经内镜逆行胰胆管造影术（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）是当前诊治胆胰疾病的一种主流的高级内镜技术，具有疗效确切、创伤小、恢复快、费用低等优势。作为侵入性治疗手段，ERCP不可避免地伴随一定风险，可能导致不良事件的发生，其中最常见的就是ERCP术后胰腺炎（post-ERCP pancreatitis，PEP）。尽管ERCP使用了直肠吲哚美辛栓、预防性置入胰管支架或乳酸林格液积极水化等各种预防措施，但PEP的预防仍然是临床较为棘手的问题，其在一般风险人群中的发生率为3.5%~9.7%，在高危人群中则高达14.7%^[1]。因此，亟需新的方法进一步优化PEP的预防。

钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）是一种分布广泛、功能多样的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，近年研究发现其在PEP的发病机制中发挥了重要的中介作用，其上游信号来自胰腺腺泡细胞的Ca²⁺，下游效应器为活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）^[2-3]。在动物模型中进行的临床前胰腺炎研究证实，使用CaN高度特异性抑制剂他克莫司（FK506）或环孢素A阻断该信号通路可为PEP的预防提供新思路，有少量临床研究也探索了CaN抑制剂他克莫司预防PEP的作用^[2]。本文就近年CaN及其抑制剂与PEP预防相关的基础和临床研究进展作一综述，以期为后续研究提供更多思路。

1 CaN参与胰腺炎发病的机制

胰腺炎的发病机制较为复杂，其中胰腺内胰蛋白酶原的过早活化和NF-κB的激活是2个主要的早期独立细胞事件，可导致腺泡细胞损伤并引发炎症反应，产生的细胞因子如IL-6还可介导胰腺炎相关的肺损伤^[3]。但近年来的研究进展对长期以来以胰蛋白酶为中心的胰腺炎发病机制的理解提出了挑战，越来越多的证据表明，腺泡细胞内强烈的炎症信号激活在胰腺炎的发病过程中起着至关重要的作用，或可解释胰腺炎伴发的强烈的全身炎症反应^[3]。

更详尽地了解调控腺泡细胞功能的信号转导机制将有助于加深对胰腺正常功能及其在胰腺炎、胰腺癌等疾病状态下发生变化的认识。腺泡细胞内Ca²⁺超载在胰腺炎的发生、发展过程中发挥着中心作用，这其中就涉及到介导病理性升高的细胞内Ca²⁺下游效应的CaN-NFAT信号转导通路^[3-4]。

1.1 介导酶原激活

CaN是腺泡细胞内Ca²⁺异常升高的一个重要靶标，这种异常升高与病理性蛋白酶的激活及胰腺炎的发生密切相关。Husain等^[5]早期使用超生理剂量的雨蛙素（100 nmol/L）联合CaN抑制剂他克莫司或CaN抑制肽（calcineurin inhibitory peptide，CiP）刺激分离的小鼠胰腺腺泡细胞，发现细胞中糜蛋白酶活性降低了50%，提示CaN可介导雨蛙素诱导的腺泡细胞内酶原的激活，但并未明显影响淀粉酶的分泌和初始细胞质内升高的Ca²⁺信号。后续的研究证实，他克莫司可显著降低胰蛋白酶活性超过50%，治疗后8 h血清淀粉酶和IL-6水平较基线分别降低86%和84%，减轻了胰腺水肿、腺泡细胞空泡变性、炎症和细胞凋亡等胰腺炎早期阶段的组织学损伤，同时胰腺和肺的髓过氧化物酶活性也较基线水平分别降低93%和83%^[6]。

