2023, Vol. 44
2. 中国中医科学院研究生院, 北京 100700;
3. 陕西盘龙药业集团股份有限公司, 商洛 726000
2. Graduate School, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China;
3. Shaanxi Panlong Pharmaceutical Group Co., Ltd, Shangluo 726000, Shaanxi, China
肝纤维化是由免疫功能紊乱、病毒感染、长期酗酒、胆汁淤积、自身免疫病等多种因素引起肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积的病理过程[1-2]。随着中医药治疗的发展，中药治疗肝纤维化获得了明确的临床疗效[3]。金茵利胆胶囊(Jinyin Lidan capsule，JYLD)由茵陈、郁金、金钱草、枳壳4味中药组成，具有清热利湿、舒肝利胆之功效，适用于肝郁气滞、肝胆湿热引起的胁痛、胃痛、食少纳呆等症状[4]，临床上可用于胆囊炎和非酒精性脂肪肝[5]的治疗。本课题组的前期研究结果表明，JYLD中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、1, 3-二咖啡酰奎宁酸、对羟基苯乙酮、柚皮苷和新橙皮苷等多个成分具有抗炎[6]和抗氧化[7]等药理活性，而炎症反应和氧化应激是肝纤维化发生的重要机制，因此推测JYLD对肝纤维化具有治疗作用。本实验拟通过四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导肝纤维化大鼠模型，研究JYLD对大鼠肝纤维化的保护作用，为扩展JYLD的临床应用提供依据。
1 材料和方法 1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠40只，体重(200±20)g，购于成都达硕实验动物有限公司[实验动物生产许可证号为SCXK(川)2020-030]，饲养于陕西省中药资源产业化协同创新中心SPF级动物实验室[实验动物使用许可证号为SYXK(陕) 2022-008]，饲养温度20~24 ℃，相对湿度55%~65%，饲养期间提供充足的洁净水和标准饲料。本研究获得陕西中医药大学实验动物伦理委员会审批(SUCMDL20220612001)，严格按照动物伦理要求执行，动物实验操作程序均符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。
1.2 药品、试剂与仪器JYLD(批号20201101，陕西盘龙药业集团股份有限公司)；水飞蓟素(批号C16D10H05984，上海源叶生物科技有限公司)；橄榄油(山东鲁花集团)；CCl4(货号20210102，天津市天力化学试剂有限公司)；丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)检测试剂(货号140120014)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)检测试剂(货号140220008)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)检测试剂(货号143222001)均购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；4%多聚甲醛固定液(货号12J28C68，武汉博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(货号141720006，南京建成生物工程研究所)；TNF-α ELISA检测试剂盒(货号R210708-102a)、IL-1β ELISA检测试剂盒(货号R210730-007a)、IL-6 ELISA检测试剂盒(货号R210723-003a)均购于深圳欣博盛生物科技有限公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(货号GB13044，武汉赛维尔生物科技有限公司)；无菌无酶水(货号NR002)购于陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司；TRIzol试剂(货号BCCF8996，美国Sigma公司)；PrimeScriptTM反转录试剂盒(货号RR036B)、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(货号RR820A)均购于日本Takara公司。其余试剂均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司。
Micro17R型微量低温冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)；UXFSTPRP-64型高速离心研磨机(德国Eppendorf公司)；BS-330E型全自动血清生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司)；KQ-300DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA225D型十万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；qTOWER2.2型实时荧光定量PCR仪(德国Analytik Jena公司)。
1.3 造模、分组及给药40只SD大鼠随机分为5组：空白对照组、模型组、水飞蓟素(阳性对照药)组、JYLD低剂量组和JYLD高剂量组，每组8只。除空白对照组外，其余各组大鼠给予腹腔注射40% CCl4(橄榄油配制，灌胃体积为2 mL/kg)，每周2次，连续6周。选模期间水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组分别给予水飞蓟素(0.1 g/kg)、JYLD(低剂量0.6 g/kg，高剂量1.2 g/kg)灌胃，空白对照组和模型组给予等量的橄榄油溶液灌胃，每天1次，连续6周。末次给药16 h后，采用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(10 mL/kg)，腹主动脉采血，静置2 h后，4 ℃、1 360×g离心10 min，分离并分装血清，一部分血清用于生化指标测定，一部分用于相关指标的检测，剩余血清于－80 ℃冻存。采集血样后处死大鼠，取出肝脏、脾脏，生理盐水清洗后用滤纸吸干，拍照并称重，记录肝脏和脾脏湿重。计算脏器指数(脏器质量/体重×100%)。用4%多聚甲醛固定液固定肝脏左叶中部组织，剩余肝组织置于－80 ℃冰箱保存。
