仙人菇口服液为海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院院内自制制剂，是魏品康教授结合多年临床经验研制而成的天然干扰素诱生剂、免疫调节剂，具有益气填精、扶正固本等功效。前期研究表明，仙人菇口服液能够促进人体蛋白质合成，提高肝细胞活性，降低患者体内循环免疫复合物含量，提升机体免疫功能，与其他药物合用能增效减毒^[1-3]。临床上仙人菇口服液主要用于治疗和改善慢性消耗性疾病、疲劳综合征等，对恶性肿瘤放化疗造成的贫血及免疫功能低下具有辅助治疗作用，临床应用已近20余年，疗效确切^[4-7]。

仙人菇口服液全方由淫羊藿、黄芪、人参、虫草菌丝体、白术（炒）、枸杞子、山慈菇、灵芝8味中药组成。以淫羊藿为君药，旨在温阳补肾、调摄冲任。淫羊藿苷作为淫羊藿的主要有效成分，对恶性肿瘤的发生、发展有明显的抑制作用^[6]。以黄芪、人参、虫草菌丝体、白术（炒）、枸杞子为臣药，其中黄芪、人参、白术（炒）功效为健脾补气，虫草菌丝体和枸杞子益气填精、扶正固本。现代药理学研究表明上述药物具有增强人体免疫力及抗肿瘤等作用，已广泛应用于肿瘤的临床治疗^[7-11]。佐以山慈菇，消痰散结、解毒攻坚，使肿块消散于无形，《本草新编》有云“山慈菇，可治怪病。大约怪病多起于痰，山慈菇为消痰之药，治痰而怪病自除也”。现代医学研究也表明，山慈菇可降低血黏度，减少肿瘤细胞着床的机会，从而减少复发和转移^[12]。使以灵芝，补肺益肾、提升正气。灵芝多糖类化合物和灵芝三萜类化合物是灵芝的主要药效成分，灵芝多糖预防和治疗肿瘤的机制除免疫调节外，还包括抑制肿瘤血管新生、诱导细胞分化、诱导Ⅱ相酶、调节信号转导等^[13]。

目前仙人菇口服液的质量标准主要采用薄层色谱法对黄芪、淫羊藿、枸杞、白术、人参等5种药材进行定性鉴别，还采用HPLC对淫羊藿主要成分淫羊藿苷进行含量测定^[14]。由于该口服液为复方制剂，单一成分的含量测定结果难以反映整体质量优劣。因此，有必要建立一种快速、准确的多成分含量测定方法以完善其质量标准。参考文献[15-18]，本实验采用HPLC对仙人菇口服液中腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ等10种有效成分进行含量测定，为仙人菇口服液质量标准的建立提供科学依据。

Agilent 1200高效液相色谱仪系统，包括G1311A（四元泵）输液泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1314A VWD检测器、ChemStation色谱工作站。十万分之一电子天平，CPA225D型[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；SK7200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；5810R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；10、20、100、200、1 000 μL移液器（德国Eppendorf公司）；WL-901型旋涡振荡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

淫羊藿苷（批号T09N6B5664）、朝藿定B（批号P25F8F30154）、朝藿定C（批号C18J3G1）、宝藿苷Ⅰ（批号R11M8F31212）、虫草素（批号N12M7W14489）、毛蕊异黄酮（批号P29M6R2）、灵芝酸A（批号Z15O6X4326）、腺苷（批号Z23S7J21814）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司（HPLC测定含量≥98%）。芒柄花苷（批号MB6579）、芦丁（批号MB5118）对照品购自大连美仑生物技术有限公司（HPLC测定含量≥98%）。仙人菇口服液由海军军医大学（第二军医大学）第二附属医院制剂室生产，批号为210328、210416、210520。

甲醇、乙腈为色谱纯，由赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产。水为娃哈哈纯净水。

色谱柱为Dikma Diamonsil Plus C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序：0~3 min，2%~5% A；4~7 min，5% A；8~17 min，5%~20% A；18~21 min，20%~30% A；22~38 min，30% A；39~48 min，30%~90% A）；流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为270 nm，进样量为10 μL。

精密称取淫羊藿苷20 mg、朝藿定C 20 mg分别置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成约10.0 mg/mL的对照品母液；精密称取朝藿定B 2.03 mg、宝藿苷Ⅰ 2.01 mg、芒柄花苷2.04 mg、毛蕊异黄酮2.02 mg、灵芝酸A 2.03 mg、芦丁2.04 mg、腺苷2.02 mg，分别置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成约1.00 mg/mL的对照品母液。精密称取虫草素20 mg，置于2 mL容量瓶中，加20%甲醇水溶液配制成10.0 mg/mL的对照品母液。所有母液均置于－20 ℃冰箱保存备用。分别将淫羊藿苷、朝藿定C和虫草素对照品母液用流动相的初始相稀释成1 000、100、10和1 μg/mL的储备液备用；将朝藿定B、宝藿苷Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、芦丁和腺苷对照品母液用流动相的初始相稀释成100、10和1 μg/mL的储备液备用。

