海军军医大学学报  2023, Vol. 44 Issue (8): 984-988   PDF    
引用本文
周银娣, 黄颖, 李婷婷, 张昌峰, 成组群, 沈继录, 李霞, 胡付品. 合肥地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型及耐药性分析[J]. 海军军医大学学报, 2023, 44(8): 984-988  
ZHOU Yindi, HUANG Ying, LI Tingting, ZHANG Changfeng, CHENG Zuqun, SHEN Jilu, LI Xia, HU Fupin. SCCmec typing and drug resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Hefei[J]. Academic Journal of Naval Medical University, 2023, 44(8): 984-988 (in Chinese with English abstract)  
合肥地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型及耐药性分析
周银娣1, 黄颖2, 李婷婷2, 张昌峰3, 成组群4, 沈继录4, 李霞5, 胡付品6     
1. 合肥市第一人民医院检验科, 合肥 230001;
2. 安徽医科大学第一附属医院检验科, 合肥 230002;
3. 安徽中医药大学第一附属医院检验科, 合肥 230006;
4. 安徽医科大学第四附属医院检验科, 合肥 230036;
5. 安徽中医药大学第二附属医院检验科, 合肥 230033;
6. 复旦大学附属华山医院抗生素研究所, 上海 200040
收稿日期: 2023-02-08    接受日期: 2023-04-25
作者简介: 周银娣, 硕士, 副主任检验师. E-mail: zyd040681@126.com.
通信作者(Corresponding author): 胡付品, Tel: 021-52889999, E-mail: hufupin@fudan.edu.cn.
摘要: 目的 研究合肥地区临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带mec基因簇的葡萄球菌盒式染色体（SCCmec）分型及药物敏感性，了解合肥地区MRSA流行株的耐药表型和分型特征。方法 从5所教学医院随机选取2016年1月至2021年12月的264株非重复MRSA菌株，利用头孢西丁纸片扩散法筛选MRSA，采用PCR扩增mecA基因，采用多重PCR进行MRSA的SCCmec分型分析。采用WHONET 5.6软件分析不同SCCmec型别MRSA菌株对抗菌药物的敏感性。结果 264株MRSA菌株中，SCCmec Ⅱ型156株（59.1%），Ⅳa型92株（34.8%），Ⅲ型4株（1.5%），12株（4.5%）未分型。SCCmec Ⅱ型和Ⅳa型MRSA对达托霉素、替加环素、利奈唑胺和万古霉素的敏感率均为100.0%。SCCmec Ⅱ型MRSA对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和庆大霉素的耐药率高于SCCmec Ⅳa型，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。不同分型的MRSA菌株对红霉素、克林霉素、四环素、复方磺胺甲唑和利福平的耐药率差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论 合肥地区MRSA菌株SCCmec分型以Ⅱ型和Ⅳa型为主，不同分型MRSA对某些抗菌药物的耐药性存在差异，动态监测这类细菌的分型和药物敏感性有一定临床意义。
关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌    SCCmec分型    药物敏感性    mecA    葡萄球菌盒式染色体    
SCCmec typing and drug resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Hefei
ZHOU Yindi1, HUANG Ying2, LI Tingting2, ZHANG Changfeng3, CHENG Zuqun4, SHEN Jilu4, LI Xia5, HU Fupin6     
1. Department of Laboratory Medicine, Hefei First People's Hospital, Hefei 230001, Anhui, China;
2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230002, Anhui, China;
3. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230006, Anhui, China;
4. Department of Laboratory Medicine, The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230036, Anhui, China;
5. Department of Laboratory Medicine, The Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230033, Anhui, China;
6. Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
Abstract: Objective To investigate the staphylococcal chromosome cassette mec (SCCmec) typing and drug susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clinically isolated in Hefei, so as to understand the drug resistance phenotypic and genotypic characteristics of MRSA epidemic strains in this region. Methods Totally 264 non-replicated MRSA strains were randomly selected from 5 teaching hospitals from Jan. 2016 to Dec. 2021. MRSA was screened by cefoxitin disk diffusion method, mecA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and SCCmec typing of MRSA was performed by multiplex PCR. Software WHONET 5.6 was used to analyze the antimicrobial susceptibility of MRSA strains of different SCCmec types. Results Among the 264 MRSA strains, 156 strains (59.1%) were SCCmec type Ⅱ, 92 strains (34.8%) were type Ⅳa, 4 strains (1.5%) were type Ⅲ, and 12 strains (4.5%) were untyped. The sensitivities of SCCmec type Ⅱ and type Ⅳa MRSA to daptomycin, tigecycline, linezolid and vancomycin were all 100.0%. The resistance of SCCmec type Ⅱ MRSA to ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin and gentamicin was significantly higher than that of SCCmec type Ⅳa MRSA (all P < 0.05). There was no significant difference in the resistance of different types of MRSA strains to erythromycin, clindamycin, tetracycline, sulfamethoxazole, or rifampicin (all P > 0.05). Conclusion The SCCmec typing of MRSA strains in Hefei is dominated by types Ⅱ and Ⅳa. There is some variation in the resistance of MRSA to certain antimicrobial drugs by genotype, and dynamic monitoring of the typing and drug susceptibility of this group of bacteria is of clinical interest.
Key words: methicillin-resistant Staphylococcus aureus    SCCmec typing    antimicrobial susceptibility    mecA    staphylococcal chromosome cassette    

