金茵利胆复方制剂金茵利胆胶囊由茵陈、金钱草、郁金和枳壳4种中药饮片加工制成，适用于肝郁气滞及肝胆湿热引起的胁痛、胃痛、食少纳呆等。金茵利胆复方制剂在临床上对非酒精性脂肪肝^[1]、新生儿高胆红素血症^[2]、慢性胆囊炎^[3]、急性梗阻性化脓性胆管炎^[4]等疾病有一定的探索和用药经验。文献中也有对金茵利胆复方制剂的质量控制方法^[5-8]，但并不能全面反映金茵利胆胶囊的质量，其抗炎物质基础的研究更是鲜有报道。谱效关系的研究能够较好地表征中药化学成分与药效的关联，是快速筛选活性化合物的一种研究方法。本实验通过建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的RAW264.7细胞炎症模型，以金茵利胆胶囊为基础筛选出适宜的工作浓度，并建立以金茵利胆胶囊组成药材饮片为基础的均匀设计样品HPLC指纹图谱，考察其体外抗炎活性，采用灰色关联分析方法研究其抗炎谱效关系，探讨金茵利胆胶囊发挥抗炎作用的物质基础，为金茵利胆胶囊全面的质量控制提供科学依据。

1 材料和方法 1.1 药品、细胞与试剂

金茵利胆胶囊（批号20201003，陕西盘龙药业集团股份有限公司）；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中国科学院上海细胞库）；FBS（货号2120140）、RPMI 1640培养基（货号2049224）、PBS（货号UB150259）均购于以色列Biological Industries公司；LPS（货号L6529, 美国Sigma公司）；MTT（货号922N053，上海碧云天生物技术有限公司）；DMSO（货号HG/T5345-2018, 天津市科密欧化学试剂有限公司）；无水对氨基苯磺酸（sulfanilic acid anhydrous，SUL；货号DC5BA0731）、N-（1-萘）乙二胺盐酸盐[N-(1-naphthalene)ethylenediamine hydrochloride，NED；货号DC07BA1002]均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；亚硝酸钠（NaNO₂，天津市科密欧化学试剂有限公司）；小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（货号M211216-004a）、小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒（货号M211216-102a）均购于深圳欣博盛生物科技有限公司；新绿原酸（货号HR20422B1）、隐绿原酸（货号HR20423B1）、绿原酸（货号HCD21133198）、1, 3-二咖啡酰奎宁酸（货号H0071330198）均购于宝鸡辰光生物科技有限公司，纯度均大于98%；对羟基苯乙酮（货号111897-201602）、柚皮苷（批号110722-201815）、新橙皮苷（批号1108091857-201804）均购于中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；甲醇（色谱纯，货号T4AG4H）、乙腈（色谱纯，货号T7SA1H）均购于美国Honeywell公司；磷酸（色谱纯，货号20180404，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器

超净工作台（型号SW-CJ-2FD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；CO₂细胞培养箱（型号311）、多功能酶标仪（型号Multiskan^TM GO）均购于美国ThermoFisher Scientific公司；1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q纯水/超纯水一体机（美国Millipore公司）；万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；VORTEX-5型漩涡混匀仪（海门其林贝尔仪器有限公司）。

1.3 金茵利胆胶囊体外细胞抗炎活性评价 1.3.1 金茵利胆胶囊提取物工作液制备

取金茵利胆胶囊内容物，加入70%甲醇提取，超声50 min，离心取上清，过0.45 μm滤膜，挥干。用DMSO复溶后，加PBS稀释配制成终浓度为20 mg/mL的供试品储备溶液（DMSO含量不超过0.2%），4 ℃保存备用。

1.3.2 金茵利胆胶囊提取物对RAW264.7细胞毒性的影响

将RAW264.7细胞接种至含10% FBS的完全培养基（含青-链霉素双抗）中，于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。传代间隔天数依据细胞成长情况而定。

