2023, Vol. 44
2. 海军军医大学(第二军医大学)基础医学院, 上海 200433
2. College of Basic Medical Sciences, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
战创伤出血是战伤死亡的主要原因之一。与平时创伤相比，由于战场救治条件简陋，战创伤创面出血一般以止血敷料为主。止血敷料如沸石敷料止血时会有产热反应，易灼伤组织、引发炎症[1]；而明胶海绵敷料具有体内吸收慢、黏附性差、易脱落等缺点，且易引起过敏反应、增加伤口感染率[2]。现有大部分敷料功能单一，并不适合在复杂战场环境下使用。理想的战创伤敷料除应该具有良好的创面保护及控制出血、防治感染、促进创面愈合等性能外，还应具有较好的组织相容性，且可自体吸收、无需更换，以防止伤口发生二次损伤[3]。
白及多糖（Bletilla striata polysaccharide）是临床常用止血中药白及的主要药效成分，具有促进凝血、抑菌、抗氧化、促创面修复等多种药理作用，但由于力学性能和成膜性能较差，一定程度上限制了其在止血敷料方面的应用[4-5]。羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）是壳聚糖衍生物，无毒无害，具有良好的抗菌性、生物降解性、生物相容性和止血作用，广泛应用于各类止血敷料的研发，但其伤口修复能力较为不足[6-7]。本研究将上述2种多糖充分混合进行交联反应，成膜性和黏附性良好，无须添加其他支架材料及黏附成分即可成膜；在此基础上添加具有广谱抗菌作用的黄连素，采用真空冷冻干燥法制备了黄连素-白及多糖-羧甲基壳聚糖复合敷料（berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing，BBCCD），该敷料不仅能有效止血，还兼具抗菌及促愈合功能，适合在战场及野外等环境中使用，可为新型多功能复合敷料的开发提供参考。
1 材料和方法 1.1 仪器与试剂分析天平（美国OHAUS公司）；超纯水机（型号PALL Cascada Ⅰ，美国PALL公司）；真空冷冻干燥机（型号YTLG-10A，上海叶拓科技有限公司）；酶标仪（美国ThermoFisher公司）；显微镜（德国Leica公司）；扫描电子显微镜（英国Oxford公司）；紫外分光光度计（型号UH5300，日本日立仪器有限公司）。医用纱布[海氏海诺倍适威医疗用品（青岛）有限公司]；黄连素（大连美仑生物技术有限公司）；白及多糖（上海融禾医药科技发展有限公司）；CMC（上海麦克林生化科技股份有限公司）；吸收性医用明胶海绵（江西祥恩医疗科技发展有限公司）；壳聚糖敷料（湖北保泰生物科技有限公司）；L929小鼠成纤维细胞（上海雷根生物科技有限公司）；日本同仁化学CCK-8试剂盒（上海复申生物科技有限公司）；大鼠IL-1β（货号ml003057）、TNF-α（货号ml002859）和IL-10（货号ml002813）ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；大肠埃希菌（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923）（上海雷根生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验动物与分组SD大鼠，126只，雌雄各半，6~7周，体重（180±10）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。新西兰兔，3只，雄性，8~9个月，体重（2.8±0.2）kg，购自上海甲干生物科技有限公司，动物生产许可证号为SCXK（沪）2020-0006。选取72只大鼠随机分为医用纱布组、明胶海绵组和BBCCD组，每组24只，用于股静脉、肝脏及断尾止血实验。将剩余54只大鼠随机分为空白组、壳聚糖敷料组和BBCCD组，每组18只，用于皮肤创面修复实验。新西兰兔多次采集血液样本，分为医用纱布组、明胶海绵组和BBCCD组，每组6个血液样本，用于体外凝血实验。
1.3 敷料成分比例的筛选与制备配制5 mg/mL黄连素储备液。在保持混合物总量不变及黄连素的终浓度为2.5 mg/mL的基础上，将5%白及多糖溶液和5% CMC溶液以不同的比例（体积比分别为5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5）混合，置于55 ℃水浴中充分交联30 min，搅拌至无气泡。将交联后的混合胶液倒于24孔板，每孔加液0.6 mL，冷却至室温；将24孔板预冷冻，然后真空冷冻干燥，获得不同处方配比的BBCCD。将以上样品分别取5个批次的BBCCD材料，进行孔隙率、吸水率、透气率测定，并计算平均值，筛选其最佳比例[8]。