1.4 血清中ALT、AST和TBA含量的测定通过全自动生化仪检测大鼠血清中ALT、AST和TBA的含量。
1.5 肝组织病理学观察将大鼠肝脏置于4%多聚甲醛固定液中固定，肝脏组织经石蜡包埋并切片，厚5 μm，分别进行H-E染色和Masson染色，显微镜下观察肝组织纤维化程度。Masson染色阳性染色为蓝色，用ImageJ软件对胶原纤维进行定量分析。
1.6 血清SOD活性测定取一部分大鼠血清解冻至室温后，严格按照SOD检测试剂盒说明书操作，测定SOD活性。
1.7 ELISA法检测血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平取一部分大鼠血清解冻至室温后，按照ELISA检测试剂盒说明书测定大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。
1.8 免疫组织化学染色检测肝组织中α-SMA的表达对大鼠肝脏石蜡切片进行脱蜡、水化，枸橼酸缓冲液煮沸，用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，室温条件下3%牛血清白蛋白溶液封闭1 h；于4 ℃冰箱孵育α-SMA抗体(稀释比例1∶1 000)，过夜；室温摇床上孵育二抗1 h(稀释比例1∶200)；滴加显色液，反应一定时间后洗涤；使用苏木精染液复染；脱水封片。阳性表达呈棕色，用ImageJ软件进行阳性表达面积定量分析。
1.9 qPCR检测取大鼠肝脏特定部分，用生理盐水洗去血迹，滤纸吸干，在相同部位精确称取50 mg，采用TRIzol法提取肝组织总RNA，用NanoDrop One超微量分光光度计(型号：ND-ONE-W)检测总RNA的浓度及纯度。用PrimeScriptTM反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒和实时荧光定量PCR仪进行qPCR扩增。反应体系总体积25 μL：cDNA 2 μL，正、反向引物各1 μL，TB Green Premix Ex Taq 12.5 μL，灭菌水8.5 μL。qPCR扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。以β-肌动蛋白作为内参，采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表 1。
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表 1 引物序列(5' -3' ) Tab 1 Primer sequences (5' -3' ) |
1.10 统计学处理
应用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。符合正态性分布且方差齐的计量资料以x±s表示，两组间比较使用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脾指数的影响如图 1所示，与空白对照组相比，模型组大鼠的肝、脾脏指数均升高(P均＜0.01)；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组的肝脏指数均降低(P均＜0.01)，脾脏指数未见明显改变。
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图 1 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏指数和脾脏指数的影响 Fig 1 Effects of JYLD on liver index and spleen index of CCl4-induced hepatic fibrosis rats **P < 0.01 vs blank group; △△P < 0.01 vs model group. n＝8, x±s. JYLD: Jinyin Lidan capsule; CCl4: Carbon tetrachloride; L: Low-dose; H: High-dose. |
2.2 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清生化指标的影响
如图 2所示，与空白对照组相比，模型组大鼠血清中的ALT、AST和TBA含量均升高(P均＜0.01)。与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组大鼠血清中的ALT、AST和TBA含量均降低(P＜0.05，P＜0.01)。
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图 2 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清中ALT、AST和TBA含量的影响 Fig 2 Effects of JYLD on serum contents of ALT, AST, and TBA in CCl4-induced hepatic fibrosis rats **P < 0.01 vs blank group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group. n＝8, x± . JYLD: Jinyin Lidan capsule; CCl4: Carbon tetrachloride; ALT: Alanine transaminase; AST: Aspartate transaminase; TBA: Total bile acid; L: Low-dose; H: High-dose. |
