2022, Vol. 43
特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的炎症性皮肤病，其特征是反复出现湿疹样病变和剧烈瘙痒，该病可发生在所有年龄和种族的人群，对患者及其家庭造成了巨大的心理及经济负担[1]。WHO数据显示，全世界有至少2.3亿人患有AD，儿童AD患病率为15%~25%[2]。雷西莫特是咪唑喹啉类免疫应答调节剂，可促进γ干扰素和IL-12的产生、减少IL-4和IL-5的生成，从而促进辅助性T细胞（helper T cell，Th）1反应和抑制Th2反应，同时降低健康人、变应性鼻炎及AD人群的IgE水平[3]。因此，科研人员尝试将雷西莫特应用于变应性疾病，目前已有相关动物实验开展[4]。本研究通过对AD模型小鼠腹腔注射雷西莫特，观察其对AD的治疗效果，并探讨可能的作用机制。
1 材料和方法 1.1 主要试剂与设备卡泊三醇搽剂（丹麦利奥制药有限公司，批号H20150664）。小鼠IgE、IL-4、IL-13 ELISA检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）。酶标检测仪（美国Bio-Tek公司），荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。
1.2 实验动物6~8周龄雌性BALB/c小鼠（SPF级）30只，体重18~20 g，购自北京维通利华实验动物有限公司[实验动物生产许可证号为SCXK（京）2018-0013]，饲养于海军军医大学（第二军医大学）第一附属医院动物实验中心[实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2020-0033]。
1.3 动物分组及处理将30只小鼠随机分为空白组、模型组、治疗组，每组10只。模型组及治疗组小鼠耳部连续14 d涂抹卡泊三醇搽剂（每天2 nmol卡泊三醇）诱导AD模型，模型组同时予200 µL PBS每天腹腔注射、治疗组予50 nmol雷西莫特（溶于200 µL PBS）每天腹腔注射[4]；空白组小鼠不给予任何处理。
1.4 观察指标 1.4.1 耳部皮损情况实验第15天观察各组小鼠的耳部皮损红斑、肿胀及鳞屑情况，同时用游标卡尺测量小鼠耳厚度。
1.4.2 耳部组织病理学检查实验第15天，经眼眶取血后以颈椎脱臼法处死小鼠，沿耳根部剪下鼠耳。将取下的鼠耳纵向一分为二，一半放入组织固定液中固定并经石蜡包埋后切片，通过H-E染色观察真皮炎症细胞浸润情况，通过甲苯胺蓝染色观察肥大细胞分布情况；另一半放入－80 ℃冰箱备用。
1.4.3 ELISA检测血清IgE、IL-4、IL-13水平实验第15天，将采集的血液于室温静置2 h，4 ℃ 3 996×g离心15 min，取血清分管冻存于－80 ℃冰箱中备用。按照相关试剂盒说明书进行血清IgE、IL-4、IL-13检测。
1.4.4 qPCR检测耳部皮损组织中胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、γ干扰素mRNA表达取－80 ℃冻存的小鼠耳部皮损组织，在液氮中剪切及研磨，采用TRIzol法提取总RNA，使用Nanodrop 2000超微量分光光度计（美国ThermoFisher Scientific公司）检测RNA浓度及纯度。通过反转录合成cDNA第一链，以该链为模板、GAPDH为内参照进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。GAPDH上游引物序列为5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，下游引物序列为5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'；TSLP上游引物序列为5'-AGAGAAGCCCTCAATG-ACCAC-3'，下游引物序列为5'-TGAGGTTTGAT-TCAGGCAGATGT-3'；γ干扰素上游引物序列为5'-CTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG-3'，下游引物序列为5'-TGACCTCAAACTTGGCAA-TACTC-3'。所有引物均由上海擎熙生物科技有限公司合成。
1.5 统计学处理应用GraphPad Prism 8软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，任意两组间资料的比较采用独立样本t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 各组小鼠耳部皮损大体情况空白组小鼠耳部皮肤未见异常（图 1A）；模型组小鼠耳部皮肤明显肿胀发红、毛细血管扩张，其上附有细小的鳞屑（图 1B）；与模型组相比，治疗组小鼠耳部皮肤红肿、鳞屑明显缓解，有轻度毛细血管扩张（图 1C）。模型组小鼠耳厚度为（0.48±0.02）mm，与空白组[（0.19±0.01）mm]相比增厚（P＜0.01）；治疗组小鼠耳厚度[（0.35±0.02）mm]较模型组变薄（P＜0.01)。
