2023, Vol. 44
胰岛素是机体降低血糖的重要激素，胰腺β细胞在内质网中可形成前胰岛素原，其信号肽被信号肽酶剪切形成另一个前体胰岛素原，经过分子伴侣及相关蛋白处理后形成具有空间结构的胰岛素原，后者被运出内质网到达高尔基体发挥作用[1-2]。当胰岛素原在内质网中发生错误折叠不能运出时，内质网的稳态被打破，错误折叠的蛋白质在其中积累可致内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。外被蛋白Ⅱ（coat protein Ⅱ，COP-Ⅱ）可介导非选择性运输，参与内质网到高尔基体的运输[3]。分泌及Ras相关GTP酶1A（secretion associated Ras related GTPase 1A，sar-1A）是具有召集鸟苷三磷酸酶的蛋白，主要在细胞质中表达，与转运蛋白Sec23、Sec24形成二聚体后参与COP-Ⅱ的形成，当sar-1A发生化学突变后会导致COP-Ⅱ功能障碍[4]。有研究表明，当COP-Ⅱ发生功能障碍时胰岛素原从内质网输出减慢，胰岛素原的表达减少，可对内质网稳态产生影响[5]。
中医将糖尿病归属为消渴范畴，认为其发病机制与饮食不节、中焦失运或先天不足、后天失养有关。黄连化浊胶囊又名黄金胶囊，是根据浊毒理论所研制的中药复方制剂，由温胆汤转化而来，具有清热解毒、运脾化浊等功效，其可以通过降低胰岛素抵抗控制血糖[6]。本研究探讨了黄连化浊胶囊对sar-1A敲除诱导COP-Ⅱ功能障碍胰岛β细胞ERS的干预效果，以期为相关研究提供参考。
1 材料和方法 1.1 实验动物及细胞30只4周龄、体重为200~350 g的SPF级雄性SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[动物生产许可证号：SCXK（鲁）20190003]。饲养条件：在相对湿度为55%、常温、模拟昼夜交替环境下，无菌饮食2周。按照《实验动物管理条例》规定进行实验，动物实验经我院伦理委员会审批，批准号为[2021]动伦审字（S742）。小鼠胰岛β细胞Min6购自通派（上海）生物科技有限公司。
1.2 药物、主要试剂与仪器黄连化浊胶囊（黄连9 g，鸡内金12 g，法半夏9 g，竹茹15 g，枳实9 g，陈皮9 g，茯苓15 g，炙甘草9 g）为甘肃中医药大学附属医院院内制剂（批准文号：甘药制字Z120110），批号171103。马来酸罗格列酮片为葛兰素史克（天津）有限公司产品（批准文号：国药准字H20020475）。
小鼠sar-1A siRNA（货号L-042764-00-0005，中国Dharmacon公司），FBS、青-链霉素、PBS、0.25%胰蛋白酶溶液（货号分别为SH30109.03、SV30010、SH30256.01、SH30042.01，美国HyClone公司），脂质体LipofectamineTM 2000（货号13778-075，中国ThermoFisher Scientific公司），Opti-MEM培养基[货号U21-08100F，攸碧艾（上海）贸易有限公司]，sar-1A抗体[货号15350-1-AP，安诺伦（北京）生物科技有限公司]，C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）抗体、β-肌动蛋白抗体（货号分别为GTX112827、GTX629630，中国GeneTex公司），胰岛素原单克隆抗体（货号HZK-11647，上海沪峥生物科技有限公司），兔抗鼠真核翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）单克隆抗体（货号XG-K1047，上海西格生物科技有限公司），兔抗鼠X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）单克隆抗体（货号YB00708，上海钰博生物科技有限公司），肌醇需求酶1（inosital-requiring enzyme 1，IRE1）单克隆抗体（货号IMX-3612，武汉艾美捷科技有限公司），兔抗鼠X盒（X-box）蛋白单克隆抗体（货号9016049，深圳子科生物科技有限公司），Prime ScriptRT Master Mix试剂盒（货号RR036A，日本TaKaRa公司），磷酸化真核翻译起始因子2α（phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α，p-eIF2α）抗体（货号HK10458，上海户实医药科技有限公司），TRIzol提取试剂盒（货号YIJI10254655，上海一基实业有限公司），PCR SYBR Preme Ex Taq Ⅱ（2×）试剂盒（货号RR820A，武汉科昊佳生物科技有限公司），sec31抗体（货号ybs-4453R，上海研谨生物科技有限公司），荧光淬灭封片剂（货号LM-1058D，上海联迈生物工程有限公司），HRP标记的二抗（货号H6161S/H6161，苏州优逸兰迪生物科技有限公司），0.2% Triton X-100（货号JK-E1694，上海晶抗生物有限公司）。