2.3 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响
H-E染色结果(图 3)显示，空白对照组大鼠肝细胞由中央静脉向四周呈放射状排列，无明显病理变化；与空白对照组相比，模型组大鼠肝脏存在大范围的脂肪变性现象，肝小叶内炎症细胞增多，汇管区发生炎症细胞浸润，成纤维细胞增多；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组大鼠的肝纤维化程度减轻，未出现肝小叶结构紊乱现象。
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图 3 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响(200×) Fig 3 Effect of JYLD on pathological changes of liver tissue in CCl4-induced hepatic fibrosis rats (200×) Yellow arrows indicate inflammatory cells, blue arrow indicates steotosis, and green arrows indicate collagen deposition. JYLD: Jinyin Lidan capsule; CCl4: Carbon tetrachloride; L: Low-dose; H: High-dose; H-E: Hematoxylin-eosin. |
Masson染色结果(图 3)显示，空白对照组大鼠的肝脏结构正常，切片细胞结构完整，有少量的胶原纤维产生，胶原纤维面积百分比为(25.84±4.64)%；与空白对照组相比，模型组大鼠染色切片中可见汇管区纤维形成，胶原纤维面积百分比增加至(71.07±7.06)%(P＜0.01)，纤维间隔伴小叶结构紊乱；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组大鼠的肝组织中炎症细胞浸润减轻，脂肪变性现象减少，胶原纤维面积百分比分别减少至(38.95±10.27)%、(46.58±10.92)%和(43.44±4.96)%(P均＜0.01)。
2.4 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清氧化和炎症指标的影响如图 4所示，与空白对照组相比，模型组大鼠血清中SOD活性降低(P＜0.01)；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组大鼠血清SOD活性均升高(P均＜0.01)。与空白对照组相比，模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P＜0.05，P＜0.01)；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组大鼠血清中IL-1β水平均降低(P＜0.05，P＜0.01)，JYLD低、高剂量组IL-6和TNF-α水平均降低(P＜0.05，P＜0.01)。
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图 4 YLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清中SOD、IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响 Fig 4 Effects of JYLD on serum levels of SOD, IL-6, IL-1β, and TNF-α in CCl4-induced hepatic fibrosis rats *P < 0.05, **P < 0.01 vs blank group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group. n＝8, x±s. JYLD: Jinyin Lidan capsule; CCl4: Carbon tetrachloride; SOD: Superoxide dismutase; IL: Interleukin; TNF-α: Tumor necrosis factor α; L: Low-dose; H: High-dose. |
2.5 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA表达的影响
免疫组织化学染色结果(图 5)显示，空白对照组大鼠肝组织中见少量棕黄色染色，α-SMA阳性表达面积比例为(0.56±0.37)%；与空白对照组相比，模型组大鼠肝组织中棕黄色染色增多，α-SMA阳性表达面积比例增加至(12.46±3.99)%(P＜0.01)；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组棕黄色染色减少，α-SMA的阳性表达面积比例分别减少至(5.66±2.72)%、(3.92±1.71)%和(3.22±2.58)%(P＜0.05，P＜0.01)。
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图 5 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA表达的影响(200×) Fig 5 Effect of JYLD on α-SMA expression in liver tissue of CCl4-induced hepatic fibrosis rats (200×) Immunohistochemical staining. JYLD: Jinyin Lidan capsule; CCl4: Carbon tetrachloride; α-SMA: α-smooth muscle actin; L: Low-dose; H: High-dose. |
2.6 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏相关基因表达的影响