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图 1 各组小鼠实验第15天时耳部皮损情况 Fig 1 Ear skin lesions of mice in each group on the 15th day of experiment A: Blank group; B: Model group (treament with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear daily for 14 d); C: Treatment group (treatment with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear and intraperitoneal injection of 50 nmol resiquimod daily for 14 d). |
2.2 各组小鼠耳部组织病理学变化
H-E染色可见空白组小鼠耳部组织表皮、真皮结构正常，真皮内散在少量组织细胞，未见明显炎症细胞浸润（图 2A）；模型组小鼠表皮角化过度、角化不全，棘层明显增厚，皮突延长，棘细胞间水肿，真皮全层见大量炎症细胞浸润，并可见毛细血管扩张充血（图 2B）；治疗组小鼠表皮角化、棘层增厚较模型组明显缓解，未见棘细胞间水肿，真皮内可见淋巴细胞及组织细胞，淋巴细胞分布数量减少（图 2C）。甲苯胺蓝染色可见空白组小鼠真皮内散在少量肥大细胞（图 3A），模型组真皮内肥大细胞明显增多（图 3B），治疗组小鼠真皮内肥大细胞较模型组明显减少（图 3C）。
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图 2 苏木精-伊红染色观察各组小鼠耳部组织病理学变化（400×） Fig 2 Histopathological changes of ears of mice in each group observed by hematoxylin-eosin staining (400×) A: Blank group; B: Model group (treament with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear daily for 14 d); C: Treatment group (treatment with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear and intraperitoneal injection of 50 nmol resiquimod daily for 14 d). |
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图 3 甲苯胺蓝染色观察各组小鼠耳部组织病理学变化（400×） Fig 3 Histopathological changes of the ears of mice in each group observed by toluidine blue staining (400×) A: Blank group; B: Model group (treament with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear daily for 14 d); C: Treatment group (treatment with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear and intraperitoneal injection of 50 nmol resiquimod daily for 14 d). |
2.3 各组小鼠血清IgE、IL-4、IL-13水平
ELISA检测结果（图 4）显示，与空白组相比，模型组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13水平均升高（P均＜0.01），说明小鼠AD模型构建成功。与模型组相比，治疗组小鼠血清IgE、IL-4、IL-13水平均下降，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。