DA7600实时荧光定量PCR仪（中山大学达安基因股份有限公司），伯乐ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统（中国Bio-Rad公司），Qilinbeier TS-1000型摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），IX71型倒置显微镜（上海赖氏电子科技有限公司），TDZ4-WS型低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），电泳仪（北京六一仪器厂），Smartproof 5型激光共聚焦显微镜（德国蔡司公司），蔡司Zen 4.000软件（中国Carl Zeiss显微镜有限责任公司），Image-LabTM图像分析系统（哈尔滨德远科技开发有限公司）。
1.3 Min6细胞培养及sar-1A siRNA转染Min6细胞用含有10% FBS、1% 青霉素、1% 链霉素的Opti-MEM培养基，于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞进行后续实验。将Min6细胞分为空白组、阴性对照（negative control，NC）组及sar-1A siRNA组。转染方法：将Min6细胞接种到6孔板中，利用脂质体LipofectamineTM 2000进行转染，将sar-1A siRNA、sar-1A -NC-siRNA分别转染50% 融合的Min6细胞，转染48 h后收获细胞进行后续实验。空白组细胞不做任何干预处理。
1.4 qPCR检测Min6细胞中sar-1A mRNA表达采用TRIzol提取试剂盒提取细胞中总RNA。相关基因引物均由济南海智科技发展有限公司设计并合成。参考5×Prime ScriptRT Master Mix试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。PCR扩增参考SYBR Preme Ex Taq Ⅱ（2×）试剂盒说明书进行。引物序列如下：sar-1A正向引物为5' -CG-CGAATTCAATGTCTTTCATATTTGAGTGG-3'，反向引物为5' -GGATCCTCAGTCAATATACTG-GGAGAGTTAGC-3'；β-肌动蛋白正向引物为5' -CCGCCAGAAGATGAGTGAAAT-3'，反向引物为5' -ACGCTTCACGAATTTGGGTHTC-3'。基因相对转录水平采用2－ΔΔCt法计算。
1.5 大鼠含药血清的制备30只大鼠按照随机数字表法分为空白组、黄连化浊胶囊组及罗格列酮组，每组10只。空白组不做任何干预处理。黄连化浊胶囊组灌胃2.025 g/kg的黄连化浊胶囊，罗格列酮组灌胃罗格列酮0.5 mg/kg，每日2次，连续3 d。末次灌胃结束后，采用1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，取大鼠腹主动脉血2 mL，静置1 h，3 000×g离心10 min，取空白血清和含药血清于－80 ℃保存，使用前以0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
1.6 细胞分组及药物处理将转染sar-1A siRNA的Min6细胞分为空白血清组（用含10%大鼠空白血清的培养基培养）、5%黄连化浊胶囊组（用含5% 黄连化浊胶囊含药血清的培养基培养）、10%黄连化浊胶囊组（用含10%黄连化浊胶囊含药血清的培养基培养）、20%黄连化浊胶囊组（用含20%黄连化浊胶囊含药血清的培养基培养）及罗格列酮组（用含10%罗格列酮含药血清的培养基培养），24 h后收集细胞进行实验。
1.7 免疫荧光法检测sar-1A敲减对Min6细胞sec31蛋白表达的影响Min6细胞在37 ℃、5% CO2培养箱孵育48 h后，弃去培养基，PBS洗涤，用4%多聚甲醛溶液固定5 min，PBS洗涤3次，室温封闭1 h。按照说明书比例加入sec31抗体及0.2% Triton X-100，室温孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗涤后加入适量抗荧光淬灭封片剂，在激光共聚焦显微镜下观察拍照，并用蔡司Zen 4.000软件分析各组sec31蛋白表达的平均荧光强度。