取对数生长期的RAW264.7细胞，以1.5×10⁵个/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL。培养4 h后，分别加入无血清培养基稀释后的金茵利胆胶囊提取物工作液，工作液浓度分别为0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL，培养箱中培养18 h后，每组设置6个复孔。药物作用结束后，弃去上清，每孔加入5 mg/mL MTT工作液120 μL（无血清培养基与MTT体积比为100∶20）；培养箱中孵育4 h后，弃去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，采用多功能微孔板检测仪在490 nm波长处测定光密度值，条件设置振荡3 min。计算细胞存活率，上述实验重复3次。选取适宜的药物浓度范围进行后续实验。

1.3.3 金茵利胆胶囊提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞活力的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，以2.0×10⁵个/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL，培养4 h后，弃去上清，加入无血清培养基和适宜浓度的金茵利胆胶囊提取物工作液，工作液浓度分别为0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL，药物作用2 h后，除空白对照组外其余均加入10 μg/mL LPS溶液10 μL作用18 h，每组设置3个复孔。作用结束后，弃去上清，加入5 mg/mLMTT工作液120 μL，在培养箱中放置4 h后弃去培养基，加入150 μL DMSO，在酶标仪上振荡3 min后测量各孔在490 nm波长处的光密度值。计算各组细胞的存活率，上述实验重复3次。

1.3.4 金茵利胆胶囊提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，以2.0×10⁵个/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL，4 h后弃去培养基，实验分为空白对照组、模型组、金茵利胆胶囊给药组。空白对照组每孔重新加入100 μL无血清培养基，模型组每孔重新加入90 μL无血清培养基，给药组每孔重新加入80 μL无血清培养基；给药组设多个剂量组，分别给予浓度为0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL金茵利胆胶囊提取物工作液10 μL，培养2 h后，模型组、给药组同时加入10 μL LPS（10 μg/mL）刺激细胞。继续培养18 h后，取上清液，每组设置3个复孔，上述实验重复3次。采用Griess法，依次加入SUL和NED试剂，在546 nm波长处检测细胞培养基的光密度值，优选出NO抑制率最高的金茵利胆胶囊提取物浓度，进行TNF-α和IL-6指标的检测。

1.3.5 金茵利胆胶囊提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液TNF-α和IL-6含量的影响

与1.3.4节步骤相同，分组后给药组每孔重新加入80 μL无血清培养基，给予浓度为1.00 mg/mL金茵利胆胶囊提取物工作液10 μL，后续步骤同1.3.4节。

1.4 金茵利胆胶囊超高效液相色谱- 串联质谱（ultra-high performance liquid chromatographytandem quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）化学成分表征 1.4.1 分析条件

质谱条件为电喷雾离子源；正、负离子模式采集数据，源喷射电压分别为5 500、－4 500 V，裂解电压±80 V，碰撞能量±10 eV，雾化气和辅助气、辅助加热气均为氮气、344.74 kPa（50 psi），气帘气241.32 kPa（35 psi），雾化温度500 ℃，采用信息依赖采集、动态背景扣除和高灵敏度模式；母离子（飞行时间质谱）、子离子的扫描范围均为m/z 100~2 000。

色谱条件为ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），使用0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱：0~5 min，2%~5% B；6~10 min，5%~11% B；11~12 min，11%~11.5% B；13~16 min，11.5%~15% B；17~24 min，15%~23% B；25~36 min，23%~40% B；37~44 min，40%~55% B；45~46 min，55%~70% B；47~53 min，70%~80% B；54~55 min，80%~2% B；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量3 μL。

1.4.2 供试品溶液制备

称取金茵利胆胶囊内容物约0.3 g，加入70% 甲醇9 mL，密塞，称重，超声处理30 min（功率300 W，频率40 kHz，超声温度45 ℃），放冷后，70% 甲醇补足至9 mL，摇匀。离心取上清，过滤，取续滤液，过0.22 μm滤膜，得供试品溶液。将供试品溶液稀释，过0.22 μm滤膜，质谱进样。