此外，Ca²⁺和CaN依赖性转录因子NFAT可调节急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）小鼠胰蛋白酶原活化、炎症和胰腺组织损伤。牛磺胆酸胰管逆行注射诱导的AP模型小鼠实验证实，注射牛磺胆酸可增强胰腺、主动脉、肺和脾的NFAT转录活性，抑制NFAT将阻断上述器官中牛磺胆酸诱导的NFAT的激活，降低淀粉酶、髓过氧化物酶和巨噬细胞炎性蛋白2的水平，抑制胰蛋白酶原激活，减轻腺泡细胞坏死、水肿、白细胞浸润及胰腺出血。NFAT胞质蛋白3（nuclear factor of activated T cell cytoplasmic 3，NFATc3）基因缺陷小鼠则能免受牛磺胆酸的这些影响。腺泡细胞表达NFATc3，刺激激活NFATc3的表达可增加细胞内Ca²⁺水平，但能被CaN阻断剂所抑制^[7]。3种不同的CaN抑制剂如他克莫司、CiP和环孢素A均可显著阻断腺泡细胞内酶原和NF-κB的激活，其中CaN亚型催化A亚基的β-异构体（calcineurin β-isoform of the catalytic A subunit，CnAβ）在小鼠腺泡细胞中强烈表达。研究观察到CnAβ基因缺陷小鼠腺泡细胞内胰蛋白酶和糜蛋白酶活性分别降低84%和50%，减轻了胰腺炎的严重程度，还对雨蛙素及胆汁酸暴露诱导的酶原激活和细胞损伤具有保护作用，但并未影响到淀粉酶的分泌^[8-9]。

1.2 调控炎症

Liu等^[10]报道在牛磺胆酸诱导急性坏死性胰腺炎小鼠模型前及诱导后即刻给予他克莫司可显著降低22 h的死亡率，但诱导后1 h给药则不能降低死亡率。他克莫司、生长抑素和糖皮质激素均可显著降低血清淀粉酶、肺水肿及血清TNF-α、IL-1β水平，改善胰腺和肺的形态学改变。这表明他克莫司可以减轻急性坏死性胰腺炎小鼠的胰腺和肺损伤，效果与生长抑素和糖皮质激素相当，早期给药效果更佳。

使用造影剂碘海醇孵育小鼠和人源腺泡细胞可引起Ca²⁺信号达到峰值并趋于平稳，并伴随转录因子NF-κB和NFAT的激活；使用选择性钙离子螯合剂、环孢素A或他克莫司可避免NF-κB的活化及腺泡细胞损伤，CnAβ缺陷小鼠可免受碘海醇诱导的胰腺炎症。这提示碘海醇通过激活NF-κB、Ca²⁺信号和CaN引起小鼠胰腺炎症，CaN抑制剂理论上可用于预防PEP^[11]。

造影剂胰管内注射是临床已知的一个PEP危险因素，这种操作引起的瞬时胰管内高压可经由CaN信号通路促进胰腺炎症、改变细胞间紧密连接的完整性；此外，胰管内高压还可能因梗阻而导致AP和PEP的发生与发展，成为其重要的病理生理环节^[12]。研究发现，胰管内静水压达到100 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）或150 mmHg维持10 min就可诱导胰腺炎的发生，胰腺组织可表现为炎症标志物如IL-6、IL-1B和TNF水平的升高、信号转导及转录激活因子3的活化、血清淀粉酶的增加，以及细胞间紧密连接完整性的丧失^[12]。胰管内瞬时的高压使Ca²⁺处理失调（降低了Ca²⁺振荡、增加了峰值平台Ca²⁺信号），降低了线粒体膜电位，并促进了胰腺内CaN的活化。CnAβ基因敲除小鼠以及给予他克莫司处理的小鼠均未发展为压力诱导的胰腺炎症、水肿或细胞间紧密连接完整性的丧失^[12]。

胰管内压力是维持胰腺正常生理功能的重要参数，受到胰液分泌速率、胰管通畅性和胰液性状的影响^[13]。胰腺疾病状态可引发正常胰液流体力学的改变，如结石或狭窄造成的胰管梗阻性高压是慢性胰腺炎患者疼痛的一个主要特征，而造影剂胰管内注射引发的瞬时高压以及壶腹乳头水肿等引起的胰液流出受阻则是PEP发生的重要病因。关于胰管内压力的研究目前尚缺乏标准化、安全、客观的测量技术，直接的测量方法还有引发PEP的风险，因此仍需要研发新的非侵入性胰管内压力测量方法，以便进一步阐明胰管内压力在胰腺炎等疾病中的病理生理作用。