1.8 蛋白质印迹法检测sar-1A敲减对Min6细胞胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白表达的影响用PBS（pH 7.0）清洗细胞，添加蛋白质裂解液裂解细胞10 min，将1.5 mL样本收集至离心管中，14 170×g离心20 min，静置60 s后提取上清液，每个样本取上清液25 μL检测蛋白浓度。取50 μg蛋白进行SDS-PAGE。后继续转膜，PVDF膜从转膜槽中取出，用TBST漂洗5 min，加入稀释后的胰岛素原抗体（稀释比例为1∶150）、p-eIF2α抗体（稀释比例为1∶250）、CHOP抗体（稀释比例为1∶200）、XBP1抗体（稀释比例为1∶500）、IRE1抗体（稀释比例为1∶150）、X-box抗体（稀释比例为1∶150）及内参GAPDH抗体（稀释比例为1∶500）孵育，加入HRP标记的二抗（稀释比例为1∶1 000）孵育。避光环境下加显影液，反应60 s后，用Image-Lab图像分析系统进行成像和分析。
1.9 统计学处理应用GraphPad Prism 8软件分析，所有数据符合正态分布，以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著性差异法。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 sar-1A siRNA转染的Min6细胞中sar-1A mRNA的表达空白组、NC组及sar-1A siRNA组Min6细胞中sar-1A mRNA表达量分别为1.00±0.00、0.97±0.04、0.42±0.07，3组间差异有统计学意义（P＜0.01）。与NC组相比，sar-1A siRNA组Min6细胞中sar-1A mRNA表达降低（P＜0.01）。
2.2 sar-1A敲减对Min6细胞sec31蛋白表达的影响空白组、NC组及sar-1A siRNA组Min6细胞中sec31蛋白的平均荧光强度分别为1.30±0.22、1.27±0.26及0.79±0.16，3组间差异有统计学意义（P＜0.05）。与NC组相比，sar-1A siRNA组Min6细胞中sec31蛋白平均荧光强度降低（P＜0.05）。见图 1。
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图 1 免疫荧光法检测各组Min6细胞中sec31蛋白的表达（200×） Fig 1 Expression of sec31 in Min6 cells in each group detected by immunofluorescence (200×) GFP: Green fluorescence protein; sar-1A: Secretion associated Ras related GTPase 1A; siRNA: Small interfering RNA. |
2.3 sar-1A敲减对Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白表达的影响
空白组与NC组Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白表达的差异均无统计学意义（P均＞0.05）；与NC组相比，sar-1A siRNA组胰岛素原和X-box蛋白的表达降低（P均＜0.05），p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1蛋白的表达升高（P均＜0.05）。见表 1、图 2。
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表 1 3组Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白的表达水平 Tab 1 Expression levels of proinsulin, p-eIF2α, CHOP, XBP1, IRE1 and X-box in Min6 cells of 3 groups |
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图 2 蛋白质印迹法检测3组Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白的表达 Fig 2 Expression of proinsulin, p-eIF2α, CHOP, XBP1, IRE1 and X-box in Min6 cells of 3 groups detected by Western blotting 1: Blank group; 2: Negative control group; 3: sar-1A siRNA group. p-eIF2α: Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α; CHOP: C/EBP homologous protein; IRE1: Inosital-requiring enzyme 1; XBP1: X-box binding protein 1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; sar-1A: Secretion associated Ras related GTPase 1A; siRNA: Small interfering RNA. |