1.4 微观结构观察分析在扫描电子显微镜下对BBCCD的结构进行观察。
1.5 敷料中黄连素含量的测定采用紫外分光光度法[9]测定黄连素含量。方法学考察参照2020年版《中华人民共和国药典》[10]规定，对线性、精密度、重复性、稳定性及加样回收率进行考察，最终测定敷料中黄连素含量。
1.6 体外抑菌实验采用抑菌圈法[11-12]观察BBCCD对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果。将上述菌种活化、纯化后，取150 μL菌悬液接种到固体溶菌肉汤培养基中。用无菌镊子分别夹取经裁剪并灭菌后直径为6 mm的BBCCD，均匀贴在含菌平板中。盖上平板盖后将其放入生化培养箱内37 ℃培养24 h，实验重复3次，观察是否有抑菌环生成。
1.7 细胞毒性实验称取适量灭菌后的BBCCD样品，置于DMEM完全培养基中制备成10 mg/mL的BBCCD提取液，浸泡24 h使其完全溶解，再用DMEM完全培养基梯度稀释为不同质量浓度（0.1、1、10、100、1 000 μg/mL）的BBCCD提取液。将培育好的L929小鼠成纤维细胞接种于96孔板，每孔约7 000个细胞，总体积100 μL，每个样本设置4个复孔。随后向96孔板中分别加入不同质量浓度的BBCCD提取液，孵育24 h后，按照试剂盒说明书于每孔细胞加入10 μL CCK-8试剂，在避光条件下孵育30 min，用酶标仪测定450 nm波长处的光密度（D）值[8, 11]。
1.8 体外凝血实验将医用纱布、明胶海绵、BBCCD均剪裁成0.3 cm×0.3 cm大小，各取10 mg分别置于离心管中，其中空白对照组不加任何样品。将上述离心管于37 ℃预热5 min，每管加入新鲜抗凝兔血0.45 mL，随后再快速加入50 μL的0.2 mol/L氯化钙溶液，再次于37 ℃预热5 min，随后分别加入40 mL双蒸水，37 ℃恒温振摇20 min。采用酶标仪测定各样品的上清液在540 nm波长处的D值（D样品），不加样品的空白对照组其D值为D对照。通过公式计算凝血指数：凝血指数（%）＝D样品/D对照×100%。一般认为，凝血指数越小说明该敷料的止血效果越好[8, 11]。
1.9 大鼠股静脉止血实验医用纱布组、明胶海绵组和BBCCD组各取8只大鼠，先将各组敷料进行称重，然后将大鼠麻醉后，予大腿部脱毛消毒处理。用手术刀切开皮肤暴露股静脉，快速划穿股静脉及附近组织，深度为0.5 cm，让其自由流血2 s后分别用不同敷料覆盖伤口，同时在敷料上放置10 g砝码进行按压，并开始记录时间。待50 s时轻轻取下敷料，观察伤口情况，如有继续出血则重复覆盖敷料并按压，随后每隔约15 s观察1次，重复以上操作直至伤口无活动性出血，记录不同敷料的止血时间[13]。
1.10 大鼠肝脏止血实验医用纱布组、明胶海绵组和BBCCD组各取8只大鼠，将大鼠麻醉后固定在手术台上，予腹部脱毛消毒处理。用手术剪在大鼠腹部剑突下剪开长约3 cm的开口，暴露肝脏。取医用纱布垫于肝脏下方，然后用手术刀在肝脏表面做长度为1 cm、深度为0.5 cm的切口，让其自由流血2 s后立即取不同的敷料进行贴敷止血[14]。止血时间的测量方法同1.9节。
1.11 大鼠断尾止血实验医用纱布组、明胶海绵组和BBCCD组各取8只大鼠，将大鼠麻醉后，在距其尾部约2 cm处用手术刀片切断鼠尾，建立大鼠断尾出血模型，立即给予各止血材料并施加固定压力[14]，止血时间的测量方法同1.9节。
1.12 大鼠背部皮肤创面修复实验空白组、壳聚糖敷料组和BBCCD组每组18只大鼠均予以麻醉，然后予背部脱毛消毒处理。用1 cm的皮肤打孔器在大鼠的背部制作4个圆形全皮层切除创面，创面位置以脊柱为对称，左右各2个，分别靠近肩脚骨和尾脚骨，每个创面损伤至肌筋膜深层。用生理盐水冲洗创面后，壳聚糖敷料组和BBCCD组大鼠分别贴敷相应敷料，空白组不予任何处理。每只大鼠单笼饲养，每天更换1次敷料，每组随机选取6个创面，在第1、3、5、7、14天用相机拍摄创面，使用ImageJ Pro软件测量创面面积，并按公式计算愈合率：愈合率（%）＝（S1－Sn）/S1×100%，其中S1为手术结束后当天即第1天测量的创面面积，Sn为手术结束后第n天所测量的创面面积。每组分别于创伤后第1、7、14天各处死4只大鼠，取血清，按照ELISA检测试剂盒说明书方法测定各组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-10水平。每组分别在创伤后第3、7、14、21天各处死1只大鼠，对创面及周围的皮肤和组织进行切片制作及常规H-E染色，观察创面病理学变化，评价敷料的促愈合作用[11-12]。