取仙人菇口服液适量，超声处理15 min，精密吸取200 μL置于1.5 mL离心管中，加乙酸乙酯200 μL，涡旋30 s，以12 000×g高速离心5 min，吸取上清液200 μL，再重复上述操作2次。将3次的上清液合并后置于挥干仪中挥干，用1 000 μL的初始流动相复溶，12 000×g高速离心5 min，取上清液10 µL进样，进行HPLC分析，采用外标法计算样品含量。

取仅有流动相的空白溶液、混合对照品溶液及供试品溶液按1.3节色谱条件进行测定，分析空白溶液在相应位置上有无干扰峰。

精密吸取按1.4.1小节条件制备的对照品储备液适量，置于1 mL容量瓶中，用初始流动相定容、摇匀，得到系列浓度的对照品混合溶液（腺苷：0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/mL；虫草素和淫羊藿苷：6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL；芦丁：1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL；芒柄花苷：0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL；朝藿定B：0.375、0.75、1.5、3、6、12、24 μg/mL；朝藿定C：3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL；毛蕊异黄酮和灵芝酸A：0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL；宝藿苷Ⅰ：0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL），按1.3节色谱条件进样，平行进样3次，以色谱峰面积为纵坐标（Y）、浓度为横坐标（X）进行线性回归。

取腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ的混合对照品溶液（腺苷2 μg/mL，虫草素和淫羊藿苷50 μg/mL，芦丁10 μg/mL，芒柄花苷4 μg/mL，朝藿定B 3 μg/mL，朝藿定C 25 μg/mL，毛蕊异黄酮和灵芝酸A 5 μg/mL，宝藿苷Ⅰ1 μg/mL），按1.3节色谱条件平行进样6次。计算各成分的RSD值。

取仙人菇口服液供试品（批号210416），按1.4.2小节条件平行制备6份供试品溶液，按1.3节色谱条件进样，测定峰面积，分别计算各成分含量的RSD，验证方法的重复性。

取仙人菇口服液供试品（批号210416），按1.4.2小节条件制备供试品溶液，分别在室温放置0、4、6、8、12、24 h时取样，按1.3节色谱条件进样，记录峰面积，计算各成分含量的RSD值，验证方法的稳定性。

精密量取仙人菇口服液供试品（批号210416）6份，精密加入与样品中各成分含量相当的混合对照品溶液，按1.3节色谱条件进样，计算各成分的加样回收率和RSD。

按1.4.2小节条件制备供试品溶液，按1.3节色谱条件进样测定峰面积，根据标准曲线计算3个批号仙人菇口服液中各成分的含量。

专属性考察结果显示混合对照品分离完全，空白溶液在相应位置上均无干扰峰，见图 1。

图 1 空白溶液（A）、混合对照品溶液（B）及供试品溶液（C）的HPLC色谱图 Fig 1 HPLC chromatogram of blank (A), mixed reference substance (B), and sample solution (C) 1: Adenosine; 2: Cordycepin; 3: Rutin; 4: Ononin; 5: Epimedin B; 6: Epimedin C; 7: Icariin; 8: Calycosin; 9: Ganoderic acid A; 10: Baohuoside Ⅰ. HPLC: High-performance liquid chromatography.

标准曲线结果显示各成分线性回归符合方法学要求（r ＝0.999 2~0.999 8）。线性范围：腺苷为0.250~16.0 µg/mL，虫草素和淫羊藿苷为6.25~400 µg/mL，芦丁为1.25~80.0 µg/mL，芒柄花苷为0.500~32.0 µg/mL，朝藿定B为0.375~24.0 µg/mL，朝藿定C为3.12~200 µg/mL，毛蕊异黄酮和灵芝酸A为0.625~40.0 µg/mL，宝藿苷Ⅰ为0.125~8.00 µg/mL。

结果显示腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ含量的RSD分别为0.30%、0.23%、1.77%、0.22%、0.42%、1.91%、0.42%、0.34%、0.32%、0.93%（n ＝6），表明该方法的精密度良好。

结果显示腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ含量的RSD分别为3.54%、0.86%、2.59%、1.06%、1.14%、0.11%、0.11%、1.72%、3.73%、1.44%，表明该方法重复性好。

结果显示腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ含量的RSD分别为1.70%、0.98%、2.84%、1.57%、1.97%、0.56%、0.24%、3.0%、3.96%、1.99%，表明供试品溶液在室温下能够稳定保存。

