胃癌是亚洲人群中最常见的恶性肿瘤之一，其发生率一直居高不下。早期胃癌缺乏有效检测手段，淋巴结转移率非常高，就诊后确诊的胃癌患者淋巴结转移比例可达50%~75%^[1-2]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是进入人体外周血的肿瘤细胞，由于免疫系统的监视，大部分CTC可被清除，但未被清除的CTC如果到达远处器官则可形成转移灶，成为肿瘤转移的关键因素之一^[3-4]。CTC作为一种可检测的新型肿瘤标志物，具有早期诊断肿瘤、评估抗肿瘤药物疗效及预测肿瘤复发和转移等临床价值，可以应用于胃癌的早期诊断、治疗敏感性的预测、复发风险和预后的评估等方面^[5-10]。

上海市名老中医邱佳信提出“脾虚贯穿肿瘤始终，治瘤应从健脾着手”^[11]。上海中医药大学附属龙华医院在中医理论的指导下，根据邱老多年临床经验创建了胃肠安方，以胃肠安方为基础优化出清热解毒的四味中药形成小复方——四藤方。细胞和动物实验结果显示，四藤方能促进胃癌细胞凋亡，抑制小鼠皮下移植瘤生长^[12-13]；临床研究显示四藤方联合化学治疗可减轻胃癌术后患者化学治疗的不良反应，提高患者生存质量，延长无进展生存期^[14-16]。本研究拟观察四藤方对胃癌患者CTC的影响，探讨其解毒功效的现代细胞生物学机制。

选择2020年9月至2021年9月上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科收治的具有明确病理诊断且按照国际TNM分期确定为Ⅰ期、Ⅱ期的胃癌根治术后患者。纳入标准：（1）有明确病理诊断的胃癌患者；（2）TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期，胃癌根治术后，术后病理切缘均为阴性；（3）年龄≥18岁；（4）卡氏功能状态（Karnofsky performance status，KPS）评分≥60分，功能状态（performance status，PS）评分≤2分；（5）依从性良好，理解并自愿加入本研究。排除标准：（1）伴有严重的并发症，或肝、肾功能不全；（2）妊娠期或哺乳期患者；（3）有精神异常或其他病史及不能配合者。共纳入60例患者，按照随机数字表法分为四藤方组和对照组，每组30例。本研究获得上海中医药大学附属龙华医院伦理委员会审批（2019LCSY205）。所有纳入的患者均签署知情同意书。

四藤方组给予四藤方+中西医结合常规治疗。四藤方（红藤15 g、野葡萄藤15 g、藤梨根15 g、菝契15 g，由上海中医药大学附属龙华医院中药房代煎）每日分2次口服，并根据兼症加减：胃脘胀痛加枳壳、香橼皮、佛手，胸胁胀痛加川楝子、延胡索，便秘加枳实、瓜篓仁，纳差食滞加乌梅、炒谷麦芽，恶心、呕吐加旋复花、姜半夏、姜竹茹等。对照组给予中西医结合常规治疗。两组均连续干预6个月。

统一采用柠檬酸葡萄糖溶液抗凝的5 mL真空采血管（成都瑞琦科技实业股份有限公司）采集患者外周血，采血完毕后立即颠倒混匀8次。采血后将采血管置于室温（15~30 ℃）保存，24 h内进行检测。采用免疫磁珠阴性富集技术分离和富集CTC，用8、17号染色体着丝粒探针标记细胞，进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测。结果判定：计数涂片上的细胞8、17号染色体着丝粒杂交信号，去除断裂、重叠、边界不清、背景不明确、信号不明确的细胞，杂交信号＞2个判断为拷贝数增多，视为超二倍体细胞^[17]。由2位经培训的实验员按照上述标准采集阳性细胞图像并计数，有分歧时由第三人或更多协助者共同判定。

运用R 4.1.1软件进行数据分析和处理。计数资料以频数和百分数表示；计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；等级资料采用桑基图进行分析。检验水准（α）为0.05。

60例胃癌根治术后患者中，男30例、女30例，年龄18~86岁，病理类型为腺癌38例、腺癌+部分印戒细胞癌17例、印戒细胞癌5例，TNM分期Ⅰ期32例、Ⅱ期28例。60例患者中出现8、17号染色体拷贝数增多的共有49例，CTC检测阳性率为81.67%（49/60），其中对照组阳性率为90.00%（27/30），四藤方组阳性率为73.33%（22/30）。

对两组患者治疗前的CTC计数进行独立样本t检验，结果显示差异无统计学意义（t＝0.194，P＝0.847），见图 1A。治疗后，四藤方组CTC计数低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 1B。

图 1 四藤方对早期胃癌根治术后患者CTC计数的影响 A：治疗前；B：治疗后. **P＜0.01. n＝30. CTC：循环肿瘤细胞.

