差异表达基因的STRING蛋白质-蛋白质相互作用网络分析 Fig 4 STRING protein-protein interaction network analysis of differentially expressed genes |
2.6 ZIKV感染细胞中DEG的qPCR验证
选择6个上调基因(KLF15、CHAC1、INHBE、GADD45G、NR1D1、BGN)和5个下调基因[神经细胞黏附分子2(neural cell adhesion molecule 2，NCAM2)、黑色素瘤抗原家族成员D4B(melanoma antigen family member D4B，MAGED4B)、核小体组装蛋白1样蛋白5(nucleosome assembly protein 1 like 5，NAP1L5)、TMEM35A、STAT5A]进行qPCR检测，结果如图 5A所示。通过将qPCR结果与转录组测序结果进行比对，发现除了BGN，其他基因在两组实验结果中的变化趋势基本一致，表明本次测序结果可靠。
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图 5 qPCR对转录组测序结果的验证 Fig 5 qPCR validation for transcriptome sequencing results A: Comparison of qPCR and transcriptome sequencing results; B: qPCR results of DEGs in different cells. **P < 0.01 vs control. n＝3, x±s. qPCR: Quantitative polymerase chain reaction; FC: Fold change; KLF15: Kruppel like factor 15; CHAC1: ChaC glutathione specific γ-glutamylcyclotransferase 1; INHBE: Inhibin subunit β E; GADD45G: Growth arrest and DNA damage inducible γ; NR1D1: Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1; BGN: Biglycan; MAGED4B: Melanoma antigen family member D4B; NAP1L5: Nucleosome assembly protein 1 like 5; TMEM35A: Transmembrane protein 35A; STAT5A: Signal transducer and activator of transcription 5A; NCAM2: Neural cell adhesion molecule 2; HUVEC: Human umbilical vein endothelial cell. |
为确认DEG在ZIKV感染不同人源细胞样品中是否具有相同的变化趋势，挑选4个DEG(NR1D1、STAT5A、CHAC1、BGN，分别与炎症反应、信号转导、刺激应答和ECM相关)，检测它们在不同细胞感染ZIKV后的表达水平。结果(图 5B)显示，这4个基因在ZIKV感染不同细胞中呈现出不同的变化规律。例如，与对照组相比，STAT5A转录水平在ZIKV感染的SH-SY5Y细胞中下降了2.60倍，但在ZIKV感染的HUVEC、A549、Huh7细胞中其转录水平均升高，尤其是在A549细胞中，STAT5A转录水平在ZIKV感染后上升了23.35倍；NR1D1和CHAC1在ZIKV感染不同细胞后基因表达水平均升高；尽管BGN在转录组测序结果中显示上调了2.77倍，在qPCR检测的ZIKV感染的HUVEC、A549、Huh7细胞中其转录水平也分别升高了1.68倍、4.57倍和3.46倍，但qPCR检测的该基因转录水平在ZIKV感染的SH-SY5Y细胞中下降了2.11倍。
