2024, Vol. 45
2. 中国人民解放军联勤保障部队北戴河康复疗养中心肾脏病科, 秦皇岛 066000;
3. 海军军医大学(第二军医大学)第一附属医院病理科, 上海 200433
2. Department of Nephrology, Beidaihe Rest and Recuperation Center, Joint Logistics Support Force of PLA, Qinhuangdao 066000, Hebei, China;
3. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一种最常见的单基因遗传性肾脏疾病，其发病率为1/2 500~1/1 000[1-2]。ADPKD多成年起病，主要病理改变表现为双侧肾脏皮、髓质广泛囊肿形成并进行性增大、增多，压迫正常的肾脏组织，导致肾功能逐渐受损。ADPKD患者肾小球滤过率随着年龄增长而逐渐下降，常在60岁以后进入终末期肾病阶段[3]。迄今为止只有托伐普坦被临床试验证实能部分延缓ADPKD患者的肾功能减退[4-5]，但仍存在用药剂量大、不良反应多等问题，因此亟待研发延缓ADPKD进展的药物。
钠-葡萄糖共转运体（sodium-glucose cotransporter，SGLT）是一类钠-溶质同向转运体家族，共有6个亚型，以SGLT1和SGLT2与肾脏的关系最为密切[6]。SGLT1主要分布于近端小管S3段，具有高亲和力、低转运的特点，在生理情况下重吸收近端小管内剩余的葡萄糖[7]。在乳腺癌中，SGLT1通过缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）通路将细胞代谢模式由脂肪酸β氧化转变为糖酵解，促进间质纤维化和巨噬细胞M2浸润、极化[8]。极化的巨噬细胞又能通过表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/PI3K/Akt通路引起SGLT表达增加、细胞增殖，形成恶性循环[8-9]。在胃癌细胞中，SGLT1能改变细胞代谢状态、促进细胞增殖，抑制或敲除SGLT1能抑制上述作用[10]。ADPKD被认为是一种类肿瘤的疾病，与肿瘤具有相似的病理生理特点，如细胞快速增殖、纤维化增加、炎症细胞浸润和代谢改变等。有研究证实非选择性SGLT抑制剂根皮苷能降低Han: SPRD大鼠的双肾重/体重比、肾囊肿指数、尿蛋白，抑制细胞增殖，增加肌酐清除率[11]。而选择性SGLT2抑制剂达格列净仅降低大鼠的尿蛋白、增加肌酐清除率，其细胞增殖活性和肾囊肿指数与对照组相比没有明显改变[12]。因此我们猜想，非选择性SGLT抑制剂是通过抑制SGLT1的功能抑制囊肿衬里上皮细胞增殖和多囊肾进展。本研究利用特异性SGLT1抑制剂米扎格列净（mizagliflozin，MIZA）探究SGLT1在ADPKD中对细胞增殖和纤维化的作用及其分子机制，为寻找新的药物靶点提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 细胞与主要试剂人正常肾小管上皮细胞UCL93和人多囊肾囊肿衬里上皮细胞OX161由英国Sheffield大学Albert CM Ong教授赠送，犬肾细胞MDCK由瑞士苏黎世大学医院的Rudolf P Wüthrich教授赠送。胶原蛋白（collagen，Col）Ⅰ、基质胶购自美国Corning公司；DMEM/F12培养基、HEPES缓冲液购自上海源培生物科技股份有限公司；青霉素-链霉素溶液购自北京兰杰柯科技有限公司；MIZA购自美国MedChemExpress公司；PVDF膜（45 μm）、他莫昔芬购自美国Merk公司；DNA酶Ⅰ、TRIzol试剂盒、DNA marker、qPCR试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；快速基因型鉴定试剂盒购自上海冠泰生物科技有限公司；ITS Media Supplement、Edu-594细胞增殖检测试剂盒、胰酶细胞消化液购自上海碧云天生物技术有限公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%）、超灵敏化学发光检测试剂盒、蛋白酶抑制剂、快速封闭液、TBST、蛋白裂解液、上样缓冲液购自上海雅酶生物医药科技有限公司；兔抗SGLT1抗体购自英国Abcam公司；荧光二抗购自美国VectorLabs公司；4%多聚甲醛固定液购于武汉塞维尔生物科技有限公司。
1.2 人正常肾脏和多囊肾组织人正常肾脏组织来源于海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院3例行肾癌切除术患者的癌旁肾组织，所有组织均经病理切片证实无癌细胞。患者的多囊肾组织来源于海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院5例行肾切除手术的ADPKD患者。本实验通过海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院伦理委员会审批。