2.4 黄连化浊胶囊对Min6细胞中sar-1A mRNA表达的影响
空白血清组、5%黄连化浊胶囊组、10% 黄连化浊胶囊组、20%黄连化浊胶囊组及罗格列酮组Min6细胞中sar-1A mRNA表达水平分别为0.46±0.05、0.63±0.07、0.80±0.10、0.96±0.11、0.82±0.09，组间差异有统计学意义（P＜0.001）。与空白血清组相比，其他4组sar-1A mRNA的表达均升高（P均＜0.05）；5%、10%、20% 黄连化浊胶囊组的sar-1A mRNA表达水平随黄连化浊胶囊浓度升高而逐渐增加，各组间差异均有统计学意义（P均＜0.05）；10% 黄连化浊胶囊组与罗格列酮组的sar-1A miRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），5%、20%黄连化浊胶囊组与罗格列酮组的sar-1A miRNA表达水平差异均有统计学意义（P均＜0.05）。
2.5 黄连化浊胶囊对Min6细胞中sec31蛋白表达的影响结果见图 3。空白血清组、5% 黄连化浊胶囊组、10% 黄连化浊胶囊组、20% 黄连化浊胶囊组及罗格列酮组Min6细胞中sec31蛋白的平均荧光强度分别为37.48±4.63、39.02±5.52、56.11±7.20、62.24±8.11和61.54±7.96，组间差异有统计学意义（P＜0.001）。空白血清组及5% 黄连化浊胶囊组的Min6细胞中sec31蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与5% 黄连化浊胶囊组相比，10%、20%黄连化浊胶囊组及罗格列酮组的Min6细胞中sec31蛋白表达均增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）；20%黄连化浊胶囊组与罗格列酮组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
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图 3 免疫荧光法检测黄连化浊胶囊对Min6细胞中sec31蛋白表达的影响（200×） Fig 3 Effect of Huanglian Huazhuo capsule on sec31 expression in Min6 cells detected by immunofluorescence (200×) GFP: Green fluorescence protein. |
2.6 黄连化浊胶囊对Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白表达的影响
空白血清组与5%黄连化浊胶囊组Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白表达的差异均无统计学意义（P均＞0.05）；与5% 黄连化浊胶囊组相比，10%、20% 黄连化浊胶囊组及罗格列酮组的Min6细胞中胰岛素原的表达均增加，p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白的表达均降低（P均＜0.05）；20% 黄连化浊胶囊组与罗格列酮组上述蛋白的表达差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表 2、图 4。
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表 2 5组Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白的表达水平 Tab 2 Expression levels of proinsulin, p-eIF2α, CHOP, XBP1, IRE1 and X-box in Min6 cells of 5 groups |
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图 4 蛋白质印迹法检测5组Min6细胞中胰岛素原、p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box蛋白的表达 Fig 4 Expression of proinsulin, p-eIF2α, CHOP, XBP1, IRE1 and X-box in Min6 cells of 5 groups detected by Western blotting 1: Blank serum group; 2: 5% Huanglian Huazhuo capsule group; 3: 10% Huanglian Huazhuo capsule group; 4: 20% Huanglian Huazhuo capsule group; 5: Rosiglitazone group. p-eIF2α: Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α; CHOP: C/EBP homologous protein; XBP1: X-box binding protein 1; IRE1: Inosital-requiring enzyme 1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. |