1.13 统计学处理运用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两样本的比较采用独立样本t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 BBCCD的制备及最佳处方配比筛选BBCCD的吸水率随着CMC的比例增加逐渐上升，在5%白及多糖溶液与5% CMC溶液的配比为1∶3时BBCCD的吸水率达到最高，为（524.78±18.46）%（图 1A）。BBCCD的孔隙率随着CMC的比例增加先升高后降低，当白及多糖与CMC的配比为1∶3时孔隙率最高，为（92.91±4.93）%（图 1B）。各处方配比的BBCCD平均透气率均超过65%，其变化趋势与孔隙率相似（图 1C）。综合评价认为，BBCCD中5%白及多糖溶液与5% CMC溶液的最佳配比为1∶3。
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图 1 不同配比的BBCCD吸水率（A）、孔隙率（B）和透气率（C） Fig 1 Water absorption (A), porosity (B) and air permeability (C) of different BBCCD n＝5, x±s. BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing; BSP: Bletilla striata polysaccharide; CMC: Carboxymethyl chitosan. |
2.2 BBCCD中黄连素含量分析
方法学考察结果显示，检测浓度线性范围为12.92~64.6 μg/mL（R2＝0.999 7），精密度、稳定性、重复性实验的RSD分别为1.3%、1.4%、2.4%，加样回收率为102.61%（RSD为2.77%），表明该方法可靠、稳定。制备的BBCCD中黄连素的含量平均值为（52.39±0.87）mg/g。
2.3 BBCCD的外观及微观结构观察分析按照上述最佳处方配比制备BBCCD，得到高度约为5 mm、直径约15 mm的圆柱形海绵状敷料（图 2）。其外观色泽淡黄，整体均匀、光滑、平整且无裂缝，弹性和柔韧性良好。
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图 2 BBCCD成品外观 Fig 2 View of BBCCD A: An overhead view of BBCCD; B: A flat view of BBCCD. BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
在扫描电子显微镜下，BBCCD材料呈蜂窝多孔洞网络状，并且结构清晰、排列规则、空隙分布致密均匀，单个孔径大小为100~150 μm，同时孔壁光滑均匀，没有出现相分离现象（图 3），说明3种原料之间相容性良好。
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图 3 扫描电子显微镜观察BBCCD微观结构 Fig 3 Microstructure of BBCCD analyzed by scanning electron microscope A: 200×; B: 1 000×; C: 5 000×. BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
2.4 BBCCD的体外抑菌效果分析
BBCCD在金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养皿中逐渐分解吸收，出现抑菌环，直径均＞7 mm（图 4），说明BBCCD具有较好的抑菌作用。
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图 4 BBCCD的抑菌效果 Fig 4 Bacteriostatic effect of BBCCD A: Bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus; B: Bacteriostatic effect on Escherichia coli. BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