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）毒力强、传播快、耐药谱广，已成为全球性的医疗难题[1]。葡萄球菌属的细菌对甲氧西林耐药最主要的机制是获得外源性mecA基因，该基因位于携带mec基因簇的葡萄球菌盒式染色体（staphylococcal chromosome cassette mec，SCCmec）遗传元件上，是导致MRSA播散流行的重要因素[2]。了解本地区MRSA临床分离菌株的SCCmec分型，对于预防并控制MRSA的播散流行具有重要意义。本研究对收集自安徽省合肥地区5家教学医院临床分离的MRSA菌株进行了药物敏感性分析和SCCmec分型，现报告如下。

1 材料和方法 1.1 菌株来源

收集2016年1月1日至2021年12月31日安徽省合肥市5所教学医院临床分离的MRSA，随机选取264株（剔除来自同一患者的重复菌株），其中166株来自合肥市第一人民医院，42株来自安徽医科大学第四附属医院，40株来自安徽医科大学第一附属医院，10株来自安徽中医药大学第二附属医院，6株来自安徽中医药大学第一附属医院。随机收集同期临床分离自住院患者的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）52株（剔除来自同一患者的重复菌株），其中32株来自合肥市第一人民医院，8株来自安徽中医药大学第二附属医院，6株来自安徽医科大学第一附属医院，4株来自安徽中医药大学第一附属医院，2株来自安徽医科大学第四附属医院。药敏试验质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌ATCC43300，由安徽医科大学第一附属医院检验科提供。

1.2 主要试剂与仪器

检测mecA基因和SCCmec分型所用的PCR引物参考文献[3-5]进行设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2 000 bp DNA分子量标准和Premix混合物购自宝生物工程（大连）有限公司。

T100TM Thermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司），BG-Power 600琼脂糖凝胶电泳仪（上海贝晶生物技术有限公司），Universal Hood Ⅱ琼脂糖凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），VITEK-2 Compact细菌鉴定和药敏测试仪（法国BIOMERIEUX公司）。

1.3 药敏试验

应用革兰氏阳性菌鉴定板卡GP和革兰氏阳性菌药敏卡GP67分别进行细菌鉴定和药敏试验。采用自动化仪器方法测定金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感性，利用头孢西丁纸片扩散法筛选MRSA菌株，判断标准参考2020年版美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S30文件标准[6]。