如图 6所示，与空白对照组相比，模型组大鼠肝组织中胶原蛋白(collagen，Col)Ⅰ、ColⅢ、ColⅣ、NF-κB、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1、TGF-β1 mRNA的相对表达量均升高(P＜0.05，P＜0.01)，MMP-2/TIMP-1比值增加(P＜0.01)；与模型组相比，水飞蓟素组和JYLD低、高剂量组大鼠肝组织中各相关基因mRNA的相对表达量均降低(P＜0.05，P＜0.01)，JYLD低、高剂量组MMP-2/TIMP-1比值降低(P＜0.05，P＜0.01)。
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图 6 JYLD对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏相关基因表达的影响 Fig 6 Effects of JYLD on the expression of liver relative genes in CCl4-induced hepatic fibrosis rats *P < 0.05, **P < 0.01 vs blank group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs model group. n＝8, x±s. JYLD: Jinyin Lidan capsule; CCl4: Carbon tetrachloride; L: Low-dose; H: High-dose; Col: Collagen; NF-κB: Nuclear factor κB; TGF-β1: Transforming growth factor β1; MMP-2: Matrix metalloproteinase 2; TIMP-1: Tissue inhibitor of metalloproteinase 1. |
3 讨论
肝纤维化是多种损伤因子持续作用下的创面愈合反应，以ECM沉积及瘢痕形成为特征[8-9]，是严重危害人类健康的世界性问题[10-11]。连续给予CCl4可使肝细胞变性、坏死、产生炎症反应，在动物实验中容易复制，重复性好[12]。本实验通过CCl4诱导成功建立了大鼠肝纤维化模型，发现JYLD能降低肝纤维化大鼠血清中ALT、AST和TBA含量，减轻肝细胞水肿、坏死和炎症细胞浸润，说明JYLD对肝纤维化大鼠具有保护作用。
炎症反应和氧化应激参与大多数肝脏疾病的发病过程，长期的炎症是肝纤维化形成和发展的重要驱动因素，并且介导肝纤维化的发生与发展[13-14]。本实验发现CCl4诱导能引起血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高且SOD含量下降，JYLD低、高剂量组中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平下降且SOD的含量升高，与JYLD体外抗炎、抗氧化结果相符，说明JYLD可能通过抗炎和抗氧化作用抑制肝纤维化形成和发展。NF-κB/TGF-β1信号通路是介导肝纤维化发展过程中肝脏炎症的重要组成部分[15-17]，激活的炎症因子可分泌TGF-β1，且TGF-β1又受NF-κB调控[18]，NF-κB被激活后迅速移位进入细胞核[19-20]，调控基因的表达，并诱导炎症因子的分泌，参与机体对炎症及免疫反应的调控[21]。本研究结果显示，模型组的NF-κB、TGF-β1 mRNA的相对表达量升高，JYLD低、高剂量组中NF-κB、TGF-β1 mRNA的相对表达量下降，说明抑制NF-κB/TGF-β1信号通路可能是JYLD抗肝纤维化的作用机制之一。
α-SMA与肝纤维化的形成密切相关，是肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化的标志，HSC活化后合成大量ECM沉积于肝脏，导致肝纤维化[22-23]。本研究结果显示，模型大鼠肝脏组织中α-SMA阳性表达面积比例增加，JYLD可抑制肝纤维化大鼠肝脏组织中α-SMA的表达，从而减少ECM的合成，抑制肝纤维化。HSC活化可促进肝细胞合成多种胶原蛋白，而在肝纤维化时Col Ⅰ、Col Ⅲ和Col Ⅳ合成增加[24-26]。由qPCR结果可知，模型组Col Ⅰ、Col Ⅲ和Col ⅣmRNA的相对表达量升高，促进Col Ⅰ、Col Ⅲ和Col Ⅳ的合成，抑制蛋白酶水解酶的合成及分泌，导致ECM沉积增加而降解减少[27]。JYLD低、高剂量组中Col Ⅰ、Col Ⅲ和Col ⅣmRNA的相对表达量降低，说明JYLD可以减少肝细胞中胶原蛋白合成。
MMP和TIMP参与了ECM的合成[28]，两者之间的平衡与肝纤维化的病理生理学过程和进展有关[29]。MMP-2是一种明胶酶，具有降解ECM几乎所有成分的能力，由活化的HSC产生，并受TIMP-1调控[30-31]。TIMP-1是ECM改变组织重塑和细胞行为的重要调节因子[32]，在肝纤维化的调控中起着重要作用，特别是抑制MMP-2和维护ECM的来源[33-34]。TIMP-1主要通过与MMP-2结合抑制胶原酶的活性，也能够阻止活化的HSC中前体MMP-2的激活。MMP-2/TIMP-1比值是维持ECM稳定和完整的因素，过量表达的TIMP-1经CCl4处理后表现出更加严重的纤维化症状[35-37]。本研究结果显示，与空白对照组相比，模型组MMP-2/TIMP-1比值增加，说明两者表达失衡，TIMP-1失去对MMP-2活性的抑制，ECM沉积加重，导致肝纤维化形成；与模型组相比，JYLD低、高剂量组MMP-2/TIMP-1比值降低，说明JYLD可以通过影响肝组织中MMP-2、TIMP-1的表达来减缓肝纤维化的进程，从而发挥抗肝纤维化的作用。
综上所述，JYLD可以降低大鼠肝脏指数，改善肝组织损伤和纤维化，降低血清肝功能指标含量、炎症因子水平，提高抗氧化能力，表明JYLD具有保护肝纤维化的作用。进一步的机制研究发现，JYLD可降低肝脏组织中α-SMA的表达，下调大鼠肝组织中Col Ⅰ、Col Ⅲ、Col Ⅳ、NF-κB、MMP-2、TIMP-1、TGF-β1 mRNA的表达，降低MMP-2/TIMP-1比值，表明JYLD保护肝纤维化的作用可能与抑制ECM沉积和HSC活化有关。
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