2.5 BBCCD的细胞毒性分析
加入不同质量浓度（0.1、1、10、100、1 000 μg/mL）的BBCCD提取液孵育24 h后，L929小鼠成纤维细胞的细胞活力值分别为（114.25±3.09）%、（102.74±6.20）%、（101.52±2.79）%、（95.61±4.14）%、（88.67±1.66）%，均高于85%，且各组之间差异无统计学意义（P＞0.05），表明BBCCD无明显细胞毒性。
2.6 BBCCD的体外凝血效果分析医用纱布组、明胶海绵组及BBCCD组的凝血指数分别为（89.67±4.21）%、（57.83±4.60）%、（39.46±9.31）%。BBCCD组的凝血指数低于医用纱布组和明胶海绵组（P均＜0.01），表明BBCCD的体外凝血效果优于医用纱布和明胶海绵。
2.7 BBCCD的止血时间分析在大鼠股静脉止血实验、肝脏止血实验、断尾止血实验中，BBCCD组的止血时间均短于医用纱布组及明胶海绵组，差异均有统计学意义（P均＜0.01，图 5）。
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图 5 不同敷料对大鼠股静脉（A）、肝脏（B）、断尾（C）创伤的止血效果 Fig 5 Hemostatic effect of different dressings on wounds of femoral vein (A), liver (B) and tail amputation (C) in rats **P < 0.01 vs gauze group; △△P < 0.01 vs GS group. n＝8, x±s. GS: Gelatin sponge; BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
2.8 BBCCD的促愈合效果分析
大鼠背部皮肤创面修复实验中，在皮肤创面修复的第3、5天时，壳聚糖敷料组的伤口愈合率与空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而BBCCD组的伤口愈合率均高于同时期空白组和壳聚糖敷料组（P均＜0.05），说明BBCCD在创面修复前期具有很好的促愈合作用。在皮肤创面修复的第7、14天时，壳聚糖敷料组的伤口愈合率均高于空白组（P均＜0.05），BBCCD组的伤口愈合率均高于壳聚糖敷料和空白组（P均＜0.05），同时BBCCD组的创面愈合平整、瘢痕较小。见图 6。
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图 6 各组大鼠皮肤创面的愈合情况（A）和不同时间点伤口愈合率分析（B） Fig 6 Healing status (A) and wound healing rates (B) at different time points of rats in each group *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs chitosan group. n＝6, x±s. BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
2.9 BBCCD抑制创面炎症因子释放
皮肤创伤后的第1天，各组大鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05）。在皮肤创伤后第7、14天，与空白组和壳聚糖敷料组相比，BBCCD组大鼠的血清IL-1β、TNF-α水平均降低（P＜0.05），IL-10水平均增高（P均＜0.05）。见图 7。结果表明BBCCD能更有效地抑制促炎因子的释放，控制创面的炎症反应。
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图 7 ELISA测定各组大鼠血清IL-1β（A）、TNF-α（B）、IL-10（C）含量 Fig 7 Levels of IL-1β (A), TNF-α (B) and IL-10 (C) in sera of rats in each group determined by ELISA *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs chitosan group. n＝4, x±s. ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay; IL: Interleukin; TNF-α: Tumor necrosis factor α; BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