1.4 mecA基因检测及细菌DNA制备

挑取血平板培养基上生长了16~18 h的单菌落，放入加有0.5 mL Tris-EDTA缓冲液的微量离心管中，100 ℃煮沸10 min，12 000×g离心5 min，取上清保存备用。按文献[3]描述，用PCR法检测MRSA菌株中的mecA基因，引物序列见表 1，反应体系25 µL：Premix混合物12.5 µL，模板1 µL，正、反向引物各1 µL，加ddH2O补足至25 µL。

表 1 SCCmec分型及mecA基因引物序列

1.5 SCCmec分型

利用多重PCR对所有MRSA菌株进行SCCmec分型，反应体系50 µL：Premix混合物25 μL，模板2 μL，正、反向引物各1 μL，加ddH2O补足至50 µL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃继续延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外凝胶成像仪下成像。SCCmec分型所用引物序列见表 1。

1.6 统计学处理

应用WHONET 5.6软件进行药物敏感性统计分析。计数资料以株数和百分数表示，两组间比较采用χ2检验。检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 金黄色葡萄球菌药敏结果

264株菌株经头孢西丁筛选和mecA基因PCR检测后确认均为MRSA菌株，未发现特殊基因型和特殊表型菌株。MRSA和MSSA对抗菌药物的敏感性对比结果见表 2，MRSA和MSSA对达托霉素、替加环素、利奈唑胺和万古霉素的敏感率均为100.0%；MRSA对红霉素、克林霉素、四环素、莫西沙星和庆大霉素的耐药率高于MSSA，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；MRSA和MSSA对环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲唑和利福平的耐药率差异无统计学意义（P均＞0.05）。

表 2 MRSA和MSSA对抗菌药物的耐药率和敏感率 

2.2 SCCmec分型

分型结果显示，SCCmec Ⅱ型和Ⅳa型为最主要的流行株，分别占59.1%（156/264）和34.8%（92/264），Ⅲ型菌株占1.5%（4/264），未分型菌株占4.5%（12/264）。

2.3 不同SCCmec分型菌株的药敏结果

SCCmecⅡ型和Ⅳa型MRSA菌株药敏结果见表 3，SCCmec Ⅱ型和Ⅳa型菌株对达托霉素、替加环素、利奈唑胺和万古霉素的敏感率均为100.0%；Ⅱ型对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和庆大霉素的耐药率分别为28.2%（44/156）、21.8%（34/156）、21.2%（33/156）和12.8%（20/156），高于Ⅳa型的17.4%（16/92）、9.8%（9/92）、7.6%（7/92）和8.7%（8/92），差异均有统计学意义（P均＜0.05）。SCCmec Ⅱ型和Ⅳa型对红霉素、克林霉素、四环素、复方磺胺甲唑和利福平的耐药率差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表 3。

表 3 SCCmec Ⅱ型和Ⅳa型MRSA菌株药敏试验结果 

2.4 不同SCCmec分型菌株的来源分布特征

从送检标本类型看，SCCmec Ⅱ型MRSA菌株来源排名前3的分别是痰57.1%（89/156）、分泌物28.2%（44/156）和脓肿14.7%（23/156），Ⅳa型排名前3的分别是痰67.4%（62/92）、分泌物30.4%（28/92）和血液6.5%（6/92）。送检科室中，SCCmec Ⅱ型和Ⅳa型送检科室标本量排名前3依次为骨科34.7%（86/248）、神经内科33.1%（82/248）和脑外科32.3%（80/248）。

3 讨论

欧洲的一项耐药菌感染所致死亡的调查发现，在感染所致死亡率排名中，MRSA所致的死亡率高居第2位[7]。虽然2019年CHINET中国细菌耐药监测网数据显示，金黄色葡萄球菌在所有分离菌中分离率仅占9.34%，但其是革兰氏阳性菌中分离率第一的细菌，在革兰氏阳性菌中的分离率为32.2%[8]。因此，对于金黄色葡萄球菌尤其是MRSA感染的预防、治疗和监测是一项长期任务。