1.3 调节细胞自噬

胰腺腺泡细胞内的异常Ca²⁺信号是AP的一个早期和关键的特征。钙库操纵性钙离子通道（store-operated calcium entry，SOCE）是腺泡细胞主要的Ca²⁺内流通道，促成了病理状态下腺泡细胞内Ca²⁺超载，是AP发生、发展过程中的一个关键致病步骤，可导致胰蛋白酶激活、炎症和空泡形成。Zhu等^[14]发现，雨蛙素可通过诱导位于内质网膜的钙离子感受器基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和位于细胞膜的钙释放激活钙通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel protein 1，由ORAI1基因编码）的相互作用而触发SOCE，激活CaN及其介导的NFAT和转录因子EB，进而分别促进多种趋化因子基因和自噬相关基因的转录激活。这可能对AP发生、发展中的细胞自噬和空泡形成具有明显的长期作用，并为AP治疗提供了潜在的靶点。

1.4 参与氧化应激

Norberg等^[15]通过雨蛙素造模小鼠筛选AP的潜在早期标志物，如钙调磷酸酶调节蛋白1（regulator of calcineurin 1，Rcan1）和抗氧化基因sestrin 2（Sesn2）等，并证实它们是经由氧化应激、过氧化氢刺激和使用抗氧化剂抑制雨蛙素刺激的表达等诱导的。该研究同时发现Rcan1蛋白在AP小鼠血浆及AP患者血浆中都显著升高。Rcan1受氧化应激的调节，或可作为AP的潜在诊断标志物。

1.5 其他

CaN-NFATc3信号通路还参与了Ca²⁺超载介导的肠上皮细胞凋亡，导致肠黏膜屏障功能障碍，进而促进重症AP的发生、发展^[16]。

2 临床前有效性和安全性评估

腺泡细胞内的CaN信号通路是PEP的一个关键启动事件，靶向抑制其激活可能是预防PEP的一种新策略。Orabi等^[17]使用了2种互补的基因学方法特异性在体敲除小鼠腺泡细胞CaN，并构建了2种不同严重程度的PEP模型：一种轻度模型是向胆胰管内注射低容量生理盐水，另一种重度模型在同轻度模型相同的时间范围内以双倍速率注射双倍容量的造影剂模拟PEP。研究表明腺泡细胞CaN缺失可在很大程度上预防PEP和AP，即使是部分缺失也对PEP具有明显的保护作用。另一方面，胰管内与造影剂一同注射的CaN抑制剂，靶向在体小鼠腺泡细胞的CaN，同样可以降低PEP的发生风险。与既往认为的长期和全身使用CaN抑制剂易导致胰腺炎和胰腺纤维化不同的是，短期和靶向胰腺注射CaN抑制剂反而可以预防胰腺炎^[17]。

CaN的细胞来源对其介导的胰腺炎保护作用具有重要影响。敲除造血细胞特异性蛋白磷酸酶3调节亚基B的α亚型（protein phosphatase 3, regulatory subunit B, alpha isoform；PPP3R1，又称CNB1）的小鼠与对照组小鼠出现相同程度的局部胰腺炎症，而敲除胰腺特异性CNB1的小鼠胰腺炎和胰腺炎症较对照组小鼠减轻^[18]。敲除造血细胞特异性CNB1的小鼠肺组织中性粒细胞浸润减少，与CaN抑制剂孵育后，中性粒细胞趋化性和活性氧的产生降低。造血细胞和中性粒细胞中CaN的表达可促进胰腺炎相关的肺部炎症，而胰腺表达的CaN可促进局部胰腺炎症，因此需要同时抑制胰腺和造血细胞的CaN信号以获得最大限度的胰腺保护作用^[18]。