结果显示，腺苷平均回收率为97.64%（RSD为3.74%），虫草素平均回收率为96.32%（RSD为0.86%），芦丁平均回收率为97.46%（RSD为2.59%），芒柄花苷平均回收率为98.48%（RSD为1.69%），朝藿定B平均回收率为98.92%（RSD为2.41%），朝藿定C平均回收率为99.07%（RSD为1.74%），淫羊藿苷平均回收率为99.37%（RSD为0.79%），毛蕊异黄酮平均回收率为96.72%（RSD为3.57%），灵芝酸A平均回收率为99.60%（RSD为0.73%），宝藿苷Ⅰ平均回收率为97.50%（RSD为3.15%），均符合分析方法要求^[18]。

依法测定3批仙人菇口服液中腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ的含量，结果见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 仙人菇口服液样品中10种成分的含量测定结果 Tab 1 Determination of 10 components in Xianrengu oral liquid  (µg·mL－1), n ＝3, x±s Component Batch 210328 Batch 210416 Batch 210520 Adenosine 4.06±0.16 3.94±0.13 3.93±0.18 Cordycepin 161.17±1.39 162.64±2.99 162.13±3.52 Rutin 7.94±0.21 7.85±0.42 7.74±0.49 Ononin 17.30±0.29 17.18±0.18 17.02±0.62 Epimedin B 10.00±0.15 10.03±0.12 9.91±0.65 Epimedin C 92.90±0.61 92.13±0.10 91.56±1.67 Icariin 272.88±0.58 274.26±0.31 273.59±1.49 Calycosin 9.35±0.15 9.41±0.16 9.33±0.13 Ganoderic acid A 33.47±1.37 32.54±1.22 33.04±1.28 Baohuoside Ⅰ 5.89±0.12 5.73±0.08 5.77±0.15

表 1 仙人菇口服液样品中10种成分的含量测定结果 Tab 1 Determination of 10 components in Xianrengu oral liquid

本实验建立了HPLC方法对仙人菇口服液中腺苷、虫草素、芦丁、芒柄花苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、毛蕊异黄酮、灵芝酸A、宝藿苷Ⅰ的含量进行同时测定。方法学考察结果表明，该法操作简单，具有良好的重复性、稳定性和精密度，可为仙人菇口服液的质量标准提供参考。

在其他色谱条件不变的情况下改变波长，分别在270、280、290、300 nm波长下对混合对照品溶液进行分析，结果表明270 nm波长色谱出峰效果优于其他波长，故选择270 nm作为检测波长。

在270 nm检测波长、流速1.0 mL/min、进样量10 μL、柱温30 ℃的条件下，对常规流动相乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.05%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、乙腈-0.2%冰醋酸水溶液、乙腈-5 mmol/L醋酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-水的洗脱效果进行比较，结果发现乙腈-0.1%冰醋酸水溶液能够缩短出峰时间，实现待测物质良好的色谱分离，并且乙腈的黏度小，能够有效降低系统压力。进一步对不同浓度（0.05%、0.1%和0.2%）冰醋酸进行比较得出，0.1%冰醋酸分离效果最佳。故本实验以乙腈和0.1%冰醋酸水溶液作为流动相，其能够将10种成分完全分离，且配制简单。

精密吸取1 mL仙人菇口服液，共3份，分别进行以下处理：（1）直接进样法。置于5 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，过滤，取续滤液。（2）超声进样法。置于5 mL容量瓶中，加流动相至刻度，超声处理30 min，放至室温，加流动相至刻度，摇匀，过滤，取续滤液。（3）萃取法。加乙酸乙酯提取3次，每次1 mL，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣加5 mL流动相溶解。将3种方法处理后的样品溶液分别进行HPLC分析，结果表明运用萃取法得到的样品色谱基线稳定，色谱出峰效果优于其他2种方法，故选择萃取法作为仙人菇口服液样品成分的提取方法。

分别用二氯甲烷、三氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯200 μL萃取仙人菇口服液，结果表明用乙酸乙酯萃取的样品色谱出峰多、响应高，故选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。精密吸取200 μL仙人菇口服液3份，以乙酸乙酯（每次200 μL或400 μL）分别萃取3次，结果以每次200 μL乙酸乙酯进行萃取的色谱出峰效果好，故选择1∶1萃取。精密吸取200 μL仙人菇口服液3份，加入600 μL乙酸乙酯萃取1次，与加入200 μL乙酸乙酯萃取3次比较，后者色谱图谱中杂峰少、分离效果好，故选择以200 μL乙酸乙酯萃取3次作为仙人菇口服液的预处理方法。