3 讨论
内质网是哺乳动物最重要的细胞器，发挥着蛋白质合成、转运、折叠等作用，参与细胞质合成及钙离子的贮存。内质网具有正常的生理结构及功能，当未折叠或错误折叠的蛋白质数量增加时会破坏内质网稳态，导致氧化应激反应，称为ERS。胰岛β细胞是具有分泌胰岛素功能的细胞，正常状态下含有大量成熟的高尔基体，可经过一系列程序形成胰岛素原并发挥生理作用，但是在病理状态下胰岛素会大量进入内质网导致内质网钙耗竭，引起ERS。研究证实内质网中错误折叠的蛋白质激活在糖尿病的发生、发展中具有重要作用，认为缓解ERS对于治疗糖尿病具有重要意义[7]。
本研究结果显示，敲减sar-1A可增加胰岛β细胞中COP-Ⅱ功能障碍，导致内质网输出损伤而降低胰岛素原表达，升高p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box的表达，导致ERS的发生。胰岛素原运出内质网需要借助COP-Ⅱ作为载体到达高尔基复合体而发挥作用。研究表明，在胰岛β细胞中改变sar-1A表达可导致胰岛素原积累在内质网，使胰岛素合成受限，促进糖尿病的发生、发展[8]。sar-1A蛋白可募集家族成员形成异二聚体，是COP-Ⅱ主要组成部分，sar-1A在COP-Ⅱ可发挥促进囊泡分裂的作用，有利于胰岛素原的运输，降低胰岛素抵抗。为进一步证实COP-Ⅱ介导的内质网在胰岛素折叠中的作用，研究者在胰岛β细胞中转染sar-1A siRNA，降低了COP-Ⅱ相关蛋白sec31，增加胰岛素原错误重叠，导致内质网损伤并阻碍胰岛素原成熟[8]。ERS的发生过程主要依赖于内质网膜上的跨膜蛋白。IRE1是具有激酶活性及RNA酶活性的跨膜蛋白，在ERS发生过程中能够与Bip分离，并加快使其中的26个核苷酸从XBP1基因释放，最终经过转录因子到达细胞核，加快脂质代谢及炎症相关基因的表达及转录[9-10]。研究表明，当胰岛β细胞应激反应增加时可导致蛋白激酶R样内质网激酶下游因子eIF2α磷酸化，进而加快胰岛β细胞凋亡[11]。
本实验结果表明，对敲减sar-1A后的胰岛β细胞采用黄连化浊胶囊含药血清共培养，可改善其COP-Ⅱ功能障碍，并通过降低p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box表达及加快胰岛素原表达，改善胰岛素抵抗。
糖尿病的病因是外感六淫，导致五脏六腑功能失调，气血运化失常，气血停滞而脉络受阻，瘀血内生而化为血浊[12]。血浊累积于肝脏，诱导肝脏ERS发生，p-eIF2α、CHOP、XBP1、IRE1、X-box表达升高，胰岛素抵抗产生，最终导致糖尿病发生、发展。
黄连化浊胶囊具有抗糖尿病的作用，从糖尿病浊毒病理机制出发，黄连性寒、味苦，归心、脾、胃、胆及大肠经，具有泻毒、清燥、除湿及止消渴的功效[13]；鸡内金味甘、性平，归脾、小肠、胃及膀胱经，具有健脾、化滞及缩小便之功。两者均为君药，达到标本兼治及化浊、解毒的功效[14]。法半夏性温，味辛，归胃及脾脏，具有健脾除燥、温胃降逆的功效；竹茹微寒性，味甘，归胃经、胆经、脾经，具有开胃、清肺及除燥的作用；陈皮味辛，性温，归肺、脾经，以辛散之，以苦燥之，消痰导滞；枳实味苦，性寒，归胃、脾经，具有破气、化痰、消痞的作用。四者均为臣药，共奏健脾、化痰等功效[15]。茯苓味甘、淡，性平，无毒，归心、脾、肺、肾经，具有益脾除湿、安神生津的作用；炙甘草味甘气温，调和诸药，为使药。全方共奏清热解毒、运脾化浊之效。黄连与鸡内金配伍，黄连善清中焦湿热，善治胃火炽盛，清解浊毒之邪，对于消渴病之多食易饥尤其以脾虚痰湿型消渴病尤为适用。在糖尿病大鼠中，黄连化浊胶囊可改善ERS紊乱，减轻肝脏损伤，这与其降低eIF2α及葡萄糖调节蛋白78表达相关[16]。本研究结果表明，与5%黄连化浊胶囊组相比，10%黄连化浊胶囊组的抗ERS损伤作用显著；与10%黄连化浊胶囊组相比，20%黄连化浊胶囊组改善sar-1A缺失而降低COP-Ⅱ损伤的作用更加显著，说明随着黄连化浊胶囊药物用量的升高其抗ERS作用增强。
综上所述，sar-1A敲减后胰岛β细胞存在COP-Ⅱ功能障碍，黄连化浊胶囊可降低sar-1A敲减后胰岛β细胞的ERS水平，有望为相关疾病的治疗提供新的干预靶点。
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