1.4.3 谱库检索

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS/MS）检测金茵利胆胶囊的化学成分，经过PeakView 2.2软件中AB SCIEX master view 1.1.0.0中药成分数据库（TCM library 1.0，包含1 013种中药成分）谱库对化合物进行匹配分析，选取相对峰丰度5 000以上、综合评分大于80的化学成分，结合文献筛选化学成分。

1.5 谱效关系分析 1.5.1 均匀设计样品供试品溶液的制备

按金茵利胆胶囊处方工艺^[8]提取处方中各药材饮片，对应合并其3次滤液，将合并后滤液进行喷雾干燥，获得4种单味药材饮片的干燥粉末。采用均匀设计法对其干燥粉末进行4因素6水平均匀设计，得到均匀设计的样品N1~N6，样品N0为原处方配比组合，共计7个样品配比组（表 1）。根据均匀设计表的配比，加入一定量的70% 甲醇提取粉末，超声50 min，离心取上清，过0.45 μm滤膜，挥干。加入DMSO复溶，用PBS稀释配制成终浓度为20 mg/mL供试品储备溶液（DMSO含量不超过0.2%），4 ℃保存备用。将终浓度为20 mg/mL供试品储备溶液（DMSO含量不超过0.2%）稀释成0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL 5个浓度，过无菌滤膜，作为细胞给药的样品。

1.5.2 色谱条件

InertSustain C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为0.05% 磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0~8 min，5%~12% B；9~14 min，12%~15% B；15~26 min，15%~27% B；27~30 min，27%~28% B；31~41 min，28%~40% B；42~54 min，40%~80% B；55 min，80%~5% B；56~65 min，5% B，后运行5 min；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为282 nm；进样量5 μL。

1.5.3 溶液的制备

（1）对照品溶液：精密称取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、1, 3-二咖啡酰奎宁酸、对羟基苯乙酮、柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，分别加甲醇配成单一对照品储备溶液。吸取各对照品储备液适量，配成稀释后质量浓度分别为0.3、0.3、0.167、0.1、0.133、0.6、0.3 mg/mL的混合对照品储备溶液，4 ℃保存，备用。

（2）供试品溶液：取金茵利胆胶囊内容物约0.3 g，精密加入70% 甲醇9 mL，密塞，称重，超声处理30 min（功率300 W，频率40 kHz，超声温度45 ℃），放冷后，70% 甲醇补足至9 mL，摇匀。1 000×g离心2 min，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.5.4 均匀设计样品对RAW264.7细胞毒性的影响

实验步骤同1.3.2节。

1.5.5 均匀设计样品对LPS诱导的RAW264.7细胞活力的影响

实验步骤同1.3.3节。

1.5.6 均匀设计样品对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液NO、TNF-α和IL-6含量的影响

NO的检测方法同1.3.4节，TNF-α和IL-6的检测方法同1.3.5节。

1.6 抗炎指标数据转化^[9]与灰色关联分析

NO抑制率（%）＝[（模型组NO含量－空白对照组NO含量）/模型组NO含量]×100%；TNF-α抑制率（%）＝[（模型组TNF-α含量－空白对照组TNF-α含量）/模型组TNF-α含量]×100%；IL-6抑制率（%）＝[（模型组IL-6含量－空白对照组IL-6含量）/模型组IL-6含量]×100%。

采用均值化法将均匀设计样品N0~N6的抗炎指标的数据转化结果与其共有峰峰面积进行归一化处理^[9-13]，以NO、TNF-α和IL-6抑制率作为参考序列Y(k)，抑制率＜0者以0计算，23个共有峰峰面积作为比较序列Xi（i表示共有峰编号1、2、3、…、23），各比较序列与参考序列的关联系数Ai(k)可由下列公式计算：Ai(k)＝[Δi(k)_min+ρ×Δi(k)_max]/[Δi(k)+ρ×Δi(k)_max]，其中Δi(k)＝Y(k)－Xi，分辨系数ρ＝0.5。