1.3 瞬时受体电位通道相互作用多囊蛋白1（polycystin 1，transient receptor potential channel interacting；PKD1）条件敲除小鼠的鉴定和诱导正常C57小鼠[野生型（PKD1+/+小鼠）]和PKD1flox/flox-Cre+小鼠（PKD1－/－小鼠）各5只，由瑞士苏黎世大学Rudolf P Wüthrich教授赠送，在海军军医大学（第二军医大学）SPF级动物房培育。出生第8天时用消毒后的眼科剪剪取鼠尾，用快速基因型鉴定试剂盒鉴定出Cre+的小鼠。出生第10天时腹腔注射他莫昔芬（10 mg/kg）诱导PKD1基因敲除。出生第31天时用颈椎脱臼法处死PKD1－/－小鼠和PKD1+/+小鼠，生理盐水灌注后取双侧肾脏，取半个肾脏用4%多聚甲醛溶液固定，剩余组织放入液氮或－80 ℃冰箱保存。
1.4 蛋白质印迹法检测SGLT1蛋白的表达收集PKD1－/－小鼠和PKD1+/+小鼠肾脏组织、人正常肾脏组织、ADPKD患者肾脏组织。将收集的肾脏组织加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂低温研磨，研磨充分后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min（离心半径为5.8 cm），取上清，加入上样缓冲液。按照PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书配胶后上样，开始电泳。电泳结束后采用湿转法将蛋白条带转印到PVDF膜上，用快速封闭液封闭30 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗室温孵育40 min，TBST清洗3次，每次10 min，洗膜完成后显影。用ImageJ软件计算条带灰度值。
1.5 qPCR检测关键基因的表达按照TRIzol试剂盒说明书提取UCL93细胞、OX161细胞、MIZA（100 μmol/L）培养48 h的OX161细胞以及人和小鼠肾脏组织的总RNA。用紫外分光光度计测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，按照qPCR试剂盒说明书进行PCR扩增。引物序列见表 1，所有引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、58 ℃ 1 min，35个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s。采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
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表 1 引物序列（5'-3'） Tab 1 Primer sequences (5'-3') |
1.6 免疫荧光染色
待鉴定的组织和细胞用4%多聚甲醛溶液室温过夜固定；用75%、80%、95%、100%梯度乙醇脱水，每阶段30 min；二甲苯透明化10 min；浸58 ℃蜡液3次，每次30 min；将细胞转移至金属模具中，加入适量蜡液，凝固后形成蜡块。蜡块以2 μm厚度连续切片，将切片置于40 ℃烘片机上过夜烘干；将切片脱蜡复水，用酸性修复液修复抗原，高压灭菌锅设置为121 ℃、2 min开始修复，修复结束后自然冷却至室温；用免疫疏水笔圈出载玻片上细胞的部位，用BSA封闭液室温孵育30 min；加入一抗工作液，4 ℃过夜孵育；用PBS清洗3次，每次5 min；加入荧光二抗工作液，37 ℃孵育40 min；用PBS清洗3次，每次5 min；用DAPI复染细胞核。封片后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
1.7 MTT实验将UCL93、OX161细胞按4 000个/孔的密度接种于96孔板，12 h后换成含0、3.1、6.2、12.5、25、50、100、200 μmol/L MIZA的培养基，在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24、48和72 h后去除培养基，加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL）后置于细胞培养箱中孵育4 h，轻轻吸除MTT溶液，迅速加入200 μL DMSO溶解甲基紫晶体，轻轻振荡至晶体完全溶解，用酶标仪检测490 nm波长处的光密度（D）值。
1.8 集落形成实验将对数生长期的单层细胞常规消化离心，收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀，以400、500个/孔的密度接种于12孔板，置于培养箱中培养，待贴壁后加入含0、25、50、75、100 μmol/L MIZA的细胞培养液，继续培养1~2周。当培养皿中出现肉眼可见的集落时，停止培养，弃培养液，用PBS小心洗涤2~3次，弃PBS。每孔加入4%多聚甲醛溶液1 mL，固定15 min，弃固定液；每孔加入1 mL 0.1%结晶紫染色液15 min，流水缓缓洗去染液，空气干燥，拍照并计算集落形成率和集落形成面积。
1.9 MDCK细胞囊肿形成模型将MDCK细胞消化后，按4×104个/mL的密度接种于3D培养基（每2 mL含DMEM/F12 300 μL、HEPES 20 μL、60 mg/mL的NaHCO3 80 μL、Col Ⅰ 1.7 mL），将配制好的3D培养基接种于48孔板，放入培养箱静置30 min，待3D培养基凝固后加入400 μL含0、25、50、100、200 μmol/L MIZA的细胞培养液，继续培养1周。