CTC计数最大者为12个/3.2 mL，最小者为0个/3.2 mL。按照CTC计数将其分为0、1~3、4~6、7~9、10~12个/3.2 mL 5个等级，将组别、TNM分期与CTC计数等级相对应，运用R 4.1.1软件绘制桑基图（图 2），结果显示Ⅰ/Ⅱ期胃癌根治术后患者的CTC计数分布无明显差异；对照组CTC计数主要分布在7~9、4~6、10~12个/3.2 mL，而四藤方组的CTC计数主要分布在1~3、4~6、0个/3.2 mL，提示四藤方可降低CTC数量。

图 2 不同TNM分期、不同分组早期胃癌根治术后患者CTC计数桑基图 CTC：循环肿瘤细胞.

胃癌是一种“正虚邪实”的病症，我院名老中医邱佳信认为在胃癌中“正虚”以脾虚为主，故脾虚贯穿于胃癌疾病发生发展的始末。运用胃肠安方加减临床治疗胃癌根治术后及复发转移患者效果显著^[18]。四藤方是胃肠安中的小复方，由红藤、野葡萄藤、藤梨根、菝葜4味清热解毒之品构成。红藤又名“大活血”“大血藤”等，具有解毒消痈、活血止痛、祛风除湿、杀虫等功效。野葡萄藤具有清热利湿、消肿解毒之功，善治痢疾、疮疡肿毒之症。藤梨根具有清热解毒、祛风除湿、利尿止血之效，常用于治疗风湿骨痛、黄疸等症。菝葜味甘、平温、无毒，可以起到排毒、祛瘀、消炎的作用。四藤方由上述4种清热解毒的中药组成，具有清热解毒、祛湿消肿、软坚化痰的功效，为治疗胃癌的基本方，已有多项临床研究证实，该方既能降低进展期胃癌患者根治术后的转移、复发，亦能提高患者生存率、改善生存质量、延长带瘤生存期，并且几乎没有不良反应^{[14-16, 18]}。因此，我们将该方作为抗癌药物研究的重要筛选对象。

中医治癌在重视“正虚”的同时，还应重视“癌毒”这一重要因素。华佗曾在《中藏经》中指出：“夫痈疮毒之所作也，皆五脏六腑蓄毒不流则生矣，非独荣卫壅塞而发者也”，提出肿瘤由内在“脏腑蓄毒”所生。我们认为此处提到的“毒蓄”可以理解为毒邪，古人对人体血液循环的认识尚较粗浅，而以脏腑作为邪毒深伏的严重程度描述，实际上和现代的血液循环系统密切相关。从癌病的发病病机来看，本虚标实是癌病的根本，“瘀滞、毒聚、痰凝”是肿瘤形成的主要病理因素，癌病是人体在正虚的基础上，由“瘀、毒、痰”等结聚而成。热毒壅阻于经络脏腑，久而久之，发为肿瘤；《医宗金鉴·外科心法要诀》将舌疳的病理归于心脾毒火所致。同时，阴毒之邪在癌的发病中同样有着重要作用，脏腑功能衰弱，气血津液停滞，阳气虚寒复遭受寒邪侵犯，日久则形成有形之癥积。

CTC来源于肿瘤细胞，具有高度的再生和分化性，能够促进肿瘤的转移。虽然传统观念认为大多数肿瘤转移发生于肿瘤恶化或进展时，但随着研究的逐步进展，人们发现肿瘤在早期就可能发生转移，远处转移甚至可能发生在原发肿瘤病灶产生之前^[19]。CTC来源于肿瘤，且具有转移性、侵袭性，与中医的“癌毒”具有内在一致的属性。因此，我们认为，CTC具有“癌毒”的特征。

近年来，精准医疗和4P医学（predictive，preventive，personalized，participatory；个性化、预防性、预见性和参与性）逐渐兴起，CTC作为液体活检的典型代表受到医学界关注。CTC在肿瘤的早期诊断和筛查、评估分期、监测远处转移及复发、验证治疗效果及确定药物敏感性等方面均有应用，有力地推动了肿瘤个体化治疗的发展。研究表明，CTC检出率与多种因素有关，比如瘤块小、无淋巴结转移、无脉管侵犯、无远处转移的胃癌患者外周血CTC检出率低于瘤体大、有淋巴结转移、有脉管侵犯、有远处转移的胃癌患者，这提示胃癌患者CTC检出率与胃癌组织病理学特征具有强相关性；此外，接受胃切除术的患者CTC计数与瘤体浸润程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、血管浸润和淋巴浸润程度显著相关，CTC阴性组患者整体生存率与CTC阳性组相比显著提高^[20]。

因此，本课题组开展基于CTC的中医药研究，一方面挖掘其代表的预后意义，另一方面探讨四藤方治疗胃癌、预防其复发转移的细胞生物学机制。本研究结果表明，四藤方可下调CTC的数量，这可能是四藤方治疗胃癌、防治其复发转移的细胞生物学基础。本研究样本量小，仅观察了四藤方对CTC的影响，存在一定的局限性。未来还应结合无进展生存期和总生存期，加大样本量展开深入研究，为临床精准使用中药提供可靠依据，促进中医药在胃癌精准治疗中的应用。