关联系数Ai(k)≥0.9表示有显著影响，0.9＞Ai(k)≥0.8表示有比较大的影响，0.8＞Ai(k)≥0.7表示有较为明显的影响，0.7＞Ai(k)≥0.6表示影响较小，Ai(k)＜0.6表示没有影响^[14]。

1.7 统计学处理

应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。所有数据均以x±s表示，比较采用单因素方差分析。检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 金茵利胆胶囊体外细胞抗炎活性评价 2.1.1 金茵利胆胶囊提取物影响RAW264.7细胞的存活率

金茵利胆胶囊提取物工作液浓度分别为0（对照组）、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL时RAW264.7细胞存活率分别为（100.00±17.22）%、（117.42±16.71）%、（115.61±20.89）%、（132.63±16.87）%、（140.56±15.95）%、（128.18±17.70）%，其中0.50 mg/mL浓度下的细胞存活率与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.1.2 金茵利胆胶囊提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞具有保护作用

与空白对照组[细胞存活率为（100.00±4.95）%]比较，1 μg/mL的LPS（模型组）对RAW264.7细胞的活力造成了一定的损伤[细胞存活率为（88.74±2.18）%，P＜0.01]。与模型组相比，0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL金茵利胆胶囊提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞均有一定的保护作用，细胞存活率分别为（92.77±3.88）%（P＞0.05）、（96.01±5.73）%（P＜0.01）、（100.42±5.10）%（P＜0.01）、（98.93±4.31）%（P＜0.01）。

2.1.3 金茵利胆胶囊提取物能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO

与空白对照组[（1.13±0.02）μmol/L]相比，模型组RAW264.7细胞分泌NO增多[（35.64±0.01）μmol/L，P＜0.01]。与模型组相比，0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL金茵利胆胶囊提取物能够一定程度抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO，NO含量分别为（34.82±0.01）μmol/L（P＞0.05）、（30.21±0.04）μmol/L（P＜0.01）、（29.03±0.04）μmol/L（P＜0.01）、（19.39±0.02）μmol/L（P＜0.01）。

2.1.4 金茵利胆胶囊提取物能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6

结果如表 2所示，给药组的TNF-α和IL-6水平均低于模型组，表明1.00 mg/mL金茵利胆胶囊提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6有抑制作用（P均＜0.01）。

2.2 金茵利胆胶囊UHPLC-MS/MS化学成分表征

经谱库检索共筛选得到24个化学成分（表 3）。

2.3 谱效关系 2.3.1 均匀设计样品HPLC色谱图

将7个样品（N0~N6）的aia格式文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）》，得到HPLC叠加色谱图，与金茵利胆胶囊的色谱峰保留时间比对并标记N0~N6样品中的共有峰，见图 1。

2.3.2 金茵利胆胶囊共有峰的指认

根据UHPLC-MS/MS成分鉴定结果以及色谱峰保留时间稳定、峰面积相对较高和检测率达100%的原则，与混合对照品谱图对比并指认丰度较高的7个共有峰分别为新绿原酸（9号峰）、绿原酸（13号峰）、隐绿原酸（14号峰）、1, 3-二咖啡酰奎宁酸（16号峰）、对羟基苯乙酮（17号峰）、柚皮苷（21号峰）、新橙皮苷（23号峰）。混合对照品和金茵利胆胶囊样品的HPLC图见图 2。

2.3.3 均匀设计样品对RAW264.7细胞无毒性作用

结果如表 4所示，在0.05~1.00 mg/mL范围内均匀设计样品N0~N6对RAW264.7细胞无毒性作用。

2.3.4 均匀设计样品能促进LPS诱导的RAW264.7细胞增殖

空白对照组、模型组、均匀设计样品N0~N6组RAW264.7的细胞存活率分别为（100.00±8.15）%、（93.12±3.02）%、（116.61±7.64）%、（114.30±13.22）%、（128.25±17.80）%、（126.40±16.45）%、（127.86±13.44）%、（119.57±9.19）%、（124.04±4.40）%，表明均匀设计样品对LPS诱导的RAW264.7细胞有一定的促增殖作用。