1.10 mRNA-seq数据分析使用TRIzol试剂提取UCL93细胞、OX161细胞和MIZA（100 μmol/L）培养48 h的OX161细胞的总RNA，检测合格后用磁珠富集mRNA，反转录得到cDNA，纯化、修复后进行PCR富集得到cDNA文库。对cDNA文库进行质量检测后用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序。使用R 4.2.1软件进行数据分析，将差异倍数≥2且错误发现率＜0.01作为筛选标准得到差异表达基因，使用R 4.2.1软件中的clusterProfiler包对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。采用Fisher确切概率法进行统计学分析，选择标准为特定通路中差异表达基因数量≥2个且P＜0.05。
1.11 统计学处理应用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计分析。所有数据均符合正态分布，以x±s表示，两组间的比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 SGLT1在ADPKD患者和PKD1－/－小鼠的肾脏组织中表达升高蛋白质印迹法分析结果显示，与人正常肾脏组织比较，ADPKD患者的肾脏组织中SGLT1蛋白表达水平升高（1.23±0.37 vs 0.51±0.15，P＜0.05；图 1A）；与PKD1+/+小鼠比较，PKD1－/－小鼠肾脏组织中SGLT1的表达水平也升高（0.77±0.11 vs 0.25±0.09，P＜0.01；图 1B）。qPCR检测结果显示，ADPKD患者和PKD1－/－小鼠肾脏组织中SGLT1 mRNA的表达量分别高于人正常肾脏组织和PKD1+/+小鼠肾脏组织（2.05±0.50 vs 1.00±0.28，P＜0.01；2.86±1.25 vs 1.00±0.21，P＜0.01）。
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图 1 蛋白质印迹法检测SGLT1蛋白在肾脏组织中的表达 Fig 1 Expression of SGLT1 protein in kidney tissue detected by Western blotting A: SGLT1 protein expression in human normal renal tissues (N1-N3) and renal tissues of ADPKD patients (A1-A5); B: SGLT1 protein expression in the kidney tissues of PKD1+/+ mice (N1-N3) and PKD1－/－ mice (A1-A3). SGLT1: Sodium-glucose cotransporter 1; ADPKD: Autosomal dominant polycystic kidney disease; PKD1: Polycystin 1, transient receptor potential channel interacting; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. |
2.2 SGLT1表达分布在囊肿衬里上皮细胞
ADPKD患者肾脏和人正常肾脏免疫荧光染色结果（图 2A~2D）显示，SGLT1在人正常肾脏表达于近端小管的管腔面细胞膜上，在ADPKD患者肾脏组织中主要分布在囊肿衬里上皮细胞。对PKD1+/+和PKD1－/－小鼠肾脏组织进行SGLT1和莲藕凝集素（lotus tetragonolobus lectin，LTL）的免疫荧光共染（图 2E、2F），发现在PKD1+/+小鼠肾脏组织中SGLT1表达于肾脏皮质近端小管细胞膜上，而在PKD1－/－小鼠多囊肾组织中SGLT1高表达于囊肿衬里上皮细胞膜上，皮质和髓质均有分布，与LTL部分共染，提示SGLT1在多囊肾组织中主要表达于囊肿衬里上皮细胞，且与囊肿衬里上皮细胞是否为近端小管来源无关。
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图 2 免疫荧光染色检测SGLT1在肾脏组织中的分布 Fig 2 Distribution of SGLT1 in kidney tissue detected by immunofluorescence staining A, B: Kidney tissues of ADPKD patients; C, D: Human normal renal tissues; E: Kidney tissues of PKD1+/+ mice; F: Kidney tissues of PKD1－/－ mice. "△" indicates renal medullary region. SGLT1: Sodium-glucose cotransporter 1 (red fluorescence); DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole (blue fluorescence); LTL: Lotus tetragonolobus lectin (green fluorescence); ADPKD: Autosomal dominant polycystic kidney disease; PKD1: Polycystin 1, transient receptor potential channel interacting. |
