甲状腺功能减退症（以下简称甲减）是一种常见的内分泌疾病，系甲状腺激素缺乏引起^[1]。据报道，3.7%的美国人^[2]和4.5%的欧洲人^[3]患有甲减。慢性自身免疫性甲状腺炎是甲减的最常见原因^[4]，近年来随着甲状腺良恶性疾病发病率的增加，放射性碘治疗及甲状腺切除术后的甲减患者亦越来越多^[1]。补充外源性甲状腺激素是甲减的标准治疗方案^[5]，但是患者需要终身服药，而且外源性激素也无法实现体内下丘脑-垂体-甲状腺轴的精准调控，患者常因激素水平失衡出现神经认知障碍、乏力、体重增加等表现，严重影响生活质量^[6-7]。因此，寻找一种能让甲减患者重获最佳激素平衡状态的替代治疗势在必行。

类器官是一种体外培养的模拟活体器官的3D模型，其构成和功能与来源组织、器官高度相似^[8]。类器官技术在再生医学领域有着广阔的应用前景，通过类器官移植治疗甲减是研究的前沿与热点^[9]，有望解决外源性药物治疗带来的激素水平失调相关并发症和终身服药等问题。本研究以成人甲状腺组织为种子细胞，初步构建及鉴定了成人源性甲状腺类器官（adult-derived thyroid organoid，ADTO）模型，并优化了ADTO的体外培养方案，以期为再生医学治疗甲减的研究提供思路。

成人甲状腺组织标本来自海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院8例行手术治疗的甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者。取材及运送流程：先切除病灶侧甲状腺腺叶，再从已切除甲状腺腺叶中切取位于中极外侧的正常甲状腺组织（若病灶位于中极外侧，则选取病灶旁5 mm外肉眼观正常的甲状腺组织），取材的热缺血时间短于40 min，标本大小不小于5 mm×5 mm。将切取的标本放入预装保存液的冻存管中，用纱布包裹冻存管放入0~4 ℃泡沫箱中，后运送至实验室进行组织解离。整个取材、运送过程耗时约为2~3 h。取材后对甲状腺取材点进行标记，随后进行术后病理检测，验证取材点无肿瘤侵犯。本研究已通过海军军医大学（第二军医大学）伦理委员会审批，8例患者及其家属均签署知情同意书。

改良DMEM/F12培养基、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid，HEPES]、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAX）、B27购自美国ThermoFisher Scientific公司；人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、A83-01、前列腺素E2（prostaglandin E2）、Y-27632购自加拿大STEMCELL Technology公司；Noggin购自北京义翘神州科技股份有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine，NAC）、SB202190购自美国MedChemexpress公司；烟酰胺、胶原酶Ⅰ购自美国Sigma公司；原代细胞抗生素（Primocin）购自法国InvivoGen公司；透明质酸酶、青霉素-链霉素混合液、D-Hanks缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；FBS、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）抗体、配对盒基因8（paired-box 8，PAX8）抗体、NK2同源框蛋白1（NK2 homeobox protein 1，NKX2.1）抗体，以及山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；基质胶（Matrigel）购自美国BD Biosciences公司；Wnt3A条件培养基和R-spondin1条件培养基均为自制。人甲状腺素（thyroxine，T4）和人三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）ELISA试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司。

根据既往研究结合自身实验条件，设计了2种类器官条件培养基。条件培养基1：改良DMEM-F12培养基加入10 mmol/L HEPES，1×GlutaMAX，1×原代细胞抗生素，1×B27，1 mmol/L NAC，10 mmol/L烟酰胺，10 mmol/L前列腺素E2，20%的Wnt3A条件培养基，10%的R-spondin1条件培养基，25 ng/mL Noggin，20 ng/mL EGF，500 nmol/L A83-01^[10]；条件培养基2：改良DMEM-F12培养基加入10 mmol/L HEPES，1×GlutaMAX，1×原代细胞抗生素，1×B27，1 mmol/L NAC，10 mmol/L烟酰胺，10 mmol/L前列腺素E2，20%的Wnt3A条件培养基，10%的R-spondin1条件培养基，50 ng/mL Noggin，50 ng/mL EGF，同时联用3种小分子抑制剂（500 nmol/L A83-01、10 μmol/L Y-27632、5 μmol/L SB202190）。