3 讨论大多数成年人感染ZIKV后无明显症状，20%~25%的患者出现自限性发热性疾病、关节痛、皮疹和结膜炎，并可能出现神经系统并发症，如吉兰-巴雷综合征、脊髓炎及脑膜脑炎[5]。先天性感染ZIKV可引起胎儿发育迟缓或新生儿小头畸形等[6]。目前关于ZIKV感染导致神经病变的分子机制尚不完全清楚。本研究选用SH-SY5Y细胞作为转录组分析对象，以期为研究ZIKV感染致神经病变机制提供候选基因。
本研究通过转录组测序技术分析发现，ZIKV感染神经细胞后有259个基因存在差异表达，包括172个上调基因和87个下调基因。通过GO富集分析得知，DEG主要与ECM、抗微生物免疫反应相关。ECM是存在于细胞间隙中的非细胞成分，它不仅能为细胞存活提供必要的物理支架，还与细胞再生、修复及免疫密切相关[7]。ECM中的蛋白质种类较多，包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖和重塑酶等，其中胶原蛋白是ECM的主要成分，约占总蛋白质的30%。分析本次转录组测序数据，与ECM相关的DEG包括COL11A1、BGN、CHI3L1、POSTN、FMOD、SFTPD、CXCL2、MMP12、PI3、PRSS1、PRSS2等，从蛋白质-蛋白质相互作用网络分析结果可看出这些基因编码的蛋白质之间存在明显的相互作用。
COL11A1基因编码的是一种纤维状胶原蛋白，是结缔组织尤其是角膜和巩膜组织重要的结构蛋白，该基因突变可以导致多种与眼球有关的疾病，如Stickler综合征Ⅱ型和Marshall综合征等[8]。FMOD基因编码的蛋白质是Ⅱ类富含亮氨酸的小蛋白多糖家族成员，它可以直接与ECM结构成分(如胶原蛋白和赖氨酰氧化酶)结合，通过多价相互作用调节胶原交联、堆积和组装[9]。POSTN基因编码的是一种分泌型ECM蛋白，该蛋白质在组织发育和再生中发挥作用[10]。研究发现COL11A1、FMOD、POSTN在多种肿瘤组织中异常表达，可作为肿瘤诊断和预后的标志物[11-12]。
CHI3L1基因编码的是一种分泌型糖蛋白，属于糖基水解酶18家族成员，参与调节炎症细胞凋亡、树突状细胞累积和M2巨噬细胞分化等多种过程，在组织重塑、细胞响应及环境变化应对中发挥作用[13]。尽管关于CHI3L1基因在大脑中的研究有限，但越来越多的证据表明，CHI3L1主要是由活跃的星形胶质细胞产生，并与神经炎症状态有关[14]。Lananna等[15]发现CHI3L1基因还参与调节神经炎症和阿尔茨海默病的发病机制。Jiang等[16]发现CHI3L1表达与神经脊髓炎患者的认知障碍相关，敲低星形胶质细胞中的CHI3L1表达可以挽救C57BL/6小鼠模型中海马神经发生减少和学习行为受损。ZIKV感染SH-SY5Y细胞后COLL11A1、CHI3L1、FMOD、POSTN转录水平升高，提示ZIKV感染可能通过重塑神经细胞胞外环境导致神经系统发生病变。
ECM是一种普遍存在的结构，也是具有潜在免疫调节活性分子的主要来源，这些分子包括细胞分泌并贮存在ECM中的细胞因子和生长因子，以及由基质蛋白酶分解产生的生物活性分子。本次转录组测序数据中，参与抗微生物体液免疫反应的DEG有PI3、WFDC12、SFTPD、CXCL2、PRSS2，这些基因均与ECM相关。例如，SFTPD基因编码的是一类含有胶原蛋白的亲水性钙依赖性(C型)凝集素，广泛表达于脑、肺、胰腺和脂肪组织[17]。SFTPD属于ECM中具有免疫调节活性的分子。有文献报道，表面活性蛋白A和SFTPD两种寡聚蛋白不仅参与肺先天免疫防御[18]，而且在抑制革兰氏阴性菌生长[19]、增强吞噬细胞对微生物摄取[20]、抑制寄生虫感染[21-22]等方面均发挥重要作用。另外，STFPD还可以与多种RNA病毒结合发挥抗病毒作用，包括甲型流感病毒[23]、呼吸道合胞病毒[24]、HIV[25]、严重急性呼吸综合征冠状病毒2[26]等。ZIKV感染SH-SY5Y细胞后STFPD转录水平升高，提示宿主细胞可能通过增加细胞外环境中具有免疫调节活性的蛋白质来发挥抗病毒效应。
