2. 郑州大学药学院药物分析教研室, 郑州 450000;
3. 郑州大学附属郑州中心医院神经内科, 郑州 450001
2. Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan, China;
3. Department of Neurology, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan, China
急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)是临床常见的心、脑血管和神经系统疾病,发病率和病死率高,逐渐成为公共卫生面临的主要挑战之一[1]。ACI是脑血流短暂或永久减少的结果,仅涉及脑大动脉的范围[2]。目前,重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)被认为是临床治疗ACI最有效的药物之一,但不良反应较多[3]。我国指南建议ACI患者发病3 h内应尽快静脉给予rt-PA溶栓治疗,发病6 h的ACI患者若不能使用rt-PA,可考虑静脉给予尿激酶[4]。替罗非班(tirofiban)是一种高选择性的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体短效非肽抑制剂,可改善ACI患者的神经功能和体内炎症反应[5],但其作用机制尚未明确。沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1,SIRT1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的Ⅲ类组蛋白脱乙酰酶,在所有细胞类型中都有表达。它以广泛的转录因子为靶标,参与许多生理和病理过程如氧化应激、炎症和凋亡等[6-8]。研究表明,SIRT1通过调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达参与脑缺血再灌注损伤过程[9]。本研究通过构建ACI大鼠模型,观察替罗非班能否通过影响SIRT1/VEGF信号通路对ACI大鼠起保护作用。
1 材料和方法 1.1 实验动物75只体重220~270 g的雄性SD大鼠购自珠海百试通生物科技有限公司[动物生产许可证号为SCXK(粤)2020-0051]。将SD大鼠(4只/笼)在(24±1)℃、光/暗循环(12 h/12 h)条件下饲养,予自由饮食、饮水。本研究通过郑州市第七人民医院动物伦理委员会审批,实验操作均遵循动物实验3R原则。
1.2 试剂与仪器替罗非班(纯度98%)购自上海源叶生物科技有限公司,SIRT1特异性抑制剂EX-527和ECL发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,丙二醛(硫代巴比妥酸法)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)(比色法)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(微板法)检测试剂盒及氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色、H-E染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,兔源SIRT1、VEGF、GAPDH一抗及HRP偶联的二抗、TUNEL检测试剂盒购自英国Abcam公司。BX61型光学显微镜购自日本Olympus公司,Gel Doc XR+凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司。
1.3 实验方法 1.3.1 分组及给药大鼠随机分为假手术组、模型组、替罗非班组、SIRT1抑制剂组、替罗非班+SIRT1抑制剂组,每组15只。除假手术组外,其他4组大鼠均采用大脑中动脉闭塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)诱发ACI。替罗非班组大鼠术前3 d经尾静脉注射60 μg/kg替罗非班[10];SIRT1抑制剂组大鼠术前3 d予5 mg/kg EX-527腹腔注射[11];替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠术前3 d经尾静脉注射60 μg/kg替罗非班的同时予5 mg/kg EX-527腹腔注射;假手术组和模型组大鼠术前3 d分别通过尾静脉和腹腔注射等体积的生理盐水。
1.3.2 ACI模型的建立[12]使用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠后,仰卧位固定,使体核温度保持在37 ℃。将大鼠右侧颈部切开,充分露出右侧颈总动脉,分离并结扎颈外动脉及其分支。经颈动脉残端将3-0尼龙线插入颈内动脉,并延伸至大脑前动脉以阻断大脑中动脉。2 h后取出尼龙线使血流恢复,然后缝合皮肤、消毒,单笼饲养。假手术组除未阻断大脑中动脉外,其余手术操作与其他4组相同。各组大鼠于再灌注24 h后处死并进行取材和指标检测。