在无菌条件下将新鲜成人甲状腺组织标本送至实验室处理，一部分用于构建ADTO模型，剩余部分进行组织固定（图 1）。去除标本中肌肉、脂肪和坏死组织，用无菌眼科剪剪碎组织，加入胶原酶Ⅰ/透明质酸酶/FBS/Y-27632混合液，37 ℃震荡消化30~40 min。经孔径为70 μm的滤网过滤获得单细胞悬液，200×g离心5 min，弃上清液，用D-Hanks溶液洗1~2次。取适量PBS和基质胶液重悬细胞，混匀后接种在37 ℃预热的24孔板中（每孔25 μL），在37 ℃培养箱中放置25 min待其凝固，随后加入类器官条件培养基1或2。每隔2~3 d更换培养基，2周后传代。

图 1 ADTO模型的构建流程图 Fig 1 Flow chart of ADTO model establishment ADTO: Adult-derived thyroid organoid.

吸取适量预冷PBS溶液吹打促进类器官和基质胶分离，随后冰浴上融化10~20 min，至胶体完全融化后离心弃上清液，加入TrypLE（美国Life Technologies公司）消化10 min，待类器官分离成单个细胞时，离心重悬后重新包埋，常规传代培养或冻存。

将收集的正常甲状腺组织样本和类器官模型进行H-E染色，步骤如下：4%甲醛溶液固定样本，石蜡包埋，制作切片，烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木精和伊红染液染色，梯度乙醇脱水，切片风干后封片，在显微镜下观察并拍照。

利用先前制备的石蜡切片进行免疫组织化学染色，步骤如下：烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，抗原修复，3%过氧化氢及封闭液封闭，加入稀释后的一抗（NKX2.1、PAX8和TG抗体）4 ℃孵育16 h，加入相应种属二抗孵育，DAB显色，苏木精复染，晾干后封片，在显微镜下观察并拍照。

将ADTO传代至第2代，培养至第14天，收集细胞上清液，200×g离心20 min，取上清液稀释1倍后待测。按说明书配制各工作液，ELISA（竞争结合法）检测步骤如下：（1）在细胞培养板上设立标准孔、待测样本孔和样本复孔，每孔加50 μL样本和生物素标记的抗体工作液50 μL，封板后37 ℃孵育1 h；（2）弃去液体，加洗涤液重复洗板3次；（3）加酶结合物工作液后封板，37 ℃孵育30 min；（4）洗板3次；（5）加底物封板后，37 ℃避光孵育15 min；（6）加终止液终止反应，使用酶标仪检测各孔光密度值；（7）计算各孔平均光密度值，绘制标准曲线，并根据样本稀释倍数，计算出各指标的实际浓度。

本研究共收集了8例新鲜成人正常甲状腺组织，1例组织样本保存运输不当，未进行后续处理及培养，其余7例样本均成功构建出ADTO模型，其中3号样本构建了2例ADTO模型，其余样本各构建了1例ADTO模型（图 2）。显微镜下记录6号样本来源ADTO的生长及传代情况，如图 3所示，可见其从单细胞或小微球状态长成紧致实性球体或带有滤泡样结构的球体；2周后传代，细胞增殖活跃，第2代ADTO中类器官数量显著增多。

图 2 从7例样本中成功构建的8例ADTO模型第14天的形态 Fig 2 Morphology of 8 ADTO models successfully constructed from 7 samples on day 14 ADTO models of No. 1-7 were derived from samples 1-7 (No. 3-1 and No. 3-2 were both derived from sample 3. No. 3-1 was cultured in conditioned medium 1, while No. 3-2 was cultured in conditioned medium 2). Scale bar＝100 μm. ADTO: Adult-derived thyroid organoid.

图 3 6号样本来源ADTO模型的生长及传代情况 Fig 3 Growth and passage status of ADTO model from sample 6 Scale bar＝100 μm. ADTO: Adult-derived thyroid organoid.

为探索更合理的培养基配方，对1号和2号样本来源的细胞使用条件培养基1培养，4、5、6、7号样本来源的细胞使用条件培养基2培养，而3号样本来源的细胞分别使用条件培养基1和2培养。结果显示，2种条件培养基均可培养出ADTO（图 2）。比较3号样本来源的ADTO在不同条件培养基中的生长和传代情况，结果如图 4所示，可见使用条件培养基2培养的第1代和第2代ADTO出芽更多、球体更大，说明类器官形成效率更高。

图 4 使用不同条件培养基培养的第1代和第2代ADTO模型第14天的形态 Fig 4 Morphology of passage 1 and passage 2 ADTO models cultured in different conditioned media The ADTO models were derived from sample 3. Scale bar＝100 μm. ADTO: Adult-derived thyroid organoid.