DEG的KEGG通路富集分析筛选出的显著富集的信号通路主要与炎症、免疫反应相关，这些基因有CXCL2、CCL5、FOS、MMP1、H4C11、DRD1等。CXCL2和CCL5编码的蛋白质都是趋化因子超家族成员。趋化因子是一种能参与免疫调节和炎症过程的分泌蛋白，具有免疫调节、组织修复、调控肿瘤发生等作用[27]。Tsutsui等[28]发现CXCL2会加重自身免疫性脑脊髓炎实验小鼠的中枢神经系统炎症。另一项研究则表明CCL5可促进受损视神经及中枢和周围神经系统的轴突再生[29]。ZIKV感染SH-SY5Y细胞后CXCL2、CCL5转录水平均升高，提示ZIKV可通过促进趋化因子的表达来加重细胞炎症，也可能是宿主细胞为了修复神经损伤而上调上述趋化因子的表达。
Fos基因家族主要由4个成员即FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2组成，这些基因编码亮氨酸拉链蛋白，可以与JUN家族蛋白结合形成异二聚体转录因子复合物——激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)，AP-1在信号转导、细胞增殖和分化中具有重要作用[30]。有研究报道HIV感染人体后可调控AP-1活性，从而损害机体免疫功能，增加患者患肿瘤和机会性感染(如Burkitt淋巴瘤、隐球菌感染)的风险。HIV的Tat蛋白通过与AP-1相互作用激活致癌因子的表达，从而加重肿瘤疾病进程[31]。另有研究通过对多发性硬化症(一种中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病)和ZIKV感染转录本进行分析，发现AP-1组成成员JUN和FOS在两组中均上调，提出ZIKV感染可能通过激活AP-1调节机制，导致个体出现多发性硬化症样表型[32]。ZIKV感染是否通过调节FOS基因的表达影响神经细胞炎症有待进一步研究。
qPCR验证实验结果显示MAGED4B、TMEM35A、STAT5A、NAP1L5、NCAM2、BGN的转录水平在ZIKV感染SH-SY5Y细胞后下降，而KLF15、CHAC1、INHBE、GADD45G、NR1D1在ZIKV感染后上调。除了BGN，其他基因的qPCR验证结果均与转录组测序结果一致。其中ZIKV感染SH-SY5Y细胞后，NCAM2基因转录水平下降最显著，该基因主要在大脑组织中表达。NCAM2在神经系统发育中具有重要作用，它不仅参与调控神经元形态和轴突结构，还影响神经元分化、突触形成和记忆形成[33-34]。已有研究报道NCAM2缺失与多种神经系统疾病有关，包括唐氏综合征、自闭症谱系障碍和阿尔茨海默病[35-36]。这提示ZIKV感染可能通过下调NCAM2的表达而影响神经系统发育。
BGN编码的蛋白质是富含亮氨酸的小蛋白聚糖家族成员，该蛋白质在胶原纤维组装和细胞信号传递过程中有重要作用。BGN表达异常与多种疾病相关，如代谢紊乱、炎症性疾病、肌肉骨骼发育异常和恶性肿瘤[37]。有研究发现，BGN还与多种神经退行性事件和疾病有关，如阿尔茨海默病病理过程中的淀粉样蛋白代谢[38]、感觉神经元轴突生长的抑制[39]和新皮质神经元存活[40]等。通过对野生型和BGN基因敲除型小鼠的下丘脑、海马组织进行转录组测序分析，发现BGN在代谢、免疫应答和神经元可塑性方面具有调节作用[41]。另外，BGN在妊娠和病理性妊娠过程中变化显著。从妊娠女性子宫颈获得的成纤维细胞中的BGN水平较非妊娠女性来源细胞减少了50%[42]。在胎儿生长受限病例的胎盘中BGN蛋白水平降低，而低BGN表达可能会导致胎盘血栓形成，是特发性胎儿生长受限的发病机制之一[43]。虽然本实验中对BGN的qPCR验证结果与转录组测序结果不一致，但由于qPCR实验重复3次并显示BGN在ZIKV感染后转录水平下调，与上述研究结果相符，说明ZIKV感染可能通过减少基质蛋白BGN的表达引起神经病变及在孕妇中引起胎儿发育不良。