1.3.3 神经功能评分使用双盲法进行神经功能评分[13]。评分标准:0分,无神经损伤症状;1分,患侧前爪不能完全伸出;2分,行走时患侧前爪向内旋转;3分,行走时患侧前爪向内倾斜;4分,患侧足不能自主活动,失去意识;5分,患侧肢体完全不能动。得分>3分说明ACI模型建立成功。
1.3.4 TTC染色检测脑梗死体积百分数神经功能评分完成后,每组取5只大鼠脑组织,切成2 mm厚的冠状切片,置于2% TTC溶液中在37 ℃孵育20 min,去除过量的TTC溶液,用4%多聚甲醛溶液固定。拍照并使用ImageJ 1.8.0软件分析脑梗死体积百分数。
1.3.5 血清丙二醛、GSH-Px、SOD的测定收集各组大鼠的外周血2 mL,分别按照试剂盒说明书操作,检测丙二醛、GSH-Px、SOD水平。
1.3.6 H-E染色检测脑组织海马区病理变化每组取5只大鼠脑组织,用4%多聚甲醛溶液固定过夜,经石蜡包埋后,用切片机切成4 μm厚的切片,经H-E染色后进行二甲苯透明、树胶封片。在光学显微镜下观察大鼠脑组织海马区病理变化并拍照。
1.3.7 TUNEL法检测神经元凋亡情况取脑组织海马区切片,用二甲苯脱蜡,乙醇梯度脱水至水化,按照TUNEL检测试剂盒说明书进行染色操作,然后在光学显微镜下随机选择5个视野拍照并进行细胞计数。正常细胞核呈蓝色,棕黄色为阳性细胞,按公式计算细胞凋亡率:细胞凋亡率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.3.8 蛋白质印迹法检测SIRT1/VEGF通路相关蛋白表达每组取5只大鼠脑组织海马区,置于-80 ℃保存。取出后研磨成匀浆,利用预冷的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白质,采用BCA法测定蛋白质浓度,10% SDS-PAGE分离蛋白质后转膜,然后用5%脱脂奶粉溶液孵育2 h以阻断非特异性结合位点。加入SIRT1一抗(稀释比例为1∶1 000)、VEGF一抗(稀释比例为1∶1 000)、GAPDH一抗(稀释比例为1∶3 000),在4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤2次后,加入HRP偶联的二抗在室温下孵育2 h,通过ECL发光试剂盒检测蛋白质显色情况。以GAPDH为内参照,采用凝胶成像系统分析目的蛋白的相对表达量。
1.4 统计学处理应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用SNK-q检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 替罗非班降低大鼠脑梗死体积百分数及神经功能评分TTC染色结果显示,假手术组大鼠脑组织呈均一红色,模型组、替罗非班组、SIRT1抑制剂组、替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠脑组织存在白色梗死区域(图 1A)。由图 1B可见,与假手术组比较,模型组大鼠脑梗死体积百分数升高(P<0.05);与模型组比较,替罗非班组、替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠脑梗死体积百分数降低,SIRT1抑制剂组大鼠脑梗死体积百分数升高(P均<0.05);与替罗非班组比较,替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠脑梗死体积百分数升高(P<0.05)。由图 1C可见,与假手术组相比,模型组大鼠的神经功能评分升高(P<0.05);与模型组比较,替罗非班组、替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠的神经功能评分降低,SIRT1抑制剂组大鼠的神经功能评分升高(P均<0.05);与替罗非班组比较,替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠的神经功能评分升高(P<0.05)。
2.2 替罗非班抑制大鼠氧化应激
与假手术组相比,模型组大鼠血清丙二醛水平升高,GSH-Px、SOD水平降低(P均<0.05);与模型组相比,替罗非班组、替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠血清丙二醛水平降低,GSH-Px、SOD水平升高,而SIRT1抑制剂组大鼠血清丙二醛水平升高,GSH-Px、SOD水平降低(P均<0.05);与替罗非班组比较,替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠血清丙二醛水平升高,GSH-Px、SOD水平降低(P均<0.05)。见图 2。