为评估ADTO模型与体内甲状腺组织在组织学形态上的符合程度，分别对原代甲状腺组织和ADTO模型进行H-E染色（图 5）。原代甲状腺组织形态正常，可见甲状腺滤泡呈圆形或椭圆形，滤泡腔及间隙内见残留红细胞，周围可见毛细血管，滤泡上皮细胞排列紧密，细胞核居中，大小比较一致。ADTO模型中可见许多大小不等的滤泡样结构，滤泡上皮细胞为单层立方状，形态正常，排列较规则，与原代甲状腺组织滤泡结构相似。

图 5 原代甲状腺组织与ADTO模型的H-E染色结果 Fig 5 H-E staining results of ADTO models and corresponding primary thyroid tissue Scale bar＝100 μm. ADTO: Adult-derived thyroid organoid; H-E: Hematoxylin-eosin.

为验证构建的ADTO模型是否反映原代甲状腺组织的分子标志物特征，采用免疫组织化学染色检测原代甲状腺组织和ADTO模型中甲状腺细胞标志物NKX2.1、PAX8和TG的表达。结果显示，构建的ADTO模型维持了与原代甲状腺组织一致的阳性表达结果，即NKX2.1、PAX8、TG均呈阳性表达；并且出现阳性表达的位置大致相似，即NKX2.1和PAX8的表达主要分布于细胞核，而TG主要在滤泡腔和细胞质中表达（图 6）。由此得出，构建的ADTO模型维持了与来源组织一致的生物学标志物特征。

图 6 原代甲状腺组织与ADTO模型的免疫组织化学染色结果 Fig 6 Immunohistochemical staining results of ADTO models and corresponding primary thyroid tissue Scale bar＝100 μm. ADTO: Adult-derived thyroid organoid; NKX2.1: NK2 homeobox protein 1; PAX8: Paired-box 8; TG: Thyroglobulin.

为验证构建的ADTO模型是否具有激素分泌功能，使用ELISA法检测了3例ADTO传代后（第2代）第14天的上清液T3和T4水平。结果显示，使用条件培养基2培养的3号样本来源、7号样本来源和6号样本来源的ADTO培养上清液中均可见一定程度的T3、T4分泌，其中6号样本来源的ADTO第2代第14天的上清液中T3和T4水平均明显高于另外2例样本来源的ADTO，同时其类器官数目也明显多于另2例样本来源的ADTO（图 7），提示ADTO分泌T3、T4的能力与类器官数目相关。

图 7 第2代ADTO模型培养至第14天时的生长状态及上清液中T3、T4水平 Fig 7 Growth status and T3 and T4 secretion of passage 2 ADTO models on day 14 A: T3 and T4 levels of supernatant of ADTO models detected by enzyme-linked immunosorbent assay (n＝3, x±s); B: Microscopic observation of the growth status of ADTO models (scale bar＝100 μm). ADTO models of No. 3-2, 7, and 6 were derived from samples 3, 7, and 6, respectively. ADTO: Adult-derived thyroid organoid; T3: Triiodothyronine; T4: Thyroxine.