2.3 MIZA抑制多囊肾细胞的生长
MTT实验结果（图 3）显示，UCL93和OX161细胞的增殖抑制率随MIZA浓度、培养时间的增加而升高，且抑制率在培养48 h时增加最明显。集落形成实验结果（表 2）显示，随着MIZA浓度的升高，UCL93、OX161细胞的集落形成率、集落形成面积呈减少趋势。MTT实验和集落形成实验均显示MIZA对OX161细胞的增殖抑制作用相较于UCL93细胞更高。
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图 3 MTT实验检测MIZA对OX161和UCL93细胞增殖的影响 Fig 3 Effect of MIZA on proliferation of OX161 and UCL93 cells detected by MTT assay A-C: Inhibition rate of MIZA on the proliferation of OX161 cells at 24, 48 and 72 h; D-F: Inhibition rate of MIZA on the proliferation of UCL93 cells at 24, 48 and 72 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs 0 μmol/L MIZA group. n＝5, x±s. MIZA: Mizagliflozin; MTT: Methyl thiazolyl tetrazolium. |
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表 2 集落形成实验结果 Tab 2 Results of colony formation assay |
2.4 MIZA抑制囊肿形成和生长
MDCK细胞的3D形成实验在体外模拟了囊肿的形成（图 4），结果表明MIZA对细胞囊肿的形成和生长具有抑制作用，在不同浓度（0、25、50、100、200 μmol/L）MIZA作用下，MDCK细胞囊肿直径分别为（138.3±46.2）、（131.0±51.9）、（113.8±29.6）、（104.2±34.7）和（48.4±12.0）μm。在MIZA 50~200 μmol/L浓度范围内，MDCK细胞囊肿直径逐渐缩小（P＜0.05或P＜0.01）。
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图 4 3D囊肿形成实验观察MIZA对MDCK细胞囊肿形成和生长的影响 Fig 4 Effect of MIZA on cyst formation and development in MDCK cells detected by 3D cyst formation assay MIZA: Mizagliflozin; MDCK: Madin-Darby canine kidney. |
2.5 MIZA减轻多囊肾细胞的纤维化
qPCR检测结果显示，OX161细胞中Col1A1、Col3A1、FN1 mRNA的表达量高于UCL93细胞（均P＜0.01）；加入100 μmol/L MIZA培养48 h后，OX161细胞中Col1A1、Col3A1、Fn1 mRNA的表达量降低（均P＜0.01）。见表 3。
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表 3 MIZA对细胞纤维化相关基因表达的影响 Tab 3 Effect of MIZA on expression of cell fibrosis-related genes |
2.6 MIZA可能通过PI3K-Akt、MAPK通路抑制多囊肾细胞的纤维化
通过mRNA-seq筛选UCL93细胞和OX161细胞、OX161细胞和100 μmol/L MIZA培养48 h的OX161细胞的差异表达基因，结果显示OX161细胞和UCL93细胞共有4 994个差异表达基因，其中2 361个基因表达上调，2 633个基因表达下调。OX161细胞和100 μmol/L MIZA培养48 h的OX161细胞共有153个差异表达基因，其中123个基因上调、30个基因下调（图 5A）。KEGG富集分析结果显示，UCL93细胞和OX161细胞差异表达基因主要参与的信号通路有PI3K-Akt、MAPK等信号通路（图 5B）。OX161细胞和100 μmol/L MIZA培养48 h的OX161细胞的差异基因表达主要参与的信号通路也包括PI3K-Akt、MAPK等信号通路（图 5C）。这提示MIZA可能通过PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路抑制多囊肾细胞的纤维化。