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图 4 各组小鼠血清IgE、IL-4、IL-13水平检测结果 Fig 4 Levels of serum IgE, IL-4 and IL-13 of mice in each group Model group: The mice were treated with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear daily for 14 d; Treatment group: The mice treated with 2 nmol calcipotriol liniment on the ear and intraperitoneal injection of 50 nmol resiquimod daily for 14 d. *P < 0.05, **P < 0.01. n＝10, x±s. IgE: Immunoglobulin E; IL: Interleukin. |
2.4 各组小鼠耳部组织中TSLP、γ干扰素mRNA表达
qPCR检测结果显示，模型组小鼠耳部组织中TSLP mRNA表达量（0.97±0.24）较空白组（0.34±0.09）升高（P＜0.01），治疗组TSLP mRNA表达量（0.80±0.17）与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组小鼠耳部组织中γ干扰素mRNA表达量（0.81±0.48）与空白组（1.05±0.08）相比差异无统计学意义（P＞0.05），但治疗组γ干扰素mRNA表达量（1.20±0.14）较模型组升高（P＜0.05）。
3 讨论AD的病因复杂，包括遗传、免疫和环境等因素，其中皮肤屏障功能异常和免疫功能障碍被认为是AD发病机制的关键。免疫功能障碍相关的发病机制包括血清IgE水平升高、Th1/Th2免疫反应失衡、Th2细胞因子过表达、表达皮肤淋巴细胞相关抗原的T细胞增加、表皮炎症性树突状细胞（包括朗格汉斯细胞）中Fcε受体Ⅰ及TSLP表达增加等[5]。卡泊三醇能够诱导小鼠角质形成细胞过表达TSLP，导致AD样皮损；在卡泊三醇诱导的AD小鼠模型中可见表皮增生，真皮内嗜酸性粒细胞和肥大细胞等炎症细胞浸润，皮损处TSLP、IL-4、IL-5、IL-13、IL-31、IL-10、IL-8等Th2细胞因子表达增加，同时小鼠血清中IgE水平升高[6]。因此，卡泊三醇诱导的动物模型很好地再现了AD免疫功能障碍的特征。本实验即采用卡泊三醇搽剂诱导AD模型，观察雷西莫特对AD小鼠的治疗效果及可能的作用机制。
Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是一种模式识别受体，是固有免疫的重要组成部分，可对入侵的病原体产生防御性炎症反应[7]。研究表明，雷西莫特作为TLR7/8激动剂可诱导细胞因子如α干扰素、γ干扰素和IL-12表达，从而增加Th1免疫应答，同时抑制Th2细胞产生IL-4和IL-5[8]。本研究中，治疗组小鼠耳部皮损肿胀、红斑、鳞屑情况较模型组改善，耳部皮损组织中炎症细胞浸润程度减轻，肥大细胞数量减少，血清IL-4、IL-13水平下降，耳部皮损组织中γ干扰素表达增加。结果表明腹腔注射雷西莫特可以通过调节Th1/Th2免疫应答反应改善小鼠AD症状。
IgE在哮喘、变应性鼻炎、AD等变应性疾病的发病中起着至关重要的作用，Th2细胞因子有助于激活B淋巴细胞促进IgE产生，而IgE可促进肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒进而导致过敏反应，两者可协同放大皮肤炎症反应[9]。雷西莫特可直接作用于B淋巴细胞而抑制IgE的合成，也可通过促进γ干扰素和IL-12的分泌抑制IgE的产生[10]。本实验中，治疗组小鼠血清IgE水平低于模型组，提示腹腔注射雷西莫特可能通过抑制IgE分泌改善AD皮损情况。
TSLP作为一种细胞因子，能够促进B淋巴细胞和髓系树突状细胞的活化，参与人和小鼠AD及相关疾病的发生、发展。TSLP通过TNF受体超家族成员4配体促使树突状细胞产生CC趋化因子配体17及22，招募CD4+ Th2，还可以刺激肥大细胞和自然杀伤T细胞活化，从而增加Th2细胞因子的产生[11]。雷西莫特可下调TNF受体超家族成员4配体的表达并促进IL-10、IL-12的产生，消除TSLP相关树突状细胞参与的Th2免疫应答，有助于缓解或预防变应性炎症[12]。本实验中，治疗组小鼠皮损组织中TSLP mRNA表达量与模型组比较差异无统计学意义，提示腹腔注射雷西莫特可能不会直接影响TSLP表达，其机制可能与下调TNF受体超家族成员4配体表达有关。
综上所述，本实验结果显示腹腔注射雷西莫特可以改善AD小鼠的皮炎状况，作用机制可能与雷西莫特抑制Th2反应、减少IL-4和IL-13分泌，增强Th1反应、增加γ干扰素mRNA表达，同时抑制IgE的合成有关，但其发挥作用的具体通路及不良反应有待进一步研究。
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