海军军医大学学报  2023, Vol. 44 Issue (11): 1373-1377   PDF    
引用本文
姚俊成, 刘思巧, 颜天, 王磊, 李玉涛, 杨祺, 窦科. 淫羊藿苷对血管性勃起功能障碍大鼠的治疗效果及机制初探[J]. 海军军医大学学报, 2023, 44(11): 1373-1377  
YAO Juncheng, LIU Siqiao, YAN Tian, WANG Lei, LI Yutao, YANG Qi, DOU Ke. Effect and mechanism of icariin on vascular erectile dysfunction in rats[J]. Academic Journal of Naval Medical University, 2023, 44(11): 1373-1377 (in Chinese with English abstract)  
淫羊藿苷对血管性勃起功能障碍大鼠的治疗效果及机制初探
姚俊成, 刘思巧, 颜天, 王磊, 李玉涛, 杨祺, 窦科     
四川省医学科学院·四川省人民医院辅助生殖医学中心, 成都 610072
收稿日期: 2022-01-29    接受日期: 2022-07-01
基金项目: 四川省科技厅重点研发项目（2019YTS0195）.
作者简介: 姚俊成，硕士，主治医师. E-mail: 1090654821@qq.com.
通信作者(Corresponding author): 窦科, Tel: 028-87394466, E-mail: doukk@sina.cn.
摘要: 目的 观察淫羊藿苷对血管性勃起功能障碍（ED）大鼠的治疗效果，并初步探究其作用机制。方法 采用双侧髂内动脉结扎的方式构建血管性ED大鼠模型，将其随机分为5组，每组10只：模型组（每天1 mL生理盐水灌胃），他达拉非组（按每天0.8 mg/kg的剂量给予他达拉非溶液灌胃），淫羊藿苷低、中、高剂量组（分别按每天20、40、80 mg/kg的剂量给予淫羊藿苷混悬液灌胃）。假手术组（10只）给予每天1 mL生理盐水灌胃。造模4周后，刺激大鼠阴茎海绵体神经，测量最大阴茎海绵体内压（ICPmax），评估大鼠的勃起功能。连续灌胃30 d后取大鼠阴茎海绵体标本，用ELISA法检测各组大鼠阴茎海绵体中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、鞘氨醇-1-磷酸（S1P）和鞘氨醇-1-磷酸受体1（S1PR1）的表达水平；采用Masson染色测定大鼠阴茎海绵体组织纤维化情况，计算所采集图像的积分光密度（IOD）。对各组大鼠ICPmax和阴茎海绵体中α-SMA、S1P、S1PR1水平进行线性回归分析。结果 他达拉非组大鼠的ICPmax高于淫羊藿苷低剂量组，低于淫羊藿苷中、高剂量组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体的Masson染色IOD低于淫羊藿苷低、中剂量组，高于淫羊藿苷高剂量组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体中α-SMA的表达水平低于淫羊藿苷高剂量组，高于淫羊藿苷低、中剂量组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体中S1P的表达水平低于淫羊藿苷中、高剂量组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体中S1PR1表达水平低于淫羊藿苷低、中、高剂量组（P均＜0.05）。线性回归分析结果显示，α-SMA、S1P、S1PR1水平和ICPmax之间存在线性关系（P均＜0.05）。结论 淫羊藿苷可显著改善血管性ED大鼠的勃起功能，其可能通过调节S1P、S1PR1水平促进血管内皮的新生和稳定，达到改善勃起功能的目的。
关键词: 淫羊藿苷    血管性勃起功能障碍    鞘氨醇-1-磷酸    鞘氨醇-1-磷酸受体1    
Effect and mechanism of icariin on vascular erectile dysfunction in rats
YAO Juncheng, LIU Siqiao, YAN Tian, WANG Lei, LI Yutao, YANG Qi, DOU Ke     
Department of Assisted Reproductive Medicine Center, Sichuan Provincial People's Hospital, Sichuan Academy of Medical Science, Chengdu 610072, Sichuan, China
Supported by Key Research and Development Project of Science & Technology Department of Sichuan Province (2019YTS0195).
Abstract: Objective To observe the effect of icariin on vascular erectile dysfunction (ED) in rats and explore its mechanism. Methods The vascular ED rat model was established by ligation of bilateral internal iliac arteries. Then, they were randomly divided into 5 groups (n＝10): model group (intragastric administration of 1 mL/d normal saline), tadalafil group (intragastric administration of tadalafil solution at a dose of 0.8 mg/kg per day), and low-, middle-, and high-dose icariin groups (intragastric administration of icariin suspension at doses of 20, 40, and 80 mg/kg per day, respectively). The sham operation group (n＝10) was given 1 mL/d normal saline intragastrically. After 4 weeks of modeling, the maximum intracavernous pressure (ICPmax) was measured after stimulating the corpus cavernosum nerve of rats to evaluate the erectile function. After continuous intragastric administration for 30 d, the corpus cavernosum of rats was taken, and the levels of α-smooth muscle actin (α-SMA), sphingosine-1-phosphate (S1P), and sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) in the corpus cavernosum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The tissue fibrosis of corpus cavernosum was measured by Masson staining, and the integral optical density (IOD) of the collected images was calculated. The relationship between ICPmax and the levels of α-SMA, S1P, and S1PR1 in corpus cavernosum in each group were analyzed by linear regression. Results The ICPmax in the tadalafil group was significantly higher than that in the low-dose icariin group, but significantly lower than that in the middle- and high-dose icariin groups (all P < 0.05). The IOD of corpus cavernosum in the tadalafil group was significantly lower than that in the low- and middle-dose groups of icariin, but significantly higher than that in the high-dose icariin group (all P < 0.05). The expression level of α-SMA in corpus cavernosum of rats in the tadalafil group was significantly lower than that in the high-dose icariin group, but significantly higher than that in the low- and middle-dose icariin groups (all P < 0.05). The expression level of S1P in corpus cavernosum in the tadalafil group was significantly lower than that in the middle- and high-dose icariin groups (both P < 0.05). The expression level of S1PR1 in corpus cavernosum in the tadalafil group was significantly lower than that in the low-, middle- and high-dose icariin groups (all P < 0.05). Linear regression analysis showed that there were linear regression relationships between α-SMA, S1P, S1PR1 levels and ICPmax (all P < 0.05). Conclusion Icariin can significantly improve the erectile function of vascular ED rats. It may improve the erectile function by regulating the levels of S1P and S1PR1 to promote the neogenesis and stability of vascular endothelium.
Key words: icariin    vascular erectile dysfunction    sphingosine-1-phosphate    sphingosine-1-phosphate receptor 1    