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图 5 mRNA-seq数据分析预测MIZA的作用机制 Fig 5 Analysis of mRNA-seq data to predict the mechanism of MIZA A: Heatmap of differentially expressed genes between OX161 cells and OX161 cells treated with 100 μmol/L MIZA for 48 h (OX161-M); B: KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes between OX161 cells and UCL93 cells; C: KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes between OX161 cells and OX161 cells treated with 100 μmol/L MIZA for 48 h. MIZA: Mizagliflozin; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase; Akt: Protein kinase B; MAPK: Mitogen-activated protein kinase; NOD: Nucleotide-binding oligomerization domain; TNF: Tumor necrosis factor; NF-κB: Nuclear factor κ B; ECM: Extracellular matrix; AGE: Advanced glycation end product; RAGE: Receptor of advanced glycation end product; IL-17: Interleukin 17; Th: T helper cell; ErbB: Epidermal growth factor receptor; RIG: Retinoic acid-induced gene. |
3 讨论
ADPKD是最常见的遗传性肾病，是导致终末期肾病的第4位病因，全球约有600万ADPKD患者[3]。编码多囊蛋白1的PKD1基因突变是引起ADPKD的最常见原因。ADPKD与恶性肿瘤细胞类似，以细胞增殖和生长增加、细胞极性异常、细胞代谢改变、肾间质纤维化和巨噬细胞浸润为特征，这些因素共同促进了囊肿的生长和肾功能的减退。多囊肾引起细胞的代谢改变包括糖酵解增加、脂肪酸β氧化减少、谷氨酸的利用改变、线粒体功能缺陷，而抑制代谢变化可以延缓囊肿的生长[13]。
SGLT1在多种肿瘤疾病中高表达、促进细胞增殖，是一个潜在的治疗靶点。Guo等[14]通过免疫组织化学染色技术检测了SGLT1在结直肠癌患者和正常人中的表达，发现其在结直肠癌患者中表达明显升高。Casneuf等[15]和Lai等[16]发现，SGLT1在胰腺癌和卵巢癌中升高且与预后有关。Hanabata等[17]发现SGLT1的表达与口腔鳞状细胞癌的分化有关。SGLT1的高表达可以增加细胞对葡萄糖的摄取，促进糖酵解，促进细胞的生长[10]。本研究发现SGLT1在ADPKD中高表达，且主要表达在囊肿衬里上皮细胞上，提示SGLT1在ADPKD的细胞增殖和纤维化中可能起重要作用。
本研究以肾小管上皮细胞UCL93和囊肿衬里上皮细胞OX161为细胞模型，用不同浓度的特异性SGLT1抑制剂MIZA处理细胞，检测细胞的增殖情况。MTT实验和集落形成实验结果显示，MIZA呈浓度和时间依赖性抑制OX161细胞和UCL93细胞的增殖，并且相同浓度的MIZA对OX161细胞增殖的抑制率高于UCL93细胞，提示MIZA对正常肾小管上皮细胞有较小的不良反应。100 μmol/L MIZA对OX161细胞有明显的抑制增殖作用，但对UCL93的抑制作用较轻微。本研究采用MCDK细胞的3D模型实验观察囊肿的形成，再用不同浓度的MIZA进行处理，结果显示随着MIZA浓度的升高囊肿的直径逐渐缩小。
除了对细胞增殖有影响，抑制SGLT1的功能在糖尿病性心脏病患者中还可以缓解心脏组织的纤维化现象[18]。本实验采用qPCR技术检测了Col、Fn1等纤维化指标，结果显示Col1A1、Fn1和Col3A1 mRNA在OX161细胞中的表达量明显升高，而用100 μmol/L MIZA处理后，这些指标的表达量明显降低，提示SGLT1在促进纤维化方面具有重要作用。
抑制SGLT1的功能或敲除SGLT1可以通过改变代谢过程、抑制PI3K-Akt和MAPK等信号通路抑制肿瘤细胞的增殖[9, 19]。本研究通过mRNA-seq数据分析，筛选出差异表达基因并进行了KEGG富集分析，发现OX161细胞和UCL93细胞的差异表达基因主要富集在PI3K-Akt和MAPK信号通路，100 μmol/L MIZA培养48 h的OX161细胞和OX161细胞的差异表达基因也主要富集在PI3K-Akt和MAPK信号通路，提示SGLT1抑制剂MIZA可能通过PI3K-Akt和MAPK信号通路影响多囊肾细胞的增殖和纤维化。
综上所述，SGLT1在ADPKD中的表达升高，且主要表达于多囊肾囊肿衬里上皮细胞上。抑制SGLT1的功能可以通过PI3K-Akt和MAPK信号通路抑制多囊肾细胞的增殖和纤维化，有望成为治疗ADPKD的干预靶点。
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