进一步对DEG(NR1D1、STAT5A、CHAC1、BGN)在不同细胞感染ZIKV后的转录水平进行qPCR检测，发现其变化规律有所不同，提示ZIKV感染不同细胞引起的基因表达变化存在差异，这可能与细胞类型及这些基因在不同细胞代谢活动中行使的功能不同有关，对其进行全面且个性化的研究将有利于阐明ZIKV的致病机制。与BGN相似，STAT5A转录水平在ZIKV感染的SH-SY5Y细胞中下调，而在其他3种细胞中则上升。信号转导及转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)通过与特定的细胞因子受体结合参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节等，在细胞信号转导中起着重要作用[44]。研究发现，尼帕病毒(Nipah virus)的V蛋白可以与STAT5相互作用，抑制STAT5功能，进而逃避宿主细胞的免疫反应[45]。这提示ZIKV可能通过抑制SH-SY5Y细胞内STAT5信号通路来逃避宿主免疫防御。
本研究还观察到CHAC1、NR1D1基因在ZIKV感染的4种细胞模型中转录水平均上调，表明两者可能是ZIKV感染宿主细胞的普遍响应靶点。CHAC1是γ-谷氨酰转移酶蛋白家族成员，具有γ-谷氨酰转移酶活性，特异作用于细胞内主要的抗氧化剂谷胱甘肽[46]。CHAC1过表达会耗尽谷胱甘肽。同时，CHAC1还是内质网应激蛋白，参与细胞应激信号转导与氧化反应，在氧化应激和细胞凋亡中起着重要作用[47]。此外，CHAC1也是参与胚胎神经发生的Notch信号通路的负调节因子，通过抑制弗林蛋白酶切割Notch并将Notch维持在不成熟的非活性状态，最终促进胚胎的神经发生[48]。ZIKV感染后CHAC1表达上调，说明ZIKV可能通过上调CHAC1介导细胞凋亡或经Notch信号通路的抑制促进神经细胞分化。
NR1D1基因编码的蛋白质是一种转录因子，为核受体亚家族1中D组成员，可调控多种基因(包括昼夜节律、炎症和代谢相关基因)的表达[49]。研究发现使用NR1D1激动剂GSK411增强NR1D1活性可以抑制由脂多糖介导的神经小胶质细胞过度激活，保护神经元免受脂多糖介导的损伤[50]；激活NR1D1可抑制Toll样受体4介导的NF-κB活化，最终减弱脂多糖诱导的人子宫内膜间质细胞炎症反应[51]；NR1D1的药理激活可抑制脂多糖诱导的巨噬细胞M1极化，有助于预防流产[52]。另外，有研究报道NR1D1拮抗剂SR8278具有作为癫痫、帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病治疗剂的巨大潜力，其特异性药理作用似乎与神经元末梢释放的神经递质有关[53]。这提示ZIKV可能通过上调NR1D1表达来促进神经细胞病变，或者宿主细胞在感染ZIKV后通过上调NR1D1来减轻细胞炎症反应。
综上所述，通过转录组测序分析，ZIKV感染SH-SY5Y细胞后有259个基因发生差异性表达，这些DEG主要与ECM、刺激应答、炎症反应、免疫反应相关。qPCR验证结果表明ZIKV感染后SH-SY5Y细胞中的NCAM2、BGN基因表达下调，CHAC1、NR1D1基因表达上调。这4种基因均已被证明与神经系统疾病密切相关，提示ZIKV感染SH-SY5Y细胞后通过重塑ECM及上调CHAC1、NR1D1转录水平导致神经细胞受损。本研究丰富了ZIKV感染的转录组学信息，并且为ZIKV致病机制研究提供了线索。
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