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是男性反复或连续出现不能使阴茎充分勃起或持续勃起，无法获得满意性交的疾病[1-2]。ED病因较为复杂，涉及内分泌激素水平、心血管系统健康状况、心理状态等多方面因素[3-5]。在ED类型中，血管性ED占比最大，约占50%[6-7]。

淫羊藿在中国传统医学记载中有提高男性性功能和生殖能力的作用，其主要活性成分为淫羊藿苷[8-10]。长期口服淫羊藿苷可以改善血管及神经损伤性等ED大鼠阴茎海绵体平滑肌中神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）的基因和蛋白表达，对ED病理变化有修复作用，从而改善勃起功能[11]。在血管性ED的发生、发展中，血管内皮功能的稳定十分重要，多种因素在维持血管内皮功能的稳定中发挥重要作用[12-13]。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是维持血管内皮功能稳定的分子之一，研究表明在内环境稳态或其他应激条件下，血管腔中的S1P与鞘氨醇-1-磷酸受体1（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1）的结合是保证血管完整性的重要条件[14-15]。本研究观察了淫羊藿苷对血管性ED大鼠的治疗效果，并通过检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、S1P和S1PR1的表达水平初步探究淫羊藿苷对血管性ED大鼠的可能作用机制。

1 材料和方法 1.1 实验动物

8周龄健康雄性SD大鼠60只，体重200~250 g，购于成都达硕实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK（川）2019-0031]。实验动物由四川省人民医院动物研究所专职人员饲养，喂养和生活环境相同，饲养室温度保持在20~25℃，相对湿度为50%~65%，采用光照定时装置提供适当的昼夜光变化周期（12 h光照、12 h黑暗或14 h光照、10 h黑暗）。本研究的动物实验方法符合医学伦理学要求，经四川省人民医院动物伦理委员会审批（S2019-040-03）。

1.2 主要仪器与试剂

RM-6240E多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂），淫羊藿苷（货号：SI8010，纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司），他达拉非片（批号：H20170284，美国礼来制药公司），大鼠S1P ELISA检测试剂盒、大鼠S1PR1 ELISA检测试剂盒、大鼠α-SMA ELISA检测试剂盒（货号：ZC-35940、ZC-54753、ZC-36249，上海茁彩生物科技有限公司），改良Masson三色染色液（货号：BM210430，合肥博美生物科技有限责任公司）。Pannoramic 250 Flash Ⅲ型显微镜玻片扫描仪（匈牙利3DHISTECH公司）。