2.10 BBCCD促愈合的组织病理学分析
在皮肤创面修复的第3天，空白组、壳聚糖敷料组和BBCCD组的创面组织均有较多炎症细胞浸润。在第7天时，各组均可见新增生的成纤维细胞，但空白组仍有较多的中性粒细胞等炎症细胞浸润，炎症细胞浸润程度以BBCCD组、壳聚糖敷料组、空白组的顺序依次升高，此外BBCCD组的成纤维细胞排列较为紧密，与新生毛细血管和胶原形成肉芽组织，创面先开始结痂，并完整覆盖创面。在第14天时，各组创面均有新生的表皮层，BBCCD组只有轻微的炎症细胞浸润，还具有丰富的胶原纤维及新形成的毛囊，并且瘢痕最少，伤口愈合最好；壳聚糖敷料组和空白组仍可见明显的炎症细胞浸润，说明炎症虽局限但未完全消失，其中壳聚糖敷料组的上皮修复程度好于空白组，且新生表皮更为致密，而空白组的真皮层未完全愈合。在第21天时，相较于其他两组，BBCCD组所形成的肉芽组织和毛囊结构基本完整，已基本愈合。结果表明BBCCD可通过减轻伤口的炎症反应、加速创面表皮重建等途径促进伤口愈合。见图 8。
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图 8 各组大鼠皮肤创伤后不同时间点创面组织的H-E染色图像（200×） Fig 8 H-E staining images of wound tissue of rats in each group at different time points after skin trauma (200×) H-E: Hematoxylin-eosin; BBCCD: Berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing. |
3 讨论
随着新材料的发现和新技术的进步，理想敷料向多能化、复合化方向发展。具有止血、抗感染、促愈合、吸收渗液、缓解疼痛、保湿性、透气性、组织相容性、价格低廉等特征的新型多功能敷料是目前研究的趋势。
中医药用于战创伤的治疗有着悠久的历史和丰富的经验，但传统给药剂型通常是膏散外敷或煎汤外洗，使用不便，也根本不能满足现代战争环境下的使用。有收敛止血、消肿生肌功效的中药白及在临床上被广泛用于内外出血和创面修复，具有极强的黏附性，可直接黏附创面使用。白及多糖是白及发挥止血、促创面修复作用的主要活性成分[15]，还具有良好的生物相容性、天然黏附性及吸湿透气的物理性质。本研究选用白及多糖与水溶性的CMC、广谱抗菌的黄连素构建了具有止血、抗感染、促进创面修复等多重功效，兼有生物相容性好、无需胶带固定、无需更换等特点的BBCCD。
本实验所研制的BBCCD具有良好的吸水性、高孔隙率等特性，能够快速充分地吸收血液，从而降低体外凝血指数，为其发挥快速、高效的止血作用奠定了基础。药效学结果证实，BBCCD的体外凝血、在体止血效果均优于医用纱布和明胶海绵；促创面愈合作用优于壳聚糖敷料，且创面愈合更加平整，瘢痕更少。组织病理学结果显示，BBCCD能减轻创面炎症反应、加速表皮重建，其机制可能与下调促炎因子IL-1β、TNF-α的表达及上调抗炎因子IL-10的表达有关。本研究结果还证实，含有黄连素的BBCCD对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有较好抑菌作用。
本实验所研制的BBCCD还具有良好的细胞相容性。其不仅可以自体吸收降解，而且湿润后黏性自动变强，对渗出液较多的创面可以直接贴敷，一方面可以吸收多余的渗液或渗血，另一方面吸收渗液或渗血后黏附性增强，不易脱落，有利于黏附封闭伤口，无须借助其他化学黏附材料及医用绷带固定，降低了发生过敏反应的可能性及因更换敷料带来的创面二次伤害。另外，制备BBCCD所用原料价廉易得，制备工艺简单，适合批量生产。
本研究制备的BBCCD不仅能满足战创伤止血修复保护创面的需求，亦可用于常见的烧伤、烫伤、切割伤、皮肤溃疡等的治疗及术后创面修复，在多功能新型敷料开发和应用上具有广阔的前景，有望成为一种理想的战场等复杂环境下使用的急救创面敷料。
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