2.3.5 均匀设计样品能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-6

结果如表 5所示，均匀设计样品N0~N5对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液NO、TNF-α和IL-6含量增加均有一定的抑制作用。

2.3.6 抗炎指标的数据转化

将RAW264.7细胞分泌的NO、TNF-α、IL-6含量按1.6节公式进行抗炎指标数据转化，抑制率结果见表 6。

2.3.7 抗炎指标数据的灰色关联分析

灰色关联分析结果（表 7~表 9）表明，23个共有峰与炎症指标均有一定的相关性，共有峰对药物的抗炎活性有一定的影响。其中，共有峰21（柚皮苷）、峰23（新橙皮苷）与NO、TNF-α、IL-6 3个炎症指标的关联度均＞0.74，对药物的抗炎活性有明显的影响。

3 讨论

小鼠巨噬细胞RAWA264.7是体外研究炎症常用的细胞株系，LPS能够刺激巨噬细胞合成、释放炎症因子，进而产生炎症反应^[15]。本研究通过建立LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型来评价金茵利胆胶囊体外抗炎活性。首先通过测定细胞活力和细胞上清液中NO的浓度，筛选出金茵利胆胶囊体外抗炎最佳浓度，后续选用此浓度进行细胞上清液中TNF-α和IL-6含量测定评价金茵利胆胶囊的抗炎活性水平。结果表明，金茵利胆胶囊对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中NO、TNF-α和IL-6的含量均有一定的抑制作用。

目前，金茵利胆胶囊现行企业标准^[8]“含量测定”项下，规定以枳壳中柚皮苷作为检测指标进行含量测定。单一成分的含量测定不能全面评价金茵利胆胶囊的质量。基于指纹图谱的谱效学研究将中药化学成分的量和其药效结合起来，能够较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。灰色关联分析对样本量大小没有严格要求，分析时，可在不完全的信息中确定各种比较因素与参考因素之间的关联程度，且能体现中药指纹图谱“整体性”“模糊性”的特点^[16]。

金茵利胆胶囊提取制备工艺已经成熟，不同批次间金茵利胆胶囊质量差异很小，因此本实验选取以金茵利胆胶囊为基础的均匀设计样品进行指纹图谱的研究。本课题组前期通过对色谱条件、提取条件以及方法学考察建立了金茵利胆胶囊检测方法，并应用于均匀设计样品的指纹图谱研究中。均匀设计样品对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的药效结果表明，均匀设计样品N0~N5都对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中NO、TNF-α和IL-6的含量增加有一定的抑制作用。

为了进一步研讨均匀设计样品共有峰与其药效的关联关系，本研究进行了灰色关联度分析，其中峰8、峰12、峰22所代表的成分与抗炎指标NO和IL-6的关联度较大（均＞0.78），峰23（新橙皮苷）、峰19、峰18、峰21（柚皮苷）与抗炎指标NO和TNF-α的关联度较大（均＞0.74）。由此表明，峰8、峰12、峰22、峰23、峰19、峰18、峰21所代表的化学成分与金茵利胆胶囊发挥抗炎作用有较强的关联度。由此表明，这些共有峰所代表的化学成分可能是金茵利胆胶囊发挥抗炎药效贡献较大的药效成分群，其他未明确的成分后续将借助高分辨的液质联用进行鉴定，以研究其是否能够作为金茵利胆胶囊质量控制的评价指标之一。本研究在体外进行了细胞模型的抗炎活性评价，不足之处是关联性较强的部分化合物未鉴定出来，均匀设计的样品也未在动物体内进行验证，这些将在后续的研究中继续完善。

综上所述，本研究通过以金茵利胆胶囊为基础的均匀设计样品HPLC指纹图谱并结合灰色关联度分析的统计方法，将其“谱”与“效”进行关联分析，可以为金茵利胆胶囊抗炎活性成分的筛选与确 定及其质量控制与评价提供参考。