1.3 血管性ED大鼠模型的建立和假手术组大鼠的处理

大鼠经正常SPF级饲料和饮用水喂养并适应1周后，采用双侧髂内动脉结扎的方法建立血管性ED大鼠模型[16-17]。已完成双侧髂内动脉结扎的大鼠分笼饲喂，每笼1只，以利于伤口愈合。假手术组将大鼠固定在手术台上，做中下腹部正中切口，打开腹腔后，寻找并暴露双侧髂内动脉，不做结扎，然后复位腹腔组织内脏器，依次缝合腹膜、肌肉、皮下脂肪和皮肤。

1.4 实验分组及处理

血管性ED模型大鼠共50只，平均分成5组：模型组、阳性对照组及淫羊藿苷低、中、高剂量组，每组10只。阳性对照组大鼠按照每天0.8 mg/kg的剂量给予他达拉非溶液灌胃，淫羊藿苷低、中、高剂量组分别按照每天20、40、80 mg/kg的剂量给予淫羊藿苷混悬液灌胃，模型组和假手术组（10只）大鼠不进行药物干预，只给予每天1 mL生理盐水灌胃。连续灌胃30 d后取大鼠阴茎海绵体标本，置于冻存管中－80 ℃保存。

1.5 大鼠阴茎最大海绵体内压（maximal intracavernous pressure，ICPmax）测量

造膜4周后，通过刺激大鼠的阴茎海绵体神经诱发阴茎勃起，测量其ICPmax，评估大鼠的勃起功能[18]。具体测量方法：首先将压力转换器与RM-6240E多通道生理信号采集处理系统连接，压力转换器泵头内注入肝素盐水约20 mL。将压力转换器泵头上的26 G注射器针头斜行20°角刺入大鼠左侧阴茎海绵体内，通过RM-6240E多道生理信号采集处理系统观察阴茎海绵体内压（intracavernous pressure，ICP）逐渐稳定后，按照寻找盆腔星状神经节的方法找到海绵体神经，对海绵体神经进行电刺激，观察刺激后的ICPmax[19]。采用相同方法共刺激阴茎海绵体神经2次，2次之间间隔10 min。记录第2次刺激后的ICPmax作为该大鼠的阴茎ICPmax数据。

1.6 大鼠阴茎海绵体组织Masson染色

取大鼠部分阴茎海绵体组织，按病理学检测的标准作业程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后镜下观察。采用Masson染色法测定大鼠阴茎海绵体组织纤维化情况。每张切片先在4倍镜下观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取3个区域放大40倍采集图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析采集图像的积分光密度（integral optical density，IOD）。

1.7 大鼠阴茎海绵体中α-SMA、S1P、S1PR1表达水平的检测

采用ELISA试剂盒检测阴茎海绵体中α-SMA、S1P、S1PR1的表达水平。

1.8 统计学处理

应用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Tukey法。对模型组及淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠的ICPmax和阴茎海绵体中α-SMA、S1P、S1P1水平进行线性回归分析。检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 各组大鼠阴茎海绵体的ICPmax和Masson染色IOD比较

假手术组大鼠阴茎海绵体的ICPmax高于其他5组（P均＜0.05）；模型组大鼠的ICPmax低于其他5组（P均＜0.05）；他达拉非组大鼠的ICPmax高于淫羊藿苷低剂量组，但低于淫羊藿苷中、高剂量组（P均＜0.05）。假手术组大鼠阴茎海绵体的Masson染色IOD低于模型组、他达拉非组及淫羊藿苷低、中剂量组（P均＜0.05）；模型组大鼠的IOD高于其他5组（P均＜0.05）；他达拉非组大鼠的IOD低于淫羊藿苷低、中剂量组，但高于淫羊藿苷高剂量组（P均＜0.05）。见表 1。