MRSA耐药是由于mecA基因编码的青霉素结合蛋白2a对β-内酰胺类抗菌药物亲和力较低，使得大部分该类抗菌药物无法作用于MRSA。本研究收集的264株MRSA的药敏分析结果显示，除β-内酰胺类抗菌药物外，MRSA对红霉素、克林霉素、四环素的耐药率分别为75.4%、49.2%、37.9%，对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素、复方磺胺甲唑和利福平的耐药率分别为28.0%、20.5%、18.9%、13.6%、5.3%和3.4%，均处于较低水平，而文献报道MRSA对四环素类、大环内酯类、喹诺酮类的耐药率在90%以上，尤其是喹诺酮类抗生素[9]。本研究结果中的MRSA耐药率大大低于文献报道，说明不同地区分离的MRSA耐药率存在差异，分析原因可能是地区间抗菌药物使用不同，导致地区间的耐药谱有一定差异。MRSA对达托霉素、替加环素、利奈唑胺、万古霉素的敏感率均为100.0%，未见耐药，但仍需密切监测。

编码金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药的mec基因位于可移动遗传元件SCCmec上，具有以下特点：一是可以运载mec基因在不同菌株之间进行传播；二是可以整合许多耐药基因至金黄色葡萄球菌的基因盒上，使MRSA菌株呈多重耐药。因此，SCCmec分型与流行病学密切相关，且很多文献报道同一型别的MRSA菌株耐药表型在不同地区之间差别较大[10-11]，这也是区别社区获得性感染和医院感染的一个重要指标。文献指出医院获得性MRSA常常携带SCCmec Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型，社区获得性MRSA感染携带的是SCCmec Ⅳ或Ⅴ型基因[12]。本研究收集的合肥地区264株MRSA的SCCmec分型结果和国内其他地区报道的分型不完全相同[13]。

主要型别SCCmec Ⅱ和Ⅳa型的药敏分析结果显示，达托霉素、替加环素、利奈唑胺和万古霉素在不同型别中的敏感率均为100.0%，SCCmec Ⅱ和Ⅳa型对红霉素、克林霉素、四环素、复方磺胺甲唑和利福平的耐药率差异无统计学意义（P均＞0.05），但对喹诺酮类中的环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和氨基糖苷类中的庆大霉素的耐药率差异有统计学意义（P均＜0.05）。关于MRSA的不同SCCmec分型，本研究的结果和其他地区报道的结果[14]不同，与合肥地区2007年报道的结果[15]也不同，文献报道分离的MRSA菌株不同SCCmec分型间药敏结果差异无统计学意义，而本研究中SCCmecⅡ型MRSA菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和庆大霉素的耐药率高于SCCmec Ⅳa型菌株，可能是SCCmec Ⅱ型在MRSA的分离株中数量较多，在临床治疗中受到抗生素治疗压力的菌株也多，且喹诺酮类药物和氨基糖苷类药物本身容易诱导耐药。

随着时间的推移，合肥地区MRSA的SCCmec分型已发生明显变化。本研究中，合肥地区MRSA的SCCmec分型主要以Ⅱ型和Ⅳa型为主，而既往文献报道MRSA的SCCmec分型以Ⅱ型和Ⅲ型为主[15]。

从药敏分析来看，本研究中MRSA对红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星、庆大霉素和利福平的耐药率均低于文献报道[15]，原因可能是随着新型抗菌药物如达托霉素、替加环素、万古霉素和利奈唑胺的研发上市，原有的抗菌药物使用率下降，使得这些抗菌药物的敏感性提高；另一个原因可能与国家规范抗菌药物使用有关。

金黄色葡萄球菌可侵犯人体多种器官和组织，引起化脓性感染，尤其易在人类皮肤软组织中引起化脓性感染。从本研究送检标本科室分布看，送检排名第一的是骨科，多来自术后切口的化脓性感染。

综上所述，不同地区甚至同一地区不同时期MRSA的SCCmec分型和药物敏感性均存在差异，因此动态监测MRSA的SCCmec分型和药敏结果对了解、监控这类菌株的流行病学特征有一定的临床意义。

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