该研究小组在随后的临床前研究中，使用插管后注射生理盐水模拟压力诱导的PEP或注射雨蛙素诱导的胰腺炎模型检验了直肠给予他克莫司靶向全身性和胰腺特异性CaN信号以预防小鼠胰腺炎的有效性^[19]。直肠他克莫司栓剂（1 mg/kg）于插管前或首次注射雨蛙素前10 min给药。研究证实直肠给予他克莫司可显著降低血浆淀粉酶（胰腺损伤标志物）和IL-6（胰腺炎症标志物）水平，还可减低胰腺组织病理学评分（基于组织水肿、坏死和炎症）。但实验组IL-6水平和胰腺组织病理学评分仍高于胰管未经任何干预或未经他克莫司治疗的阴性对照组，提示所给予的他克莫司剂量并未完全消除胰腺损伤和炎症。此外，较之经静脉（0.15 h）或经胃（0.21 h）途径给药，经直肠给药可获得更长的全身他克莫司浓度平均达峰时间（1.63 h），可提供最佳的药物暴露以获得有助于PEP预防的他克莫司治疗性血药浓度^[19]。

一项临床前的安全性评估研究显示，插管后胰管内注射单次剂量的造影剂联合他克莫司或环孢素A后，未观察到实验小鼠的糖代谢、肝功能和肾功能异常，该造影剂和CaN抑制剂的联合制剂安全、耐受性良好，没有明显的急性或亚急性内分泌或全身毒性作用，从而强化了其用于PEP预防的临床效用^[20]。

3 CaN抑制剂与临床PEP

基于上述基础研究理论和临床前有效性和安全性评估，目前有少部分中心开展了关于CaN抑制剂预防PEP的临床研究。Thiruvengadam等^[21]率先在肝移植患者中进行了一项回顾性研究，纳入了337例肝移植术后因胆管并发症行ERCP的患者，其中323例患者在ERCP前维持着稳定的他克莫司剂量。该研究报道PEP的发生率为2.2%，他克莫司谷浓度高于2.5 ng/mL与PEP发生概率降低79%显著相关（P＝0.01），而直肠吲哚美辛栓与PEP风险降低91%显著相关（P＝0.03）。对于他克莫司谷浓度高于2.5 ng/mL的患者，与未使用吲哚美辛相比，联合使用直肠吲哚美辛栓可使PEP发生概率降低93%（P＝0.04），提示他克莫司谷浓度高于2.5 ng/mL可显著降低PEP风险，与直肠吲哚美辛栓联用可强化预防效果。

一项来自韩国的倾向性匹配队列研究报道，肝移植术后患者的血清淀粉酶和脂肪酶值均显著降低（P＜0.001），达到与慢性胰腺炎患者相当的水平。在倾向评分匹配前后，均可观察到非肝移植患者和肝移植患者PEP发生率差异接近有统计学意义（3.2% vs 0.9%，P＝0.069；4.8% vs 0.7%，P＝0.067）^[22]。研究认为肝移植后CaN抑制剂的免疫抑制作用不仅能降低胰酶动力学，还能降低包括PEP在内的炎症事件风险。

另一项来自印度的前瞻性初步研究纳入了48例ERCP患者，ERCP前一天晚8时与当日早8时分别给予2 mg他克莫司口服，2 h后行ERCP并测定他克莫司浓度，还选取了51例同期进行ERCP的患者作为对照^[23]。该研究报道他克莫司组PEP的发生率为8.3%，对照组为15.7%。发生PEP的患者他克莫司平均谷浓度低于未发生PEP者（P＜0.05）。该研究初步证实口服4 mg累积剂量的他克莫司可安全预防PEP。当前一项正在进行中的多中心、国际性、随机、双盲、对照试验旨在评估直肠吲哚美辛栓、口服5 mg他克莫司或两者联合预防PEP的效用^[24]，期待能给PEP的预防提供新的高质量证据。

4 结语

现有研究证据表明CaN特异性抑制剂为临床预防PEP提供了新的很有希望的方向，但在临床推广使用前仍需要更多高质量研究进一步阐明CaN在人体胰腺炎发病机制中扮演的角色、CaN特异性抑制剂的优选、他克莫司剂型制备与剂量的优化，以及CaN抑制剂与吲哚美辛等其他PEP预防措施的联合使用等临床关注和迫切需要解决的问题。