在目前的研究中，甲状腺类器官主要以胚胎干细胞（embryoic stem cell，ESC）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）、成体干细胞（adult stem cell，ASC）等为种子细胞在体外培养而成^[11-12]。2012年Antonica等^[13]率先报道利用Tet调控系统诱导鼠ESC中NKX2.1和PAX8基因过表达，再加入含有特殊因子的培养基进行三维培养，成功构建了ESC来源的甲状腺类器官。2015年Ma等^[14]成功诱导NKX2.1/PAX8阳性的鼠iPSC分化为甲状腺滤泡细胞并自组装成三维甲状腺滤泡结构；将ESC/iPSC构建的甲状腺类器官移植到甲减小鼠体内，能维持激素水平、缓解甲减症状。然而，尽管ESC和iPSC构建甲状腺类器官可行，但存在分化效率低、易产生新突变和伦理学限制等问题，临床应用转化阻力较大^[15-16]。ASC亦具备干细胞的自我更新及分化特性。一些证据表明，在人、鼠甲状腺组织中均发现侧群细胞（side population cell，SPC）的存在，此类细胞表达干细胞抗原1（stem cell antigen-1，SCA1）、CD34、神经上皮干细胞蛋白（nestin）、八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）和Nanog等干细胞标志物^[17]，可在干细胞生长因子的刺激下迅速增殖，形成三维结构的悬浮干细胞球，将其接种在分化培养基上进行三维培养能够获得有功能的甲状腺类器官，此甲状腺类器官与真正的人、鼠甲状腺滤泡在功能和形态等方面都非常相似，并且能够在体外传代至15代以上^[10]。近年研究表明，直接将消化后的成人或胎儿甲状腺细胞接种在基质胶上，并在培养体系中加入EGF、成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor-10，FGF10）、Wnt、R-spondin1和Noggin等调控相关信号通路，获得的甲状腺类器官可以传代培养长达1年，将其移植至甲减小鼠肾包膜下，可发育出功能性甲状腺滤泡样结构^[18-19]。因此，ADTO可以通过组织特异性ASC作为种子细胞进行体外三维培养，相较ESC/iPSC，其具备来源易获取、培养及操作简单和不涉及伦理道德问题等优势，并可以在体外长期培养的过程中维持遗传和表型的稳定^[10]。

我们利用7例PTC患者的正常甲状腺组织成功构建了ADTO，对ADTO进行传代培养，观察到细胞增殖活跃，第2代ADTO中类器官数量显著增多，而既往研究显示ADTO可在体外稳定传代至第7代或稳定扩增超过1年^{[10, 18]}，这些证据表明ADTO模型能稳定传代并维持增殖活力。对原代甲状腺组织及ADTO模型的H-E染色结果显示，ADTO模型的组织学形态类似于原代甲状腺组织，其中可见许多大小不等的滤泡结构，滤泡外层由甲状腺上皮细胞组成，上皮细胞形态正常，与正常甲状腺上皮相似。对原代组织及ADTO模型的免疫组织化学染色结果显示，NKX2.1和PAX8均呈阳性，这2种转录因子共表达为甲状腺细胞所特有^[20]，提示了这些细胞的来源；而TG在滤泡腔和细胞质中表达，进一步证实了功能性甲状腺滤泡的发育^{[13, 21]}。本研究还采用ELISA法检测了3例第2代ADTO模型在培养第14天的上清液T3、T4水平，初步证实构建的ADTO模型具有甲状腺激素分泌能力，且激素水平与类器官的数目有关。组织学形态、甲状腺标志物及激素水平检测结果均提示本研究成功构建了ADTO模型。

ADTO的培养基成分复杂，不同培养条件下的类器官形成效率存在差异，需要探索更佳的培养基配方。现有ADTO培养体系中，R-spondin1和Noggin的主要作用是促进干细胞增殖，EGF可促进甲状腺滤泡上皮细胞增殖，Y-27632[Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho associated coiled coil containing protein kinase，ROCK）抑制剂]可有效抑制干细胞的凋亡与分化，与A83-01（TGF-β抑制剂）和SB202190（p38抑制剂）联合使用可以提高细胞的存活率和细胞增殖能力、促进类器官形成^[22-23]。据此，本研究对Ogundipe等^[10]的培养基（条件培养基1）进行优化，提高关键因子Noggin和EGF的浓度并联用3种小分子抑制剂A83-01、Y-27632和SB202190，使用优化培养基（条件培养基2）培养的ADTO出芽更多、球体更大。这将为ADTO培养条件的进一步探索提供参考。

综上所述，本研究追踪并优化了ADTO培养体系，成功构建了8例ADTO模型，鉴定结果显示构建的ADTO模型与正常甲状腺组织间一致性较高，初步探讨了利用成人甲状腺组织构建甲状腺类器官的可行性。但本研究也存在一定的局限性：（1）由于样本量及培养基分组较少，本实验仅对AOTO培养条件的优化进行了初步探索，但培养基的最佳配方及各因子的最佳浓度尚需要进一步研究。（2）由于缺乏动物实验，ADTO移植后能否发挥甲状腺细胞的作用尚不得而知，且目前探索体内移植最佳部位和数量的研究仍处于空白状态，这也将是今后ADTO研究的重点方向。