表 1 各组大鼠阴茎海绵体的ICPmax和Masson染色IOD比较 

2.2 各组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、S1P、S1PR1的表达水平

假手术组大鼠阴茎海绵体中α-SMA的表达水平低于淫羊藿苷高剂量组（P＞0.05），但高于其他4组（P均＜0.05）。假手术组大鼠阴茎海绵体中S1P的表达水平高于模型组、他达拉非组、淫羊藿苷低剂量组（P均＜0.05）。假手术组大鼠阴茎海绵体中S1PR1的表达水平高于其他5组（P均＜0.05）。模型组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、S1P的表达水平均低于其他5组（P均＜0.05）。模型组大鼠阴茎海绵体中S1PR1的表达水平低于除他达拉非组外的其余4组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体中α-SMA的表达水平低于淫羊藿苷高剂量组，但高于淫羊藿苷低、中剂量组和模型组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体中S1P的表达水平低于淫羊藿苷中、高剂量组（P均＜0.05）。他达拉非组大鼠阴茎海绵体中S1PR1的表达水平低于淫羊藿苷低、中、高剂量组（P均＜0.05）。见表 2。

表 2 各组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、S1P、S1PR1的表达水平 

2.3 模型组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠ICPmax与阴茎海绵体α-SMA、S1P、S1PR1水平之间的线性回归分析

线性回归分析结果显示，大鼠阴茎海绵体α-SMA水平与ICPmax之间（P=0.007 8，F=7.896，r2=0.172 0）、α-SMA水平与S1P水平之间（P＜0.000 1，F=27.65，r2=0.421 2）、α-SMA水平与S1PR1水平之间（P＜0.000 1，F=37.64，r2=0.497 6）、S1P水平与ICPmax之间（P=0.006 1，F=8.453，r2=0.182 0）、S1PR1水平与ICPmax之间（P=0.047 2，F=4.205，r2=0.099 6）均存在线性关系。

3 讨论

淫羊藿具有补肝益肾、强壮筋骨、祛除风湿的功效，是强阳起痿方剂中最常使用的中药材之一[20]。由淫羊藿制成的中成药被普遍应用于临床ED的治疗中，并取得良好的疗效。淫羊藿在人体内的主要活性成分是淫羊藿苷，目前认为淫羊藿苷治疗ED的机制主要集中在一氧化氮-环鸟苷酸-磷酸二酯酶5通路[21]，尚未发现其他可能的作用机制。本研究观察了淫羊藿苷对大鼠血管性ED的治疗作用，并初步探索其是否通过调节S1P、S1PR1水平促进血管内皮的新生和稳定，达到改善阴茎勃起功能的目的。

本研究通过结扎双侧髂内动脉构建血管性ED大鼠模型，通过测量ICPmax确定血管性ED模型是否造模成功。随机将大鼠分成不同组别，比较其组间勃起功能，进一步评价淫羊藿苷对勃起功能的改善情况，同时比较不同剂量淫羊藿苷与他达拉非改善勃起功能的效果差异。结果表明，中、高剂量淫羊藿苷能有效治疗大鼠血管性ED，且治疗效果优于他达拉非。本研究观察到双侧髂内动脉结扎能够造成大鼠阴茎海绵体的α-SMA水平显著降低，提示血管性ED模型对阴茎海绵体血管稳态造成了破坏，动脉灌注减少破坏了血管内皮功能。淫羊藿苷可显著提高大鼠阴茎海绵体的α-SMA水平，提示淫羊藿苷能够提高大鼠阴茎海绵体内血管内皮稳态，促进阴茎海绵体血管平滑肌成熟。他达拉非没有显著提高血管性ED大鼠阴茎海绵体中α-SMA的水平，提示他达拉非可能不能改善阴茎海绵体血管内环境。淫羊藿苷组大鼠阴茎海绵体的S1P水平明显增加，表明淫羊藿苷能够有效促进S1P表达。本研究同时对淫羊藿苷组大鼠阴茎海绵体的S1P、S1PR1、α-SMA水平与ICPmax进行线性回归分析，得出S1P、S1PR1水平与α-SMA水平之间存在线性关系，α-SMA、S1P、S1PR1水平与ICPmax存在线性关系，初步提示淫羊藿苷可能通过调节S1P、S1PR1水平发挥保护血管内皮并促进血管新生的作用，达到改善血管性ED的目的。但各指标间存在线性关系，并不能确证淫羊藿苷就是通过S1P/S1PR1通路来发挥血管内皮功能保护作用的，后续还需在体外细胞实验中逐一对通路中的每个环节加以验证。

本研究初步探索了不同剂量淫羊藿苷对血管性ED大鼠的治疗效果，应用于人体的剂量关系在动物实验成熟后还需进一步研究。本研究检测手段较为单一，后续还需用免疫组织化学染色、蛋白质印迹法及qPCR等方法对S1P及S1PR1的水平进行测定，通过多种方法得到更精确可靠的结论。

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