2.3 替罗非班减轻大鼠脑组织海马区病理损伤程度
H-E染色结果显示,假手术组大鼠脑组织海马区细胞结构完整,分布均匀,未见明显异常;模型组大鼠海马区大部分细胞排列紊乱,细胞间隙增大、细胞核破裂、凝缩变成固缩核,细胞坏死严重;替罗非班组大鼠海马区有少量细胞肿胀及坏死,病理损伤与模型组比较有所缓解;SIRT1抑制剂组大鼠海马区病理损伤程度较模型组明显加重;替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠脑组织海马区细胞排列紊乱,细胞间隙增大,大量细胞坏死,病变程度较替罗非班组严重,但较模型组有所缓解。见图 3。
2.4 替罗非班抑制大鼠脑组织海马区的神经元凋亡
TUNEL染色结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠脑组织海马区神经元凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,替罗非班组、替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠脑组织海马区神经元凋亡率降低,SIRT1抑制剂组大鼠脑组织海马区神经元凋亡率升高(P均<0.05);与替罗非班组比较,替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠脑组织海马区神经元凋亡率升高(P<0.05)。见图 4。
2.5 替罗非班激活SIRT1/VEGF信号通路
蛋白质印迹法检测结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠海马组织中SIRT1、VEGF蛋白表达水平均降低(P均<0.05);与模型组比较,替罗非班组、替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠海马组织中SIRT1、VEGF蛋白表达水平均升高,SIRT1抑制剂组大鼠海马组织中SIRT1、VEGF蛋白表达水平均降低(P均<0.05);与替罗非班组比较,替罗非班+SIRT1抑制剂组大鼠海马组织中SIRT1、VEGF蛋白表达水平均降低(P均<0.05)。见图 5。
3 讨论
大脑是高灌注、高耗氧量、高代谢和低能量储备的重要器官。发生ACI时,血管内血流中断导致缺氧缺血、梗死区缺氧、脑组织能量耗尽,最终导致脑组织坏死或软化。研究表明,MCAO可导致大鼠的行为、神经化学和组织学异常,该模型能够模拟人类ACI的许多特征[14-15]。本研究通过MCAO构建ACI模型,考察替罗非班对ACI的神经保护作用,结果证实替罗非班可抑制氧化应激损伤、神经元凋亡,调节SIRT1、VEGF蛋白表达。
脑缺血是导致神经功能损害的重要原因。神经功能缺损评分是评价脑损伤的常用指标[16]。本研究结果表明,闭塞大鼠大脑中动脉可导致神经功能缺损评分升高,而替罗非班可改善神经功能、减轻脑缺血的发展;ACI模型大鼠出现神经元受损,替罗非班可改善脑损伤、缩小梗死灶。以上结果提示替罗非班能抑制MCAO诱导的神经元损伤,对脑缺血有保护作用。
人体大约20%的氧气供给被脑组织利用。大量证据表明,脑氧化应激在ACI的发病中起着重要作用。SOD是抵御线粒体基质中超氧阴离子的主要防线[17]。GSH-Px是一种细胞内元件,在保护细胞免受氧化损伤方面起着至关重要的作用[18]。丙二醛是脂质过氧化的重要产物,可以间接反映细胞内的脂质过氧化水平[19]。缺血的大脑皮质抗氧化酶活性升高,脂质过氧化产物含量降低,表明脑抗氧化能力提高。本研究结果显示替罗非班提高了SOD和GSH-Px水平、降低了丙二醛含量,与既往研究[14]一致,表明替罗非班能够通过抑制氧化应激减轻脑损伤。
SIRT1参与氧化应激、自噬、神经保护和线粒体功能等多种生物学过程[20]。SIRT1在脑缺血再灌注大鼠脑组织中低表达,激活其表达能改善神经功能障碍[21]。VEGF由大脑中许多神经血管细胞产生和分泌,被认为是缺血后血管生成的关键因子[22]。缺血性脑卒中发生时SIRT1表达降低,下游VEGF表达减少,阻碍脑血管生成,从而使神经功能受损[9]。EX-527是SIRT1的特异性抑制剂[23]。本研究中EX-527抑制ACI大鼠SIRT1表达的同时降低了VEGF蛋白水平,增加了脑组织病理损伤、神经元凋亡,激活了大鼠体内的氧化应激反应;抑制SIRT1减弱了替罗非班对缺血再灌注损伤的保护作用,提示替罗非班通过激活SIRT1/VEGF信号通路对ACI大鼠的神经元损伤起到保护作用。
综上所述,替罗非班可能通过激活SIRT1/VEGF信号通路抑制ACI过程中的氧化应激及神经元损伤,发挥对脑的保护作用。
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